遗传性疾病检验技术—显带染色体检验

显带染色体检验

非显带染色体制备技术不能将每一条染色体的特征完全显示出来，只能根据各染色体的大致特征（大小、着丝粒位置）来识别。对于染色体结构畸变的诊断和研究受到很大限制。

染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。

自20世纪60年代末以来各种染色技术的应用，染色体显带技术得到了很大的发展。可以将染色体的个体特征显现出来，据此可准确识别23对不同类型的染色体，从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床染色体疾病的诊断提供了更有效的手段。

染色体经过一定程序处理并用特定染料染色后，在普通光学显微镜或荧光显微镜下可显现出不同深浅颜色的带纹或不同强度的荧光

节段叫做染色体带，各号染色体带的形态不同，称带型。染色体显带的分类通常是按能产生某种带型的方法来划分的。如用C、G、Q或T 显带技术产生的带分别称为C带、G带、Q带或T带。按此显带技术可分成两大类：一类是产生的带分布在整条染色体上，如Q、G和R 带；另一类只能使染色体上少数特定的带或结构着色，如C带、T带和N带等。

1971年巴黎会议确定的四种显带技术是：胰酶Giemsa法（G显带）、氮芥喹吖因荧光法（Q显带）、逆向Giemsa法（R显带）和着丝

粒区异染色质法（C显带），其中G显带是目前通常采用的显带技术之一，Q显带、R显带和C显带等技术也被用于染色体研究。四种常用显带技术各具优缺点，有不同的应用。

（一）染色体G显带检验技术

G显带是一种广泛应用的技术。它是用胰蛋白酶处理染色体标本，使染色体蛋白质变性，然后用Giemsa染色，染色体吸收染料，各条染色体上显出深色和浅色相间的带型——G带。G带在普通光学显微镜下即可观察分析。

G显带法包括四种处理技术，即醋酸-钠盐-Giemsa法、碱处理和磷酸缓冲液温育方法以及胰蛋白酶处理Giemsa染色法等，目前多采用胰蛋白酶处理Giemsa染色法。

1.检验原理

染色体经胰蛋白酶处理，染色体上出现了深浅不同的带纹，称为G带。这一显带技术应用最广，用一定浓度的胰酶处理染色体，使染色体蛋白变性，但阳性的G带是表明富含A～T DNA的区段，而阴性G带则富含G～C。出现明暗相间的带纹主要是染色体蛋白质的差异。

2.检验方法学

（1）器材及试剂

1）器材：

超净工作台、恒温培养箱、通风橱、冰箱、低温冰柜、恒温水浴

箱、台式显微镜（配绿色滤光片）、50ml立式染缸若干只、酒精灯、水平离心机、滴管及清洁液浸泡处理过的洁净玻片。

2）试剂：

0.5%胰蛋白酶原液：称取胰蛋白酶0.5g加无菌生理盐水100ml，置37℃水浴中，使其溶解，分装后冷冻保存。

D-Hank溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，KH2PO40.06g，Na2HPO4•12H2O 0.157g，葡萄糖1g，双蒸馏水1000ml，1%酚红2ml。将上述试剂溶解后，用5%NaHCO3调pH 7.0。4℃冰箱保存。

Giemsa染液：Giemsa染料1g，甘油66ml，甲醇66ml。将Giemsa 色素置研钵中，加甘油研磨，溶解后移入瓶中，置55～56℃水浴2

小时，不时搅动，使其溶解，冷却后加入甲醇，室温下放置2～3周。

（2）操作

1）常规制备的染色体标本放置37℃72小时或60℃16～24小时或78℃烤箱2小时，自然冷却。

2）取0.5%胰酶1ml放入染色缸中，加D-Hank液或生理盐水至50ml，搅匀，用5%NaHCO3调pH 7.0，放入37℃水浴锅中保温。

3）Giemsa液1ml放入染色缸，加pH 6.8磷酸盐缓冲液至50ml。搅匀，放入水浴锅中保温（37℃）。

4）染色体标本浸入37℃的胰蛋白酶消化液中，不断摇动，使标本均匀接触液体约1分钟取出，立即投入双蒸馏水中漂洗2次。

5）将染色体标本放入Giemsa染液中，染10分钟左右，自来水漂洗，室温自然干燥。

6）镜下观察可见深、浅、窄、宽相间的带纹。

3.方法学评价

G显带带型清晰，与Q显带的带纹一致。且效果比较稳定，标本可以长期保存。用普通光学显微镜就可观察。其中以胰蛋白酶处理法简单易行，适用于一般实验室。因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

4.质量保证

G显带技术步骤虽简单，但许多因素会影响到G显带质量。G显带的带纹是否清晰可辨，除标本本身质量、老化程度外，还取决于胰蛋白酶的浓度、pH、胰酶液温度和作用时间等因素。

（1）胰酶液温度偏高，反应的速度就快，反之反应速度慢，将配好的胰酶液放入水浴锅内中15分钟左右，使胰酶液的温度保持在（37±0.5）℃。

（2）胰酶处理时间一般掌握在1分钟左右，经染色后在镜下观察，如果染色体边缘发毛或染色体与染色体之间连成一片，说明胰酶作用时间太长。如果细胞的色泽为桃红色，高倍镜下观察，染色体的带纹清晰可辨，胰酶的作用时间适当。

（3）一定要把所用的染色缸洗净，并用双蒸馏水冲洗2次，已

除去溶液中的二价阳离子。否则，反应速度会变慢，影响效果。

（4）标本片龄：越长，对胰酶处理的抵抗性越大，片龄太长的标本，分带后往往不会出现带纹。

（5）烤片温度：太高，带纹不清楚。烤片时间和温度不够带纹发毛。78℃烤片3小时左右；60℃烤片24小时左右；37℃烤片72小时左右。只要掌握好胰酶浓度和温度及作用时间，一般均可分出清晰可辨的G显带。

5.临床意义

G显带法简便易行，标本可长期保存，不像Q带方法虽简便，但需要昂贵的荧光染料和荧光显微镜设备，而且荧光带不太稳定，无法长期保存标本，不能为一般实验室所采用。所以G显带已成为当今细胞遗传学领域内用以染色体分析的主要常规方法之一。

（二）R显带技术

R显带技术又称反带或逆转显带，因其产生的带型与在染色强度上与Q带和G带型相反。

1.检验原理

R显带的机制目前并不完全了解，在高温（80～90℃）的处理下诱发了染色体蛋白质的变化。Comings （1978）认为在高温下G带中的AT丰富区变性后容易与Giemsa染液结合，而在R带中恰好相反，AT丰富区不易与Giemsa染液结合，故显出浅染带区，电镜的观察进

一步表明了这些带和亚带区的差异主要在于电子密度的不同，R带所显示之深浅带纹区域正同G带之带纹区域相反，即G带深染区在R带为浅染区，反之亦然。由于这种技术所显示深浅带纹正好与G带相反，故称逆相G带（reverse G-band），又称R带。在G带染色体的两末端都不显示深染，而在R带中则被染上深色，因此R带有利测定染色体长度及末端区域结构的变化。目前所用的R显带方法是RBG法

