半制备液相色谱

半制备液相色谱

1 液相色谱技术

液相色谱是一种分离和分析不同混合物的常见分析技术，由于它

可以快速和有效地分离有机物中的特定成分，因此得到了广泛的应用。液相色谱的原理是，当通过柱子（容器内的固定的二元组成），由流

体力学和表面化学作用，有机物将被混合物分隔成多个组分，由高压

活性剂吸附在柱子表面上，不同的成分根据其矩阵容量而分离出来，

沿着柱子的不同地方被分离成不同的梯度，从而获得有机物的分离和

分析。

2 半制备液相色谱

半制备液相色谱是在一步液相色谱研究的基础上，充分利用柱前

回收的研究方法。是指在一步液相色谱峰前，充分利用一步液相色谱

的分离机理，对柱前回收的混合物进行再细分离，通过细调恒流速度

和其它参数，大大提高了一步液相色谱分离效率并降低了色谱分析时间。

3 优点

1、能够有效改变和提高混合物的分离和色谱分析效率。

2、优化溶剂系，增大分离和分析的动力学和热力学梯度，以达到

最佳的分离效果。

3、降低体积，减少样品和溶剂的使用量，保护柱材料有效地减少污染，有利于环境保护。

4、适用于实验室的液相色谱技术体系，大大简化了分析路径和分析流程，节省了时间和人工。

4 应用

半制备液相色谱技术广泛应用于有机物分析，主要用于分离和分析混合物中复杂的有机化合物，特别是配基降解类药物研究，具有更多靶组件或反应产物分析的能力，可以帮助研究人员更精确快速地合成新药物，改进原料药生产过程，安全有效地改善供应渠道，降低制药成本。此外，还可以用于食品安全的检测，例如对维生素和污染物的检测，也可以应用于工业水中的污染物，如重金属、有机氯农药等检测。

液相色谱柱使用问题解析

液相色谱柱使用问题解析 液相色谱柱使用疑难问题解析 就液相色谱柱的安装，使用和维护知识，以及各种柱压、峰形和色谱柱寿命等问题前来提问，也欢迎液相色谱方面的高手前来交流切磋。 内容提纲： 一、液相色谱柱的安装、启用和维护中的重点注意事项 1、柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 2、溶剂的匹配转换 3、新柱使用前的平衡和老化 4、pH使用范围 5、色谱柱的保存 二、柱压问题 1、填料破碎和使用后，有填料粉末生成 2、颗粒物堵塞引起柱压上升和对策 1）预防措施 2）故障排除 3、化学污染物引起柱压上升和对策 1）预防措施 2）故障排除 三、峰形问题 1、峰后拖 2、峰前延 3、其他峰形问题 四、保留时间问题 1、保留时间的重现性 2、保留时间漂移 3、柱与柱之间的重现性 4、批与批之间的重现性 五、寿命问题 六、其他疑难的色谱技术问题 一.安装、启用和维护中重点注意事项 色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件，价格相对昂贵，请牢记它是高档仪器中的高档部件，给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动，尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏，但50%的可能损坏你也承受不起。另外不要让柱床变干，避免在严寒环境受冻 等。

