产单核细胞李斯特菌actA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制

产单核细胞李斯特菌actA基因在大肠杆菌中的表达及其单克

隆抗体的研制

产单核细胞李斯特菌actA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制

利用PCR技术从血清型1/2a的产单核细胞李斯特菌Lm-4株中扩增出actA基因,经克隆筛选和测序鉴定后,构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1-actA及pET-actA,转入E. coli后,IPTG诱导目的蛋白的表达.SDS-PAGE结果表明,actA基因在两种载体中均获得表达,融合蛋白的大小分别约为120kDa和97kDa.以纯化蛋白为材料进行了ActA 单抗的研制,获得4株抗ActA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,腹水单抗ELISA效价为1∶5×104～1∶1×105.选取单抗1A5进行Western blot 分析,结果表明单抗1A5能和表达产物进行特异性反应,且与Lm-4多抗血清的Western blot结果一致.actA基因的原核表达及单抗的研制为研究ActA蛋白的生物学活性及其致病作用奠定了基础.

作者：殷月兰董慧焦新安焦红梅顾志强袁舟张晨菊征超峰作者单位：扬州大学生物科学与技术学院扬州 225009 刊名：微生物学报ISTIC PKU英文刊名：ACTA MICROBIOLOGICA SINICA 年，卷(期)：2006 46(6) 分类号：Q93 关键词：产单核细胞李斯特菌 actA 基因表达单克隆抗体

基因工程药物

基因工程药物 周长征 第一部分概述 一、基因工程药物 （一）基因工程药物的概念 基因工程药物是以基因组学研究中发现的功能性基因或基因的产物为起始材料，通过生物学、分子生物学或生物化学、生物工程等相应技术制成的、并以相应分析技术控制中间产物和成品质量的生物活性物质产品，临床上可用于某些疾病的诊断和治疗。基因药物类型广泛，包括重组蛋白质药物、人源化单克隆抗体、基因治疗药物、重组蛋白质疫苗、核酸药物等10多种类型。 生产基因工程药物的基本方法是：将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药物或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达，就称为基因治疗。 例如，乙肝表面抗原（HBSAg）的产生也受DNA 调控。利用基因剪切技术，用一种“基因剪刀”将调控HBSAg的那段DNA剪裁下来，装到一个表达载体中（所谓表达载体，是因为它可以把这段DNA的功能发挥出来）再把这种表达载体转移到受体细胞内，如大肠杆菌或酵母菌等；最后再通过这些大肠杆菌或酵母菌的快速繁殖，生产出大量我们所需要的HBSAg（乙肝疫苗）。把一定量的HBSAg注射入人体，就使机体产生对HBV抗衡的抗体。机体依靠这种抗体，可以清除入侵机体内的HBV。过去，乙肝疫苗的来源，主要是从HBV 携带者的血液中分离出来的HBSAg，这种血液是不安全的，可能混有其他病原体的污染。此外，血液来源也是极有限的，使乙肝疫苗的供应犹如杯水车薪，远不能满足全国的需要。基因工程疫苗解决了这一难题。 干扰素具有广谱抗病毒的效能，是一种治疗乙肝的有效药物，国际上批准唯一一种治疗丙型病毒性肝炎的药物。通常情况下人体内干扰素基因处于休眠状态，血中一般检测不到。只有在发生病毒感染或受到干扰素诱导物的诱导时，人体内的干扰素基因才会产生干扰素，但其数量微乎其微。即使经过诱导，从人血中提取1mg 干扰素，需要人血8000ml，其成本高得惊人。获取1磅（453g）纯干扰素，其成本高达200亿美元。1980年后，采用基因工程进行生产，其基本原理及操作流程与乙肝疫苗十分类似。现在要获取1磅纯干扰素，其成本不到1亿美元。 （二）基因工程药物的发展 1973年，Cohen等人首次将带有Tet r基因和链霉素抗性基因（Str r）的两种大肠杆菌质粒成功地进行了重组，获得了可以复制并只有双亲质粒遗传信息的重组质粒，拉开了基因工程研究的序幕。1974年他们对具有Amp r和红霉素抗性基因（Emp r）的金黄色葡萄球菌质粒