（R-band by BrdU using Giemsa），即经BrdU处理后用Giemsa染色。

2.检验方法学

（1）器材和试剂

1）器材：

同G显带。

2）试剂：

D-Hank溶液及Giemsa染液同G显带。

欧氏液：A液：NaCl 6.80g、KCl 0.40g、NaH2PO4•2H2O 0.14g 溶于800ml双蒸水中；B液：CaCl2（无水）0.20g、MgCl2•6H2O 0.17g 溶解在200ml双蒸水中。工作液（pH6.5）：取A 液8份、B液2份混匀即可。

Hoechst 33258原液：Hoechst 33258 2mg溶于2ml双蒸水中；Hoechst 33258工作液：200ml的1/15mol/L磷酸缓冲液中加入0.75ml 的Hoechst 33258原液即成。

吖啶橙（acridine orange）染液：0.1g吖啶橙，溶解于100ml 1/15mol/的磷酸缓冲液（pH 6.5）中。

（2）操作

1）当外周血淋巴细胞培养至72小时，加入胸腺嘧啶核苷（大剂量可阻断细胞内DNA合成），最终浓度为0.3mg/ml（在每5ml培养物中加浓度为30mg/ml的胸腺嘧啶核苷，5号针头3滴）。

2）继续培养17小时，将细胞转移至尖底离心管中，用Hank’s 液洗细胞2次。

3）加入含有PHA的新鲜培养基，同时加入BrdU，最终浓度为10mg/ml（每5ml培养物加入1mg/ml的BrdU液，5号针头5滴）。置于黑暗条件下37℃下培养5小时。加入秋水仙素，最终浓度为0.07μg/ml。

4）在37℃中处理2小时后，按常规方法收获细胞，制片。

5）所制标本在Hoechst 33258工作液中染色20分钟或在吖啶橙工作液中染色5分钟。用磷酸缓冲液冲洗2次。

6）在恒温水浴箱内放一铝饭盒，内放铁丝架（或玻璃架），加磷酸缓冲液（45℃），溶液的高度以接近而不超过铁丝架为最好。在染色体制片上滴加较多磷酸缓冲液，盖一小张擦镜纸，将紫外灯（带罩）放在恒温水浴箱上，灯与标本垂直，照射15～20分钟，照射距离为2cm。

7）蒸馏水冲洗2次，在86℃的欧氏液中处理1～2分钟，蒸馏水洗2次。

8）Giemsa染色5～10分钟，镜检。

3.方法学评价

在R显带时，染色体末端为阳性染色，因此，特别适用于发现染色体的末端缺失。如染色体某一带异常但Q带为暗带，G显带为淡染带不易确定时，R带则呈深染带，可以相互比较诊断。

4.质量保证

（1）紫外灯照射时间与Earle液处理时间呈反比，如紫外灯照射时间长，则在Earle液中处理时间则短，紫外线照射时间越长，在欧氏液中处理时间应越短。

（2）R显带制片不需经过高温烘片，存放时间也不易过长。标本宜新鲜为好（隔夜标本亦可以）。

（3）染色体玻片不能用火烘干，只能让其自然干燥其效果较佳。

5.临床意义

染色体的R显带法是细胞遗传学研究中出现的一项重要显带技术，和Q显带、G显带及其他显带技术一样，能在染色体的纵向上显示出明暗相同的带纹，通过对染色体上显示的不同带纹，能够精确识别染色体及其片段的缺失、倒位等异常改变，可作为G带的互补带，有助于确定恶性血液病G带阴性区的染色体重排断裂点。此外，R带

对揭示涉及染色体末端的缺失和易位特别有价值。R带有两个鲜明的特点：与Q、G显带完全相反的带纹；除Y染色体浅染外，其他染色体末端均为深染带纹。

（三）C显带技术

用NaOH和Ba（OH）2处理标本后，再用Giemsa染色，可使着丝粒和次级缢痕的结构异染色质部分深染，如1号、9号、16号染色体的次级缢痕以及Y染色体长臂远端的2/3区段，所显示的带纹称C带。C显带常用氢氧化钡Ba（OH）2法。

1.检验原理

用碱处理标本上的染色体使DNA变性后，再在SSC溶液及60℃的条件下使其复性，在受控制的条件下经Giemsa染色可显示在染色体的特定部位深染。现在更为流行的看法认为氢氧化钡或其他碱性物质的处理是优先提取了非C带区的DNA，SSC的处理有助于带型的清晰。

2.检验方法学

（1）器材及试剂

1）器材：

同G显带。

2）试剂：

5%Ba（OH）2、0.2mol/L HCl、Giemsa染液；2×SSC配制：称取

NaCl 17.54g、枸橼酸钠8.82g，加双蒸馏水至1000ml。

（2）操作

1）将染色体标本放入0.2mol/L HCl中1小时，水洗。

2）浸入预热到50℃5%Ba（OH）2溶液中2～3分钟，取出后用双蒸馏水冲洗。

3）浸入预热到60℃的2×SSC溶液中90分钟，水洗3次。

4）5%Giemsa染液中染色10～15分钟，水洗，干燥，镜检。

5）各染色体的着丝粒，和近端着丝粒部位具有次缢痕的位置，如1号、9号、16号染色体上的次缢痕区以及Y染色体的长臂远端易着色。

3.方法学评价

C显带，在人类染色体中这一方法主要显示局部如着丝粒区以及和结构异染色质的区域，即1号、9号、16号染色体的次缢痕及Y染色体的长臂末端部分。因此，对显示上述染色体异常以及诊断、研究这些区域的多态性特别有用。

4.质量保证

染色体标本在Ba（OH）2溶液中处理，应把染色缸的盖子盖好，以免液面形成膜，当标本取出时，膜挂在标本表面，影响标本质量。

人染色体白片标本片龄1～5天为最适标本。5% Ba（OH）2

配制后放至4℃保存，用时吸取上清。配制2×SSC时，先取NaCl 1.75g溶于100ml双蒸水中，待完全溶解后加入0.88g枸橼酸钠。染色体标本从Ba（OH）2溶液取出时，要求动作迅速，切忌BaCO3薄膜形成敷贴在染色体标本上，否则影响显带效果。

5.临床意义

C带使每一号染色体的着丝粒区特异性地着色，尤其是1号、9号、16号和Y染色体的副缢痕区着色块更为显著。C显带技术对分析着丝粒区、副缢痕区和随体区的结构变化，是有帮助的。

（四）Q显带标本制备

1968年瑞典细胞化学家Caspersson等应用荧光染料氮芥喹吖因（quinacrine mustard，QM）处理染色体后，在荧光显微镜下可观察到染色体沿其长轴显示出一条条宽窄和亮度不同的横纹，即染色体的带。这一显带技术称Q显带，所显示的带纹称Q带。