1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 色谱柱是消耗品，不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不同方式（数字单位是英寸），如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长，不易拧紧而漏液；接头比柱头深度短，柱头内留有空隙而产生死体积，使谱带展宽和峰拖尾。 2. 溶剂的匹配转换 色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂，如果和流动相不匹配，使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时，如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高，直接将新柱接入使用，会导致缓冲盐在柱内结晶析出，最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷，如果要转换成HILIC柱模式使用，由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好，转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。 3. 新柱使用前的平衡和老化 厂家出厂检验时一般都已进行过平衡，但色谱柱到最终用户时间不一，用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序（包括进样），直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语，目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流路中的吸附饱和。对某些特定的待测物，如分子量大于1000的，因扩散速度慢，老化时间相应要长，可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。 4. pH使用范围 一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8，这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同，对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大一些，如月旭公司的Ultimate XB-C18色谱柱，选用的是高品质硅胶，加上高密度键合和双封尾，使pH耐受范围最大提高到10。磷酸盐缓冲盐渗透力强，有加快硅胶溶解的副作用，它的存在会降低pH使用范围。有机杂化硅胶以及硅胶表面涂覆杂化层的硅胶填料，有机质的存在使pH使用范围能到12以上，月旭公司的Xtimate系列产品即属此类。 5. 色谱柱保存 短期保存(隔夜或隔周末)用所用的流动相（不含缓冲盐）保存为佳，以尽量减少下次使用的平衡时间。一般只建议在长期保存反相柱的时候用纯甲醇或乙腈，一方面纯有机相保存有最大限度减少键合相水解的作用，但纯甲醇（乙腈）又会将已水解而暂时吸附在柱内的键合相洗脱出去，使固定相流失进程加快，寿命缩短。纯有机相保存还有易挥发使柱床变干的缺点，使用80%左右有机相保存也属好的选择，且足以避免长菌。强烈建议在柱身上贴标签标明保存溶剂。

高效液相色谱习题和答案解析

高效液相色谱法习题 一、思考题 1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ 13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？ 16．以液相色谱进行制备有什么优点？ 17．在毛细管中实现电泳分离有什么优点？ 18．试述CZE的基本原理 19．试述CGE的基本原理 20．试述MECC的基本原理 二、选择题 1．液相色谱适宜的分析对象是（）。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。 A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相钻度较小 D 柱温低 3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL －1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。 A mA/m B B mB/mA C CB/CA D CA/CB。 4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。 A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的？ A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6．在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是（）。 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。 A ODS柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 10．在高效液相色谱中，采用254 nm紫外控制器，下述溶剂的使用极限为（）。 A 甲醇210 nm B 乙酸乙醋260 nm C 丙酮330 nm 11吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（）。 A 液一液色谱法 B 液一固色谱法 C 键合相色谱法 D 离子交换法 12．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为（）。

安捷伦及液相色谱仪的基本知识

安捷伦及液相色谱仪的 基本知识 集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]

安捷伦1100液相色谱仪各项性能指标 悬赏分：5|解决时间：2010-10-16 22:13|提问者： 最佳答案 朋友，直接致电agilent的800-820-3278免费电话就可以得到Agilent的满意答复了 系列Agilent 1100泵系统 ● 电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统，精度高、流速范围广柱流速范围：1-20ul/min;10-100ul/min（可选件） -2.5mmin(EFC关闭状态) ● 高压制备泵系统，单元或双元高压制备泵 流速范围:min ● 分析型泵系统 流速范围： 单元泵：min 二元泵：min 四元泵：min 品种齐全的Agilent 1100系列进样系统 ● 标准手动进样器（分析型或制备型） ● 标准自动进样器 样品瓶容量：可达100个(2mlx100) 进样量：可选件 ● 微盘式自动进样器 样品瓶容量：2x96(孔板)，2x386(孔板)或100x2ml 进样量：(标准件) 可选件 ● 微量标准自动进样器/微盘式自动进样器 进样量：（标准）;（可选） ● 恒温标准自动进样器/微盘式自动进样器 温度范围：4-40℃可设定步进1℃ ● 220型微孔板式自动进样器－组合化学样品管理系统 样品瓶容量：各种规格试管多达12个微孔板（96孔板,384孔板） 进样量：; Agilent 1100系列检测器 ● 可变波长扫描紫外检测器（VWD) 波长范围：190600nm ● 多波长检测器(MWD) 波长范围：190950nm（双灯源）

HPLC在植物有效成分检测中的应用

HPLC在植物有效成分检测中的应用 【实验目的】 1、了解高效液相色谱仪的基本原理； 2、掌握利用高效液相色谱仪对样品组分的分离鉴定； 3、熟练操作软件，对获得的数据进行分析处理。 【实验仪器、试剂与材料】 ①实验仪器：LabAlliance液相色谱仪，超声波清洗器，； ②试剂、材料：乙腈（分析纯），超纯水，姜黄素。 ③色谱条件；色谱柱：Kromasil C18 5um 100A0 250*4.6mm；流动相：乙腈︰水=45︰55，加10.6％的冰乙酸；流速：1mL/min；检测器：紫外420nm；柱温：35℃；进样量：20μL 【实验原理】 Ⅰ色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法：使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。 2．液液色谱法：使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 3．离子交换色谱法：固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

高效液相色谱

第二章高效液相色谱法 高效液相色谱法特点 1、高压，150×105-350×105Pa 2、高速 3、高效，3万塔板/m 4、高灵敏度 高效液相色谱与气相色谱比较 ●分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质 只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 ●流动相：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用， 对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 ●操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 二、影响分离的因素 基本概念及理论基础与气相色谱一致，主要区别为流动相不同，液相色谱流动相为液体，气相色谱流动相为气体 H = A + B/u + Cu 对于分子扩散项，当流动相线速度大于0.5cm/s时可忽略不计 三、HPLC主要类型 1、液-液分配色谱法：早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。 2、液-固色谱：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。 3.离子色谱：水溶液中阴离子分析的最佳方法，固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 4.空间排阻色谱：以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶； 液-液分配色谱法 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体,它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 分离原理： 液-液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。 在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相尽

液相色谱使用中样品预处理注意的几个环节

液相色谱使用中样品预处理注意的几个环节 高效液相色谱具有分离效率高、分析速度快和应用范围广等特点,特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分离分析。目前高效液相色谱已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离技术,是分析化学家和生物化学家手中用于解决他们面临的各种实际分析和分离课题必不可少的工具之一。虽然在检测分析中使用了昂贵的、性能优越的高档精密仪器,但是由于在样品的前处理,标准溶液的制备,样品液的测定,分析中的污染,仪器常见故障等等问题上的不注意,而引起大的系统误差,使整个测定分析失败。现就液相色谱分析的应用中样品预处理注意的几个环节,作简要分析,以达到更好的检测效果。 1 样品预处理方法 样品预处理应包括进样前的一切操作。除了称重、溶解、稀释等步骤外,样品需要: ①过滤; ②萃取; ③衍生化(柱前衍生) ; ④液相色谱(低压柱层析) 。这些操作可以是手工进行或实行自动化操作。样品预处理的目的是除去干扰物、增加检测器灵敏度(富集) 、保护色谱柱等。样品预处理同时也是为了避免色谱分离故障,其中样品萃取是关键的一步,要从大量的干扰物中萃取出微量组分难度极大。 有些样品经预处理后还不能作进样分析,需进行衍生化处理,使一些无紫外吸收或无荧光的组分,经过衍生化后能用紫外和荧光检测器检测,这样既提高了灵敏度,又改善了分离度(质量变化) 。样品预处理的同时也会带来一些问题,如样品损失、样品被污染、衍生化反映不完全或多种反应物生成等。衍生反应常会影响试验的精确度,或者在整个样品预处理过程中带来误差。 用于液相色谱分析的样品溶液必须均匀而无颗粒,有颗粒会损坏进样器并阻塞柱头。处理好的样品在准备上柱前应对准光线摇动,检查样品溶液中有无颗粒。只要看到颗粒、混浊或乳化,就应过滤一下,过滤膜要能截留住015μm 以上的颗粒,样品过滤的过程中可能引起:样品被污染,因过滤吸附降低样品组分的含量,样品溶剂挥发引起误差。萃取的目的是从共溶的样品介质中分离出被分析的组分,或者减少损坏柱的物质(如蛋白质等)和干扰物。一般采用有机溶剂萃取,要求萃取用的溶剂毒性低、挥发性好、杂质少、对待测样品有良好的溶解度且又与水不相混溶。常用的有乙醚、醋酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯或者两种以上的混合溶剂。萃取后一般可直接进样,有时需要浓缩或吹干浓缩,再用定体积的液体或流动相溶解进样。这样增加了样品浓度,提高了灵敏度,同时避免了溶剂峰对样品峰的干扰。在萃取是要考虑样品分子的溶解能力。除了脂溶性和水溶性组分外,还有用脂溶性的组分制成水溶性的盐。萃取方法如下: 1.1 水溶性样品 (1) 酸性组分及生成的盐萃取方法:有机溶剂萃取杂质后调成酸性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂解后进样。 (2) 碱性组分及生成的盐萃取方法:有机溶剂萃取杂质后调成碱性,再加有机溶剂萃取或进样,或在N2 流下吹干,用适当的溶剂溶解后进样。 (3) 中性组分萃取方法:有机溶剂萃取杂质后,直接用反相色谱法分析。