1.检验原理

Q带形成的机制是荧光染料喹吖因能特异性地结合到染色体上富含A-T碱基对的节段中，在荧光显微镜中一定波长紫外光的激发下，富含A-T碱基对的染色体节段便会发出较强的荧光；而富含G-C碱基对的染色体节段则无荧光产生（暗带），这样，在染色体上便会呈现出明暗交替的横纹，即Q带。

2.检验方法学

（1）器材及试剂

1）器材：

荧光显微镜，其他同G显带。

2）试剂：

McIlvaine缓冲液配制：原液A（0.1mol/L枸橼酸溶液）：取枸橼酸（C6H8O7•H2O）21.0g溶于1000ml蒸馏水中；原液B（0.2mol/L 磷酸氢二钠）：取磷酸氢二钠（Na2HPO4•2 H2O）36.5g溶于1000ml

蒸馏水；工作液：取A液330ml，B 液70ml混合即得pH 7.0工作液。

荧光染料配制：①0.005%氮芥喹吖因（QM）荧光染液配制：氮芥喹吖因（QM）5mg加入pH 7.0McIlvaine缓冲液100ml，配制之后存入棕色瓶中，置于4℃冰箱中保存备用。②0.5%二盐酸喹吖因（QH）荧光染液配制：二盐酸喹吖因（QH）0.5g，蒸馏水100ml；用0.1mol/L 盐酸调pH至4.5置棕色瓶中放置一周后使用；或用枸橼酸缓冲液直接配制而不必再用盐酸调pH。

（2）操作

1）常规制备的染色体标本片浸入McIlvaine缓冲液中5分钟。

2）用0.005%氮芥喹吖因或二盐酸喹吖因染色15～20分钟。用McIlvaine缓冲液洗去多余染料。

3）将经荧光染料染色过的片子放置于McIlvaine缓冲液或蒸馏水中分色3次，每次5分钟。最后1次分色后滴上1～2滴McIlvaine

或蒸馏水。用干净盖玻片盖上（注意不要有气泡），然后用指甲油或液状石蜡封盖玻片周围，以防水分蒸发。

4）将制好的玻片放置于荧光显微镜下观察，并用显微照相装置拍下所需的中期染色体图像以便作核型分析。

5）在荧光显微镜下分析观察Q带标本，可见Q带与G带非常相似，区别仅在于着丝粒区和第1号、16号染色体的次缢痕，这些区段在Q带时一般没有荧光，而在G带时为阳性着色，在Y染色体长臂的远侧端一处可见到典型的强荧光。

3.方法学评价

Q显带是人类最先创立的染色体显带技术，它和以后出现的一系列显带技术大大地推动了细胞遗传学的发展。Q带方法虽简便，但需要昂贵的荧光染料和荧光显微镜设备，而且荧光带不太稳定，无法长期保存标本，不能为一般实验室所采用。

4.质量保证

（1）荧光染料染色之后，分色时间要掌握正确，这是关系到Q 带是否清楚的关键。如果荧光太弱可以小心取下盖玻片，再用荧光染料重新染色，再依次分色封片；如果荧光太强，带型不清楚，则去掉盖玻片，可再放置于缓冲液中分色1次（3分钟）。

（2）作Q显带的片子，片龄不能太长，一般在一周之内为宜。

（3）Q带荧光染色片经褪色之后仍可作G显带用。荧光褪色的

方法是将标本放于pH 6.0缓冲液中浸泡12～24小时即可。

（4）荧光显微镜根据光源可分直落式和透射式两种，一般以直落式为好，因为直落式光源来自目镜和物镜之间，而通过物镜落于标本上，对眼睛的损害较少，其光源能发挥最大作用，故在荧光显微照相时可得到较好的效果。

（5）QM是一种烷化剂，有毒，配制时须谨慎，称量应迅速，试剂每次打开后须充入氮气，防止QM分解。

5.临床意义

利用Q带技术可使人类的23对染色体显示出各自特异的带纹，其带纹数的多少、带的宽窄和带的亮度均不相同，可更准确地识别人类的23对染色体。

染色体G显带操作规程

染色体G显带操作规程 1.目的：规范细胞遗传（外周血）诊断的操作过程，以保证结果的准确、可靠。 2.应用范围：外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。 3.职责： 3.1文件编写：实验室技术员。 3.2文件审核：科室负责人。 3.3文件审批：实验室主任。 3.4执行：细胞遗传室的所有工作人员。 4.内容： 4.1实验原理： 4.1.1．淋巴细胞的体外培养 4.1.1.1．外周血（脐带血）中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。 4.1.1.2．离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期：DNA合成前期（G1期），约10～24h，为RNA和细胞质的合成；DNA合成期（S期）约为7h，在G1期的基础上，完成DNA的合成；DNA合成后期（G2期）约为4～6h，为后期RNA和细胞质的合成，活跃的RNA和微管蛋白等合成；细胞分裂期（M期）约为1.5h，又分为分裂前期、中期、后期和末期。 4.1.1.3．培养基分为天然培养基和人工培养基两种；实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基，主要由RPMI1640和牛血清混合而成。另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固，平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH，双抗（链霉素和青霉素）用于抑制细菌的生长等。 4.1.2．纺锤体的抑止 4.1.2.1．在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。因此，破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，不再粘附至细胞内任何结合力上，在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很容易铺展开来。细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管由微管蛋白组成，微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种，α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常呈二聚体形式存在。其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位，秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。但是这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂，因此它可使分裂的细胞停留在中期，获得大量分裂相，以供分析之用。

基因在染色体上定位的基本方法

基因在染色体上定位的基本方法 1.遗传连锁分析：遗传连锁分析是通过对家族中的基因型和表型进行检测和分析，确定基因与染色体的位置关系。这种方法通过比较不同的亲代和子代之间的遗传关系，可以推测基因位点在染色体上的相对位置。 2.染色体显带技术：染色体显带技术是将染色体进行染色处理后，通过显微镜观察染色体的特殊带状分布来确定基因或基因组的位置。常用的染色体显带技术有吉姆萨染色法和Q-带染色法等。 3.倒位和缺失：倒位和缺失是指染色体片段的倒转和丢失，这种染色体异常通常说明被倒转或丢失的区域内含有对其中一基因的局部作用。通过研究倒位和缺失的病人或动物模型，可以确定被破坏的基因在染色体上的位置。 4.分子标记和杂交技术：分子标记和杂交技术是基于DNA分子间的互补配对原理，通过标记和杂交技术可以在染色体上定位基因。常用的分子标记技术包括PCR、限制性片段长度多态性(RFLP)、微卫星标记和单核苷酸多态性(SNP)等。这些标记可以通过杂交技术与染色体上的特定区域发生互补配对，从而确定目标基因的位置。 5.整合遗传和物理图谱：整合遗传和物理图谱是一种将遗传信息与物理距离相连的方法。遗传图谱是根据遗传连锁分析得到的基因距离关系，而物理图谱则是根据染色体的物理特性和DNA序列的物理位置建立的。通过整合遗传和物理图谱，可以更准确地确定基因在染色体上的位置。 6.定位克隆技术：定位克隆技术主要利用染色体上已知的标记序列或已离体的基因进行探针筛选和杂交实验，进而确定目标基因的精确位置。常见的定位克隆技术包括克隆定位、转录映射和比较基因组定位等。