sEC注意事项

保存溶剂：0.1M PBS（含0.1M Na2SO4和0.05%NaN3）pH6.7 最大流速：1.2mL/min 标准流速：0.5-1.0mL/min 最大柱压：2MPa（290Psi） pH范围：2.5-7.5 盐浓度：<0.5M 有机物浓度：0-100%水溶性有机溶剂，低流速下浅梯度改变溶剂 温度：10-30℃。在10℃以下操作时降低流速 清洗溶剂：1、低pH的高盐溶液，如pH2.7浓度0.5M的Na2SO4溶液 2、低浓度的甲醇或乙腈水溶液 3、尿素或者胍的缓冲液 用1来去除基本蛋白，用2来去除疏水蛋白，助溶剂可以使吸附的蛋白质被溶解， 比如通过氢键作用 储存：储存在含0.05%NaN3或20%乙醇的流动相中（第二天不用）过夜的话可以用流动相低流速冲过夜，不能让空气进入柱子 色谱柱保护：预柱的使用对于色谱柱的保护很有效果，一般来说，每注射30-40次样品之后都应当换一个预柱 注意事项 安装说明 ＊流向＊ 安装使用时注意色谱柱上标明的流向箭头，安装反了会降低色谱柱柱效。 ＊去处气泡＊ 从仪器上安装和拆卸色谱柱时一定要注意不要让气泡进入，安装时要去除管路中的气泡。＊安装＊ 当进样端螺母拧下，有溶剂从接口溢出，可将色谱柱小心的与仪器连接，这样做可以保证没有气泡进入柱子。如果没有党课从接处流出，将柱子反接，用低于0.5ml/min的低流速走柱，赶走气体。确定当脱气的溶剂从色谱柱进样口流出后，按流向箭头所示接柱。 ＊正确使用＊ 柱子安装完成后，进行工作时要注意避免高压力和大流速，同时压力的快速变化也要避免。保存说明 ＊日常使用＊ 如果柱子每天都使用，不需要将它从仪器上取下，流动相可在柱子中保留过夜。 ＊短期保存＊ 将色谱柱从仪器上取下，封紧保护螺帽。保存4-30温度度，不得低于4度。 ＊长期保存＊ 用水溶液或含0.05%的叠氮化钠缓冲液保存。保存温度4-30度，不得低于4度。不能受阳光直射。 溶剂 ＊替换溶剂＊ 色谱柱中原厂保存的溶剂是0.1M的磷酸缓冲液含0.05%的叠氮化钠和0.1M的硫酸钠。若流动相要改变，可用低于0.5ml/min的流速走柱。若要用有机溶剂替换，先用蒸馏水过渡，再用有机溶剂走柱，注意浓度梯度，有机溶剂浓度的快速变化会使柱效降低。

液相色谱仪系统组成及常见问题详解

液相色谱仪系统组成及常见问题详解 一、液相色谱系统组成 系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。 1、进样系统 一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。 2、输液系统 该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l.47～4.4X10Pa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 3、分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm （需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由"优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔径可达1000）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60°C，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。 二、液相色谱仪常见故障处理 1、气泡溢出 流动相内有气泡,关闭泵,打开泄压阀,打开purg键,清洗脱气,气泡不断从过滤器冒出,进入流动相,无论打开purge键几次,都无法清除不断产生的气泡。原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作

制备型液相色谱常用分类

制备型液相色谱常用分类 制备型加压液相色谱，按照色谱柱和样品量的大小，分为： （1）低压液相色谱；（2）中压液相色谱；（3）高压液相色谱；（4）快速色谱。 低压、中压与高压液相色谱的压力范围之间会存在一定交叠，没有统一、明确的标准。 1.快速色谱 柱压通常为2bar（或30psi）左右，对于那些容易分离的简单混合物，由于快速色谱具有操作简便、经济等优点，常常是实验室的。但快速色谱不同于一般的层析分离，这种分离没有压力，而快速分离通常使用瓶装氮气加压，使流动相具有一定的流速，从而缩短了分离时间。 快速色谱使用的柱子一般是玻璃柱，柱直径为3～10cm．长度为7～15cm。快速色谱中使用广泛的固定相为硅胶。采用的粒径通常为：25～40μm，40～63μm或63～200μm的球形固定相。其它如键合相、氧化铝、聚酰胺吸附剂也常用作快速色谱的固定相使用。 2.低压色谱（LPLC） 柱压一般低于5bar（或75psi）。 低压色谱一般是由蠕动泵、进样阀和检测器组成，可以连续化，实现自动的梯度淋洗和馏分收集等操作。色谱柱管一般是玻璃或聚合物材料的，长度一般为240-440mm，内径为10-40mm。 对于大多数在紫外区有吸收的物质，光学检测器很常用。填料一般使用软质的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、合成高聚物或离子交换剂，粒径一般为40-60μm。 3.中压液相色谱（MPLC） 柱压在5-20bar（或75-300psi）之间，广泛用于实验室和工业规模的生物制品(如动物脏器提取液、浓缩液、体液、植物提取液、生物技术发酵液等。往往需要经过滤膜作初级净化的处理，以提取或纯化所需的产品。 中压液相制备色谱的主要部件为输液泵、进样阀、检测器、馏分收集器等，比如瑞士公司的早期的中压液相制备色谱，其输液泵流速可达156mL/min，并配有阻尼器，以保证液流的稳定；进样器配有0.5-50mL的不同体积的定量管；检测器有紫外和

液相相关

一、正相色谱：固定相极性大于流动相极性 反相色谱：固定相极性小于流动相极性，洗脱顺序取决于溶质分子的疏水性，疏水性强的保留时间长！ 在正相色谱体系中组分的出峰次序为：极性弱的组分，在流动相中溶解度较大，因此k值小，先出峰。极性强的组分，在固定相中的溶解度较大，因此k值大，后出峰。 在反相色谱中组分的出峰次序为：极性弱的组分在固定相上的溶解度大，k值大，后出峰，相反极性强的组分在流动相中溶解度大，k值小，所以先出峰。 流动相的比例，是有根据的。主要看你流动相的组成成分，一般来说，如果要分离的成分出峰时间较快，那么流动相中有机相就相对要少！总之只要能使样品峰的分离度（大于1.5）、理论塔板数(根据实际情况而定)、峰拖尾因子(0.95~1.05之间)达到要求的比例就行。建议朋友有问题，可到分析测试百科网去提问，基本上问题都能得到解答，百度上搜下就有。 流动相用0.45μm微孔滤膜过滤后超声脱气15min，标准品是纯溶液的话不需要过滤，待测样品为生物样品是需要经过处理的（沉淀蛋白，萃取，高速离心），离心之后取上清液直接进样，不能过滤 HPLC 的流动相的选择要看你使用的色谱柱固定相的种类，如果用C18等非极性键合相的色谱柱，流动相需要选定极性的例如甲醇、乙腈、水等；如果选用的硅胶或者二醇基等极性键合相的色谱柱，则需要选择非极性的流动相，例如正己烷、正庚烷等等； 8 流动相为什么要预先脱气?常用的脱气方法有哪几种? 解流动相中溶解气体存在以下几个方面的害处，气泡进入检测器，引起光吸收成电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测;溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应;溶解气体还会引起某些样品的氧化降解.对分离和分析结果带来误差。因此，使用前必须进行脱气处理。常用的脱气法有以下几种：(1)加热脱气法;(2)抽吸脱气法;(3)吹氦脱气法;(4)超声波振荡脱气法。 9 按固定相孔径大小分类，液相色谱固定相有哪几类?各有什么特性及适用范围?