7.基因组测序：基因组测序技术的发展为基因在染色体上的定位提供了新的工具和方法。通过高通量测序技术，可以对染色体上的DNA序列进行全面的测定，从而获得准确的基因位置信息。 综上所述，基因在染色体上定位的基本方法包括遗传连锁分析、染色体显带技术、倒位和缺失、分子标记和杂交技术、整合遗传和物理图谱、定位克隆和基因组测序等。这些方法的发展和应用不仅促进了遗传学和基因组学的研究，也对人类遗传疾病的诊断和治疗提供了重要的理论和实践依据。

医院细胞遗传室N显带法作业指导书

医院细胞遗传室N显带法作业指导书 1目的 规范N显带的实验室操作流程，显示中期染色体上的核仁形成区，为细胞染色体核型分析可靠性提供质量保证。2实验方法 手工显带法 3实验原理 人类的近端着丝粒染色体(即13、14、15、21和22号染色体)的次缢痕处与核仁形成有关，故称核仁形成区（nucleolar-organizing region，NOR），它是中期染色体上的明显结构之一。应用DNA-RNA分子杂交技术,证明人类的18S和28S核糖体RNA(rRNA编码结构)的基因(rDNA)位于NOR。目前已有多种技术可以显示中期染色体上的核仁形成区。其中最简单而又准确的方法是银染法,即利用硝酸银将具有转录活性的核仁形成区(rRNA基因)特异性地染成黑色,人们将这种银染阳性的核仁形成区称为Ag-NOR,它们是具有转录活性的18SrRNA基因和28SrRNA基因所在的部位。由于具有转录活性的rRNA基因(rDNA)往往伴有丰富的酸性蛋白质,该类蛋白质含有巯基（-SH）和二硫键（-S-S-）,能使AgNO3中的Ag+还原成Ag颗粒,因此有转录活性的核仁形成区常被镀上银颗粒而呈现黑色,没有转录活性的NOR则不着色。故

其着色程度与细胞中rRNA基因的转录活性相一致。在同一物种，Ag-NOR的数目以及它们在染色体上的位置是相对恒定的，如果发生了改变就意味着rRNA基因的活性发生了变化，故此项技术是目前探讨rRNA基因功能的方法之一。 此外，人类近端着丝粒染色体的随体间易发生联合，这种联合可能是造成近端着丝粒染色体不分离、断裂和易位的原因。利用银染技术可在发生联合的染色体间清楚地看到有银染物质相连。因此，银染近端着丝粒染色体联合（Ag-stained acrocentric association ,Ag-AA）可以作为准确地判断人体细胞是否存在近端着丝粒染色体随体联合的客观标准（图7-4）。目前，也将Ag-AA看作反映rRNA基因活性大小的一个指标。所以银染技术已逐渐受到重视，并已开始广泛应用于肿瘤细胞遗传学、体细胞遗传学、进化遗传学、临床细胞遗传学及药物、化学因素等的遗传效应的研究上。 4 性能特征 近端着丝粒染色体（即13,14,15,21和22号染色体）的次缢痕处特异性的染成黑色。 5 仪器及耗材 光学显微镜、恒温水浴箱、移液枪、培养皿（干燥）、吸管、擦镜纸、小镊子、未染色的染色体标本片（片龄一周以内）。 6 试剂

李存玺：染色体检查10大常见问题

染色体检查10大常见问题 染色体检查是指检查与分析染色体的数目和形态是否异常，一般应用于某些疾病或肿瘤等的诊断研究工作中。在试管婴儿中，有些患者也需要进行染色体检查。在这里，家恩遗传实验室的李存玺博士为大家带来了患者朋友最关注的10个染色体检查相关问题，有没有您想要的答案，看看就知道！ 1、为什么要进行染色体检查？ 李存玺博士：染色体检测可以查出染色体片段易位、倒位、缺失、重复等染色体结构性异常，以及非整倍体等染色体数目异常。比如唐氏综合征，就是21号染色体比正常多了1条，因此也被称21号三体综合征。 先天性的染色体结构或数目异常，均可能导致反复流产、不孕不育或相应的遗传病代谢病，查清染色体的异常情况可以针对性制定应对方案。后天获得的克隆性染色体异常，则可能导致白血病等各类肿瘤，查清染色体的异常状况有助于针对性治疗及判断预后。 2、染色体检查可以查出哪些疾病？ 李存玺博士：染色体检查可以查先天性染色体异常引起的先天性疾病、遗传病、代谢病、不孕不育、反复流产等。极微小染色体异常及基因点突变则需要分子遗传学手段进行检测。 染色体检查也可以查后天获得的克隆性染色体异常引起的白血病、淋巴瘤、实体肿瘤等。 3、为什么国际上要求做染色体核型分析时要达到550条带以上？ 李存玺博士：染色体核型分析受到分辨率的限制。 染色体分带技术显示400条带时，每一条带对应约10 Mb长度的染色体片

段，即一千万个碱基对的DNA长度。染色体条带数提升到550，则可以把分辨率提高到5 Mb。条带数提升到700或850，则相应的分辨率可以进一步提高到2~3 Mb。分辨率越高，就越有机会捕捉到细微的结构异常，减少漏诊和误诊。 染色体核型分析比较快速、费用相对较低，且能提供全部的基因组信息和染色体动力学异常信息。通过提升分辨率，这项技术在临床上的应用价值已经大大提升了。 4、新生儿染色体检查时染色体显带为什么要达到850条带以上？ 李存玺博士：新生儿染色体检查，主要是为了及早发现先天性的染色体异常，以便早治疗处理。850条带以上的核型分析，可以排除3 Mb以上的染色体结构性异常，也就排除了绝大多数常见的新生儿染色体缺陷综合征，如5号染色体短臂末端缺失造成的猫叫综合征、15号染色体长臂微小缺失造成的天使综合征等等。 如果没有达到850条带，则前述例举的微小异常就可能被漏诊，不能及早发现病因，耽误治疗。850条带或者更高的条件下，染色体数目异常的情况自然更加不易被漏诊，如21号三体的唐氏综合征，只有1条X性染色体的特纳综合征和标记染色体等等。 5、既然多种全基因组检查手段已开始用于临床，为什么染色体检查不可被取代？ 李存玺博士：全基因组检查同样可以获得全局性的基因组信息，在分辨率方面更是具有染色体核型分析无可比拟的优势，其最高分辨率可达几个Kb，比之核型分析提升了近千倍。但是，全基因组检查目前还不能查出导致碱基数目无显著改变的异常（平衡异常），比如平衡易位、倒位、插入等等，而染色体核型分析则可以显示这些异常。所以，目前为止，染色体检查还是不可或缺的技术手段。 6、染色体检查前是否需要空腹？

染色体核型分析系列之三大技术介绍

染色体核型分析三大技术介绍 ·概念 是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间关系所不可缺少的重要手段。经行核型分析后，可以根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因。染色体核型分析技术，传统上是观察染色体形态。但随着新技术的发现与应用，染色体核型分析三大技术包括：GRQ带技术、荧光原位杂交技术、光谱核型分析技术。 ·三大技术介绍 一、GRQ带技术 人类染色体用Giemsa染料染色呈均质状,但是如果染色体经过变性和(或)酶消化等不同处理后,再染色可呈现一系列深浅交替的带纹,这些带纹图形称为染色体带型。显带技术就是通过特殊的染色方法使染色体的不同区域着色,使染色体在光镜下呈现出明暗相间的带纹。每个染色体都有特定的带纹,甚至每个染色体的长臂和短臂都有特异性。根据染色体的不同带型,可以更细致而可靠地识别染色体的个性。染色体特定的带型发生变化,则表示该染色体的结构发生了改变。一般染色体显带技术有G显带(最常用),Q显带和R显带等。 百奥赛图提供的小鼠染色体核型分析服务，就是利用Giemsa染色法，对染色体染色后进行显带分析，保证基因敲除小鼠在染色体水平阶段没有发生变异，从而确保基因敲除小鼠可以正常繁殖。

二、荧光原位杂交技术 荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA 纤维切片上,再用与荧光素分子耦联的单克隆抗体与探针分子特异性结合,来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析，可判断单个碱基突变。此时，一个染色体核型，即为一个碱基。近年来，采用荧光原位杂交技术，将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记，可以精确地检测染色体上DNA链中，单个碱基的突变，从而大大提高了染色体核型分析的精度。 三、光谱核型分析技术 SKY(spectralkaryotying)光谱染色体自动核型分析是一项显微图像处理技术,SKY通过光谱干涉仪,由高品质CCD获取每一个像素的干涉图像,形成一个三维的数据库并得到每个像素的光程差与强度间的对应曲线,该曲线经傅立叶变换之后得到该像素的光谱,再经由软件分析之后用分类色来显示图像或将光谱数据转换成相应的红绿蓝信号后以常规方式显示。

染色体显带技术论文

西南大学 《细胞遗传学》课程论文 论文题目：染色体显带技术与运用 学院：农学与生物科技学院 专业：农学 年级： 2010级 学号： 姓名： 指导老师： 二零一二年十二月十八日

染色体显带技术 摘要：染色体（Chromosome ）染色体是细胞核中载有遗传信息（基因）的物质，在显微镜下呈圆柱状或杆状，主要由脱氧核糖核酸和蛋白质组成，在细胞发生有丝分裂时期容易被碱性染料（例如龙胆紫和醋酸洋红）着色，因此而得名。 关键词：染色体；分带；类型；应用 一、染色体带型的介绍 染色体显带(chromosome banding) 用特殊的染色方法, 使染色体产生明显的色带(暗带)和未染色的明带相间的带型(banding patterns), 形成不同的染色体个性, 以此作为鉴别单个染色体和染色体组的一种手段。染色体显带技术最重要的应用就是能够明确鉴别一个核型中的任何一条染色体, 乃至某一个移位片段, 同时也可用于核型进化及可能的进化机制研究。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。染色体带型是鉴别染色体的重要依据。通过分带机理的研究，可获得染色体在成分、结构、行为和功能等方面的许多信息。 常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带、N带等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。Q带技术是1968年瑞典细胞化学家卡斯珀松（T.Caspersson）建立的，所显示的是中期染色体经芥子喹吖因染色后在紫外线照射下所呈现的荧光带，这些区带相当于DNA分子中AT碱基对成分丰富的部分。G带即吉姆萨带，是将处于分裂中期的细胞经胰酶或碱、热、尿素等处理后，再经吉姆萨染料染色后所呈现的区带。C带又称着丝粒异染色质带，由（M.L.Pardue）在1970年建立，是将中期染色体先经盐酸，后经碱（如氢氧化钡）处理，再用吉姆萨染色，显示的是紧邻着丝粒的异染色质区。R带是中期染色体不经盐酸水解或不经胰酶处理的情况下，经吉姆萨染色后所呈现的区带，所呈现的是G带染色后的带间不着色区，故又称反带。T带又称端粒带，是染色体的端粒部位经吉姆萨和吖啶橙染色后所呈现的区带，典型的T带呈绿色。70年代后期，由于细胞同步化方法的应用和显带技术的改进，因而可获得更长而带纹更为丰富的染色体，这种染色体即称为高分辨染色体。例如1975年以后，美国细胞遗传学家龙尼斯（J.J.Ron-neys）等建立了高分辨显带法，先用氨甲喋呤使细胞分裂同步化，然后用秋水酰胺进行短时间处理，使之出现大量的晚前期和早中期的分裂相。早期染色体比正中期染色体长，显带后可制出分带细、带纹更多的染色体。例如在前中期分裂相可显示555～842条带，晚前期可显示843～1256条带，而从早前期获得的更长的染色体上可显示出3000～10000条具有分辨程度更高的带型。高分辨技术能为染色体及其畸变提供更多的细节，有助于发现更多细微的染色体异常，可对染色体的断裂点作更为精确的定位，这

遗传性疾病检验技术—显带染色体检验

显带染色体检验 非显带染色体制备技术不能将每一条染色体的特征完全显示出来，只能根据各染色体的大致特征（大小、着丝粒位置）来识别。对于染色体结构畸变的诊断和研究受到很大限制。 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。 自20世纪60年代末以来各种染色技术的应用，染色体显带技术得到了很大的发展。可以将染色体的个体特征显现出来，据此可准确识别23对不同类型的染色体，从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床染色体疾病的诊断提供了更有效的手段。 染色体经过一定程序处理并用特定染料染色后，在普通光学显微镜或荧光显微镜下可显现出不同深浅颜色的带纹或不同强度的荧光 节段叫做染色体带，各号染色体带的形态不同，称带型。染色体显带的分类通常是按能产生某种带型的方法来划分的。如用C、G、Q或T 显带技术产生的带分别称为C带、G带、Q带或T带。按此显带技术可分成两大类：一类是产生的带分布在整条染色体上，如Q、G和R 带；另一类只能使染色体上少数特定的带或结构着色，如C带、T带和N带等。 1971年巴黎会议确定的四种显带技术是：胰酶Giemsa法（G显带）、氮芥喹吖因荧光法（Q显带）、逆向Giemsa法（R显带）和着丝

粒区异染色质法（C显带），其中G显带是目前通常采用的显带技术之一，Q显带、R显带和C显带等技术也被用于染色体研究。四种常用显带技术各具优缺点，有不同的应用。 （一）染色体G显带检验技术 G显带是一种广泛应用的技术。它是用胰蛋白酶处理染色体标本，使染色体蛋白质变性，然后用Giemsa染色，染色体吸收染料，各条染色体上显出深色和浅色相间的带型——G带。G带在普通光学显微镜下即可观察分析。 G显带法包括四种处理技术，即醋酸-钠盐-Giemsa法、碱处理和磷酸缓冲液温育方法以及胰蛋白酶处理Giemsa染色法等，目前多采用胰蛋白酶处理Giemsa染色法。 1.检验原理 染色体经胰蛋白酶处理，染色体上出现了深浅不同的带纹，称为G带。这一显带技术应用最广，用一定浓度的胰酶处理染色体，使染色体蛋白变性，但阳性的G带是表明富含A～T DNA的区段，而阴性G带则富含G～C。出现明暗相间的带纹主要是染色体蛋白质的差异。 2.检验方法学 （1）器材及试剂 1）器材： 超净工作台、恒温培养箱、通风橱、冰箱、低温冰柜、恒温水浴