液相系统中常用的管线

液相系统中常用的管线 管线在液相色谱系统中担负着流体传输的重要功能。选择合适的管线，可以保证色谱系统的死体积降到最低，而系统压力又不会太高。选择合适材质的管线，还可以保证系统无泄漏的方便连接。选用什么材质的管线。 一、PEEK（聚醚醚酮）管 优势： 1.具有化学溶剂惰性、生物兼容性等特点，可替代不锈钢管用于常规液相分析中和离子色谱、生物色谱中。 2.和不锈钢不同，PEEK具有韧性，截取方便，能使用不锈钢和聚合物等接头。 3.PEEK管还可以耐高压(可达4000psi)和耐高温（100℃）。 4.PEEK管有很强的溶剂兼容性，大部分溶剂不会与聚合物发生反应。缺点： 二甲基亚砜、二氯甲烷及四氢呋喃能引起PEEK管轻微溶涨，长时间使用管线变脆破裂，另外浓硝酸和浓硫酸会导致PEEK降解。 二、不锈钢管 优势： 不锈钢管具有广泛的化学稳定性和耐高压（10000psi）的特点，因此是液相系统中使用最广泛的管线之一。但由于硬度较大，截取不方便，因此非常适合用在液相系统中不需要经常拆卸的部位。 缺点：

不方便截取，通常需要使用预切割管，以保证切口端平整。另外在离子色谱和生物色谱中不适合使用不锈钢管。 注：切割会造成管末端表面破坏并变粗糙，因此我们建议你使用预切割管，如果需要切割管至自定义长度，建议钝化管子，可以通过浸泡在30%硝酸中完成，然后用蒸馏水和甲醇冲洗管子。 三、TEFLON FEP（特氟隆管） TEFLON FEP（氟化乙丙烯）管具有最广的化学稳定性，价格却很低，但不耐高压，所以更适合普通、低压应用。与PTFE（聚四氟乙烯）相比，TeflonFEP管具有更低的气体渗透性和更好的透明性。Teflon FEP管大多数是透明的，可以观察流体的流动和管路中的气泡。因此非常适合用在流动相溶剂瓶道液相泵之间的使用。 缺点： 不能耐高压，因此不能用在泵和色谱柱之间的高压流体部分。 管线内径的选择 在使用中选择哪种内径最好？选择内径大的管线，会造成系统死体积增大，会造成理论塔板数降低和峰拖尾。选择内径太小的管线，会使系统压力增大。 为了选择最适合管内径，请参见下面每5英尺（1.5米）不同内径管以水作流动相时的压力降。这些理论数据是根据公式计算得出，压力单位为psi，括号中为bar作单位得到的相应值。