人类显带染色体核型分析

医学遗传学实验报告 【实验题目】人类显带染色体核型分析 【实验目的】 掌握染色体核型分析的常用方法及G分带的带型特征，会初步识别G分带人类染色体。 【实验原理】 将一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像称为该细胞的核型（karyotype），这通常是用显微摄影得到的染色体相片剪贴而成。在显带技术问世以前，人们主要根据染色体的大小、着丝粒的位置，将人类染色体顺次由1编到22号，并分为7组。但要想精确、有把握地鉴别每条染色体是比较困难的。70年代初出现了染色体显带技术，不仅解决了染色体识别困难的问题，而且为深入研究染色体异常及基因定位创造了条件。将染色体标本用显带方法处理后，再用Giemsa染色，这类技术称为G分带，通过显微摄影，就可得到G带染色体的显微相片。 【实验方法和步骤】 （1）胰酶液的配制：称取胰酶0.2g溶于100mlHanks液中，搅拌30min，用1mol/L NaOH调pH值至7.0～7.2，冷冻保存（最好现配现用）。 （2）先将胰酶液水浴加热到37℃。 （3）将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间几秒到几十秒不等，依标本存放时间长短而定（标本需预先经60℃～70℃烤2h，或37℃恒温老化5～7d。若标本太新鲜，则染色体有些毛糙）。 （4）取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再用蒸馏水洗。 （5）Giemsa染液染色8min。 （6）自来水洗、晾干。 （7）镜检：选择分散及显带良好的分裂象，在油镜下观察。如观察到染色体变粗并显得边缘毛糙，有时甚至呈糊状，是处理过度了。观察细胞的标准： 1）细胞完整，轮廓清晰，染色体在同一平面上均匀分布。 2）染色体形态和分散良好，最好无重叠现象，即使染色体个别重叠，也要能明显辨别。

染色体显带技术的名词解释

染色体显带技术的名词解释 染色体显带技术，是一种通过特定的实验方法将染色体分解和染色，然后通过 显微镜观察和分析染色体的带状图案，来揭示染色体结构和组成的一种分析技术。该技术是生物学和遗传学领域中非常重要的实验手段之一，广泛应用于生物体的遗传分析、基因定位和重组等研究方向。 染色体显带技术的原理是通过染色剂将染色体进行染色，然后通过显微镜观察 和记录染色体的带状图案。常用的染色剂有吉姆萨染剂、醋酸酯染剂等。这些染剂能够与染色体特定的结构和组成发生特定的反应，从而在显微镜下呈现出不同的带状图案。这些带状图案是染色体的一种特征，通过对带状图案的分析，可以确定染色体的个数、结构和组成等信息。 染色体显带技术在生物学和遗传学中有着广泛的应用。首先，它可以用于确定 染色体的数量和形态。通过观察染色体的带状图案，可以准确地确定染色体的个数。同时，不同的染色体在带状图案上呈现出不同的形态，通过对形态的观察和分类，可以对染色体进行鉴定和区分。 其次，染色体显带技术可以用于研究基因的定位和重组。通过对染色体显带图 案的分析，可以确定某个基因位于染色体的哪个区域，从而帮助研究人员进行基因的定位。此外，如果两个染色体上的带状图案发生了重组，也可以通过染色体显带技术来检测和确认重组的事件。 此外，染色体显带技术还可以用于进行遗传变异的分析。在染色体显带图案中，可以观察到染色体的缺失、重复、倒位等变异。通过对变异的分析，可以了解染色体结构的稳定性和遗传变异的机制。 总之，染色体显带技术是一种重要的实验手段，通过对染色体的染色和观察， 可以揭示染色体的结构和组成，帮助研究人员进行遗传分析和基因定位等研究。在

医院细胞遗传室T显带法作业指导书

医院细胞遗传室T 显带法作业指导书 1目的 T 显带技术是专门显示染色体端粒，可用于分析染色体端粒有无缺失、易位等畸变。T 显带是R 显带的亚类，因为特别地着色在端粒而称为T 显带。 2实验方法 手工显带法 3实验原理端粒是维持染色体正常复制和上下代传递的三个基本功能单位之一。它的功能包括确保染色体末端的正常复制；防止断裂的DNA与染色体末端的重组。它们亦是哺乳动物生殖细胞减数分裂第一次分裂时同源染色体配对的起始部位。每次细胞分裂，染色体丢失其末端的约100 核苷酸，此变短的端粒可为细胞提供一有丝分裂的时钟。丢失的端粒序列可经端粒酶的作用逐个加回。 T带是R带的最深染部分，必须 用特殊的高热处理染色体，然后用Giemsa 或与荧光联合染色。4性能特征 经T 显带处理后可见清晰的端粒。 5仪器及耗材 光学显微镜、恒温水浴箱、培养皿、1ml 注射器、擦镜纸、小镊子、未染色的染色体标本片（片龄一周以内）。 6试剂

磷酸盐缓冲（pH6.7）, 6.2 Giemsa 染液（pH5.1）,吖啶橙染料 7操作流程 7.1制片 常规外周血法制备的标本 7.2T 显带 7.2.1把染色体玻片标本放在含Giemsa的pH6.7磷酸盐缓冲液中，加热至87-93 C,水浴15分钟。 7.2.2然后浸入0.005%吖啶橙染料染色5-10 分钟。 7.2.3蒸馏水中（或上述缓冲液）中染色2分钟。 7.2.4以磷酸盐缓冲液封片。 7.2.5镜检：用荧光显微镜观察（本方法可在吖啶橙染料染 色后，用紫外线照射，Giemsa染色得到T带。 8显带观察 1、4、11和19号染色体短臂的末端显出绿色T带，以8、9、10和17 号染色体长臂的端带最为鲜明，5、1 2、14、16、20、21 和22 号染色体末端也稍显绿色， 3、6、18、X 和丫染色体不显端带。热处理如持续15-25分钟。11号染色体长臂近侧段和19 号染色体短臂近侧段，以及22 号染色体长臂近侧段均显示典型的中间绿带。此法特别用于识别22 号染色体的长臂。热处理30 分钟或更长时间，就会出现R 带

细胞遗传学检查

细胞遗传学检查 一、概述 细胞遗传学检查是指通过对人体细胞进行染色体分析，以确定染色体的数量、结构和功能是否正常，从而诊断遗传性疾病或评估生殖健康状况的一种检查方法。细胞遗传学检查主要包括染色体核型分析、FISH技术、CGH阵列比较基因组杂交技术等。 二、染色体核型分析 1. 检测对象 染色体核型分析适用于出现先天畸形、智力低下、性腺发育异常等情况的人群，以及不孕不育患者等。 2. 检测方法 （1）外周血淋巴细胞培养法：将受检者的外周血淋巴细胞培养后进行标本制备和染色，通过显微镜观察染色体形态和数量。 （2）羊水或脐带血培养法：对于孕妇和新生儿，可以采用羊水或脐带血进行培养和检测。 （3）组织培养法：对于出现肿瘤或其他组织异常的患者，可以采用组织培养法进行染色体核型分析。 3. 检测结果

染色体核型分析的结果主要包括染色体数量、结构和功能等方面的信息。正常人的染色体核型为46,XX或46,XY，其中XX为女性，XY为男性。如果出现染色体数量异常（如21三体综合征）、结构异常（如易位、倒位等）或功能异常（如X染色体失活等），则可能会导致遗 传性疾病的发生。 三、FISH技术 1. 检测对象 FISH技术适用于需要检测特定基因或染色体区域的人群，如癌症患者、先天畸形患者等。 2. 检测方法 FISH技术是一种基于荧光探针原理的检测方法，通过特异性标记 DNA序列并与待检测标本进行杂交反应，从而观察目标DNA序列在 细胞核内的位置和数量。 3. 检测结果 FISH技术可以检测到特定基因或染色体区域是否存在缺失、重复、易位等异常情况，并且可以提供更加精准的遗传风险评估。 四、CGH阵列比较基因组杂交技术 1. 检测对象 CGH阵列比较基因组杂交技术适用于需要全基因组范围内检测DNA

遗传病的现代化诊断方法

遗传病的现代化诊断方法 (一)症状和体征分析 症状和(或)体征的出现是患者就诊的主要原因，也是诊断遗传病的重要线索。例如精神发育不全、白内障和肝硬化常提示半乳糖血症的可能性；伸舌、高颧、眼距宽、鼻梁塌陷等特殊的痴呆面容常提示Down综合征。但也有许多症状和体征为多种遗传病所共有，此时若仅以症状与体征为线索诊断遗传病就会很困难，故必须借助于其他手段。 (二)家系分析 各种单基因遗传病常表现出特定的孟德尔式遗传。通常，调查其亲属患病情况，将调查材料绘制成系谱进行系谱分析，常有助于单基因病的诊断。要进行正确的系谱分析，首先必须有一个准确可靠的系谱。 (三)染色体和性染色体分析 染色体检查或称核型分析是确诊染色体病的主要方法。由于显带技术的广泛开展，已使染色体病的诊断和定位更加准确。各医疗单位对进行核型分析的适应证有不同的规定，随着技术改进和新的染色体病的发现，需要进行染色体检查的适应证将日益增多。性染色体(包括X染色体和Y染色体)的检查对性染色体数量畸变所致疾病的诊断有一定意义。 (四)生化分析 以蛋白质分子的结构和功能缺陷为病变基础的单基因病，往往可以对蛋白质分子本身和酶促反应过程中的底物或产物进行定量或定性分析。由于单基因病的种类繁多，加上蛋白质分子或酶促反应的底物或产物的性质各不相同，所以检测方法也不一致。要在某个医疗部门或研究机构同时建立一套完整的单基因病生化检测系统几乎是不可能的。一些国家为此建

立了生化检测的协作网络，不同的部门分别从事不同的单基因病生化测定与研究，同时促进部门间的相互协作。用于生化检测的材料主要有血液、活检组织、尿、粪、阴道分泌物、脱落细胞和培养细胞等。不同遗传病的生化检测可用不同的检测材料。 (五)基因诊断 基因诊断(genediagnosis)又称为DNA诊断，是利用重组DNA技术，直接在DNA水平来检测人类遗传性疾病中的基因缺陷，从而做出判断。人体基因组的类型早在受精卵开始时就已形成，因此在人体发育的任何时期，只要获得受检者的基因组DNA，应用恰当的DNA 分析技术，便能鉴定出缺陷的基因，而不论该基因产物是否已经表达。而且，应用这一方法，不仅能够检测单个碱基置换、缺失和插入等，还能发现DNA的多态现象以及遗传病的异质性。

植物染色体显带技术

细胞遗传学实验 实验一植物染色体去壁、低渗、火焰干燥制片技术 一、实验原理： 用此法可以显著提高染色体的分散程度和平衡性，可以减少染色体的变形、断裂等现象，也可以减轻细胞质对染色体的覆盖。使染色体各组成部分—长臂、短臂、着丝粒、随体、染色单体等都显示得比较清楚，有利于染色体测量和显带的分析。此法也很简单，首先用酶解法去除植物细胞壁，再利用热胀冷缩的原理，将植物细胞在冰片上用火焰烧烤，用力甩片能使细胞膜破裂，不需要特殊设备，同时也省去了繁杂的压片手续，显著提高了制片的效率。 二、实验目的： 学习植物染色体标本制备去臂、低渗法的技术，为染色体显带实验提供了优良的标本。 三、实验步骤： 1材料的制备： 黑麦根尖(2n=14) 根尖材料的制备： 1. 发根：将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草)；最适温度(23~32℃)；培养24h再放入0~4℃冰处理1~7天。目的:(1)使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；(2)调节工作时间。再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天；待根尖长度为1.5~2cm即可处理。 2 预处理：化学和物理两种

(1) 化学方法：(适合所有生物) a. 秋水仙素0.05~0.2﹪ (白色粉末，易溶于水的巨毒药品)； b. 0.002M 8-羟基喹啉 (淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释，对禾本科植物的随体很清楚)； C.а-溴萘饱和液 (淡黄色的乳浊液，易溶于乙醇和苯；难溶于水，100ml水中倒入1~2滴剧烈的振动5分钟)； （以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5h） d. 对二氯苯饱和液 (淡黄色的晶体，难溶于水；具有强烈的腐蚀性，只能处理1~1.5h)。 (2) 物理方法：(适合禾本科作物，本次实验所采用) 冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。 预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。 3 固定： 卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇︰醋酸); 固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞，使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。 4 保存：

遗传性疾病检验技术—高分辨显带检验技术

遗传性疾病检验技术—高分辨显带检验技术中期染色体已经历了收缩变短和带纹融合的过程，因而显示的带纹数有限。一套单倍体染色体带纹数仅有322条带。20世纪70年代后期，由于细胞同步化方法的应用和显带技术的改进，人们已能得到更长而带纹更加丰富的染色体。单套染色体带纹有550～850条，甚至在晚前期的细胞可显示1000条带以上。由于带纹的丰富细致而大大提高了染色体的分辨率。这种染色体称为高分辨显带染色体。 （一）外周血细胞高分辨染色体检查 1.检验原理 培养细胞群中的细胞，各自处于细胞周期的不同阶段，为了获得较多的早期染色体，让培养的细胞同时分裂即同步化。其原理是使细胞内的DNA合成暂时阻断，如甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶，从而干扰从脱氧-磷酸尿嘧啶核苷到-磷酸胸腺嘧啶核苷的合成，阻止了DNA 的复制；过量的胸苷可以形成多量的三磷酸腺苷。因此，能反馈地抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，从而使DNA复制减慢；这样细胞被阻止在DNA合成期或以极慢速度通过DNA合成期。当解除阻断后，细胞即迅速恢复DNA合成。进入分裂期高峰，即可获得较多的早期分裂细胞，以后在细胞培养过程中再加入BrdU，BrdU掺入DNA分子中取代脱氧胸腺嘧啶核苷，干扰DNA分子的四级结构，降低其螺旋化程度，产生染色体伸长的效果。 2.检验方法学