半制备型液相色谱法分离纯化茶叶鲜叶中7种儿茶素类化合物

半制备型液相色谱法分离纯化茶叶鲜叶中7种儿茶素类化合 物 龚智宏;陈思;高江涛;李梅红;汪厦霞;林军;俞晓敏 【摘要】建立了从茶叶鲜叶中分离纯化7种儿茶素类化合物(没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素3-O-(3-O-甲基)没食子酸酯(EGCG3"Me)和表儿茶素没食子酸酯(ECG))的半制备色谱法.铁观音鲜叶经甲醇超声浸提、浓缩、氯仿萃取后,向水相中加入碱式醋酸铅沉淀,得到茶多酚粗品.分别以甲醇-水、乙腈-水作为流动相,采用半制备色谱法纯化7种儿茶素类化合物,纯度均达到90%.此外,利用同样的方法分离纯化另外两种茶叶鲜叶中的7种儿茶素类化合物,得到相似的结果.该方法以溶剂提取、离子沉淀结合半制备色谱,适于简单、高效地同时分离制备多种儿茶素类化合物.%An effective and simple method was established to simultaneously purify seven tea catechins ( gallocatechin ( GC) , epigallocatechin ( EGC) , catechin ( C) , epigallocatechin-3-O-gallate ( EGCG ) , epicatechin ( EC ) , epigallocatechin-3-O-( 3-O-methyl )-gallate ( EGCG3"Me ) and epicatechin-3-O-gallate ( ECG ) ) from fresh tea leaves by semi-preparative high perform-ance liquid chromatography ( HPLC) . Fresh leaves of Tieguanyin tea were successively extrac-ted with methanol and chloroform. Then crude catechins were precipitated from the aqueous fraction of chloroform extraction by adding lead subacetate. Crude catechins were used for the isolation of the seven target catechin compounds by semi-preparative HPLC. Methanol-water and acetonitrile-water were sequentially used as mobile phases. After two rounds of semi-

液相基本术语及操作

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液相色谱检测 1 仪器的基本常识及术语 仪器结构：液相色谱仪主要包括泵、进样器、色谱柱、检测器； 仪器分类：液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器； 按照分为离机制，吸附、分配、离子交换、亲和色谱，体积排阻色谱； 按照流动相与固定相的极性，分为正相色谱法和反相色谱法； 高效液相色谱法的应用范围：高效液相色谱法适用于高沸点不易挥发、受热不稳定易分解、分子量大的，不同极性的有机化合物，生物活性物质和多种天然产物，合成的和天然的高分子化合物等。 仪器检定：液相色谱仪检定周期为1年，在两次检定间期内进行一次期间核查，也可以根据情况增加核查次数； 维护保养：对于液相维护方式主要是周维护和日维护，其中周维护包括联机系统及中工作站软件维护、数据库整理备份、检测器自检、维护单向阀、溶剂砂芯滤头、进样器、电机泵检查维护、溶剂瓶清洗等；日维护包括环境温度、环境湿度、色谱柱温度、压力流速、进样口是否洁净、进液处的砂芯过滤头是否洁净、流动相交换时是否有沉淀； 色谱法的常用基本术语 基线：在色谱操作条件下,没有被测组分通过鉴定器时,记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线.

死时间,保留时间及校正保留时间:从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间,以td表示.从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称保留时间,以tr表示.保留时间与死时间之差称校正保留时间.以Vd表示.死体积,保留体积与校正保留体积:死时间与载气平均流速的乘积称为死体积,以Vd表示,载气平均流速以Fc表示,Vd=tdxFc.保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积,以Vr表示,Vr=trxFc 峰面积：流出曲线(色谱峰)与基线构成之面积称峰面积,用A表示. 拖尾因子：是反映峰对称性的指标，计算公式：拖尾因子 T＝2d1（其中为5%峰高处的峰宽，d1为峰顶点至峰前沿之间的距离）。 峰高与半峰宽:由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高,一般以h表示.色谱峰高一半处的宽为半峰宽,一般以 x1/2表示； 色谱检测的特性 （1）灵敏度高； （2）线性范围宽； （3）分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间的关系：（4）分离度与柱效的平方根成正比，选择因子一定时，增加柱效；（5）分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化：一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可增大选择因子； （6）增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。对于液相色谱，改变流动相的组成，可以有效控制k；