常用方法有两种：甲氨蝶呤同步法和过量胸腺嘧啶核苷同步法。 （1）甲氨蝶呤BrdU同步法 1）器材及试剂： 器材和一般试剂同外周血染色体检查法。试剂：①胸腺嘧啶核苷液：胸腺嘧啶核苷分子量242.2，配成1×10～5mol/L，即为2.42μg/ml；②5-溴脱氧尿苷（BrdU）液：取BrdU 7.5mg溶于0.85%NaCl 10ml 中，浓度为750μg/ml。应避光冷冻保存；③甲氨蝶呤（MTX）：甲氨蝶呤分子量为454.6，配成1×10～7mol/L，即为0.0454μg/ml。 2）操作 标本采集：同外周血，但采血量5ml。 接种培养：在无菌条件下将静脉血接种在RPMI 1640培养液，每瓶0.3～0.5ml。混匀，置37℃恒温箱内72小时，加甲氨蝶呤最终浓度为10～7mol/L，继续培养17小时，使其同步化。 离心弃去上清液：以预温37℃无小牛血清的RPMI 1640培养液洗涤两次，加入含有20%小牛血清的RPMI 1640培养液，再加入BrdU，最终浓度为15mg/ml，轻轻混合均匀，置37℃继续培养5小时。加入终浓度为0.04μg/ml的秋水仙素，作用15分钟。 收获细胞：将细胞液离心，弃去上清液。 低渗：加入已预温37℃的0.4%氯化钾与0.4%枸橼酸钠（1∶1）的混合液8ml，置37℃温箱低渗20分钟。

染色体检查事项

染色体检查事项 一、什么是染色体 染色体位于细胞核中，是遗传信息的载体，决定着生物体的性状和正常的生理过程。 人类具有46条染色体，按照其大小和形态分为23对，第1至22对为常染色体，为男性 和女性共有的，第23对为性染色体，男性为XY，女性为XX。最大的染色体是1号染色体 长度约85mm,有2.49亿个碱基对组成。最小的是21号染色体长度约16mm，4万8百万个 碱基对。每条染色体都是有一条DNA分子盘旋组蛋白高度螺旋化构成的。 二、染色体怎么检查 染色体检测技术有很多种：各种常规显带核型分型G带，C带，N带等，荧光原位杂 交技术FISH，高通量分子遗传检测array CGH、SNP array以及二代测序技术等。各有优 势和针对性。 目前本中心对试管婴儿前夫妻双方常规做的是G显带核型分析。G显带是最常用的， 染色体经酶处理后，用一种能够结合DNA的化学燃料Giemsa染色，呈深浅不同的带型， 每条染色体可显示出各自特异的带纹。根据呈现的带纹来判断病人的染色体是否存在光学 显微镜下可见的异常。 通常染色体检查使用的是外周血淋巴细胞，于病人肘静脉采血约3ml即可。检测结果 不受采血环境影响，所以抽血前并不需要空腹。染色体的整个培养制备过程较为复杂耗时，所以染色体报告不会很快出来。 三、染色体检查结果 1未见异常：大部分来检测的夫妻染色体报告结果是46,XX和46,XY，那说明你们染 色体无异常。也有一种可能性是有微小的异常，但是G显带技术限制，未能检出。 2异常结果：染色体异常包括数目异常和结构异常。 数目异常又分为整倍体和非整倍体。人的配子精子或卵子是单倍体，含有23条染色 体22条常染色体和一条性染色体称之为一个染色体组。如果染色体数目的改变是一个染 色体组的倍数，则称为染色体的整倍体畸变，比如三倍体，四倍体，这种在流产儿中可见，成年夫妻不会见到;如果染色体数目的改变不是一整个染色体组的倍数，而是其中一条或 几条染色体数目不对，那就是非整倍体畸变，比如45,X0，47,XXY，或嵌合体 47,XXX/46,XX等等类似核型都是属于非整倍体改变。 常见的结构异常有缺失，易位，重复，环状染色体，双着丝粒染色体和插入等。最常 见的是平衡易位和罗氏易位。

遗传性疾病检验技术—细胞培养技术

遗传性疾病检验技术—细胞培养技术细胞培养是体细胞遗传学的基本技术，是在器官组织培养基础上发展起来的一项重要的生物学技术，是通过体外模拟体内的生理环境使细胞成活，进行物质代谢和有丝分裂。为了研究、检查人类染色体，约有90%以上取材于人体外周血。因此，外周血培养法是研究细胞遗传学的理想技术。 一、外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备 在临床检验中，外周血培养主要用于细胞遗传学的染色体研究。因通常情况下外周血中是看不到分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。目前已知外周血中的小淋巴细胞处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时需要经一定剂量的植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激，将T淋巴细胞转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。淋巴细胞经过68～72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。用秋水仙素（细胞分裂阻断剂）使细胞分裂停留在分裂中期或早中期，从而获得可供分析的中期分裂象。 （一）检验原理 外周血染色体检查技术的原理是利用细胞分裂中期染色体长短 和大小恰到好处的特点设计的。所以，显示染色体首先要获得一定量的中期分裂象。人类染色体有46条，密集在细胞核中，必须把它们分散开，才能看清楚。为了满足分析的基本要求，可以采取以下措施：

1.药物刺激细胞增殖获取中期分裂象 初期淋巴细胞培养则很少出现分裂，为此常采用刺激细胞增殖措施，刺激细胞增殖主要采用植物血凝素，能在体外刺激淋巴细胞进入分裂期和引起“母细胞样”反应，随后进入分裂周期。 2.阻抑中期分裂 用秋水仙素或秋水仙胺破坏细胞内的纺锤体形成从而阻抑中期分裂。由于它对DNA合成并无干扰，因此随着作用时间的延长可截获较多中期分裂象，产生类似提高分裂指数的效应。 3.低渗处理 采用低渗液处理法使细胞体积膨胀，染色体松散、铺开。 4.固定 固定是为使染色体结构不被破坏，提高染色体的可见性及染色体的嗜碱性，还可维持染色体结构的完整性。 5.染色 用空气干燥法制片，使细胞中各个染色体分散、平展并贴附于玻片上。显带、染色（常用Giemsa染色）后可以对人类染色体进行精确的计数和对各个染色体结构特点进行详尽的分析。 （二）检验方法学 1.器材和试剂