生物技术制药要点

生物技术制药要点概括 1.现代生物技术发展大事记： 年代主要发现和进展 1953 Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构 1958 分离得到DNA聚合酶I，并在试管内制得人工DNA 1960 发现mRNA，并阐明了mRNA在蛋白质合成中的作用 1966 破译遗传密码 1967 分离得到DNA连接酶 1970 分离出第一个限制性内切酶 1971 第一次用限制性内切酶和连接酶获得重组DNA 1972 合成了完整了tRNA基因 1974 Boyer和Cohen建立了DNA重组技术 1975 Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术 1976 DNA测序技术诞生 1978 Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素 1981 第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准使用 1981 第一台商业化生产DNA自动测序仪诞生 1982 用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准 1983 基因工程Ti质粒用于植物转化 1988 PCR（聚合酶链式反应）技术诞生 1990 美国批准第一个体细胞基因治疗方案 1997 英国培育出世界上第一只克隆羊多莉 1998 美国批准艾滋病疫苗进行人体实验 2001 人类基因组草图完成 2003 世界上第一个正式批准的基因治疗药物重组腺病毒-p53注射液在中国上市 2008 人类将表皮细胞激活为干细胞 2.生物技术药物（biopharmaceutics）:广义是是指所有以生物质为原料只去的各种生物活性物质及其人工合成类似物、以及通过现代生物技术制的的药物，狭义指利用生物体、生物组织、细胞及其成分，综合应用化学。生物学和医药学各学科原理和技术方法制得的用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品，而这里特指采用DNA重组技术或其他现代生物技术研制的蛋白质或核算类药物。 3.生物技术药物的四大类型：基因重组药物、基因药物、天然药物、合成的半合成的生物技术药物。 4.生物技术药物的主要特点：剂量小，活性高；分子结构复杂，分子量一般较大；稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短；具有种属特异性；具有免疫原性；分析检验的特殊性。 5.生物技术药物与化学药物的区别：

生物技术制药课后习题答案

第一章绪论 1生物技术是以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。 2生物技术的主要内容：P1 基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程 蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。 染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。 生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。 3生物技术制药采用现代生物技术人为创造条件，借助微生物、植物或动物来生产所需的医药品过程被称为 4生物技术药物采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物才能被称为 5生物药物生物技术药物与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为PPT复习题 第二章基因工程制药 1、简述基因工程制药的基本程序。P16 2、说明基因工程技术用于制药的三个重要意义。P15第一段第一行 3、采用哪两种方法来确定目的cDNA克隆？P18（7目的基因cDNA的分离和鉴定 ）①核酸探针杂交法 用层析法或高分辨率电泳技术(蛋白质双向电泳技术或质谱技术)分离出确定为药物的蛋白质，氨基酸测序，按照密码子对应原则合成出单链寡聚核苷酸，用做探针，与cDNA文库中的每一个克隆杂交。这个方法的关键是分离目的蛋白， ②免疫反应鉴定法（酶联免疫吸附检测） 4、说明用大肠杆菌做宿主生产基因工程药物必须克服的6个困难。 ①原核基因表达产物多为胞内产物，必须破胞分离，受胞内其它蛋白的干扰，纯化困难； ②原核基因表达产物在细胞内多为不溶性(包含体, inclusion body)，必须经过变性、复性处理以恢复药物蛋白的生物学活性，工艺复杂； ③没有翻译后的加工机制，如糖基化，应用上受到限制； ④产物的第一个氨基酸必然是甲酰甲硫氨酸，因无加工机制，常造成N-Met冗余，做为药物，容易引起免疫反应； ⑤细菌的内毒素不容易清除； ⑥细菌的蛋白酶常常把外源基因的表达产物消化； 5、用蓝藻做宿主生产基因工程药物有什么优越性？ 蓝藻：很有前途的药物基因的宿主细胞 ①有内源质粒，美国Wolk实验室已构建1200种人工质粒，可用做基因载体。 ②载体转化蓝藻不需要诱发感受态就可以做到； ③外源基因产物不形成包含体，分离与纯化工艺可以大大被简化； ④可以直接食用，等于直接口服药物 6、结合pBG-2说明选择用于E. coli 细胞宿主中的载体的6项原则。 P23 与pBV220优点类似，原则P22 7、简述基因工程菌中质粒不稳定的两个指标？P32如何计算质粒的稳定性？P33质粒稳定

嵌合抗体

嵌合抗体的制备 抗体在生物医学领域中的应用极为广泛，其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体，主要包括两部分：一是对已有的单克隆抗体进行改造，包括单克隆抗体的人源化(嵌合抗体、人源化抗体)、小分子抗体(Fab，ScFv，dsFv，diabody，minibody等)以及抗体融合蛋白的制备；二是通过抗体库的构建，使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体。 基因工程抗体，即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中，在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是，首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA，逆转录成cDNA，再经PCR 分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中，并在适当的细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子，筛选出高表达的细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力和特异性。借助于基因工程技术，既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造。 单克隆抗体(McAb)以其高特异性、高亲和力等优点，在许多疾病的诊疗中得到广泛应用，成为新型药物研制的一条有效途径。然而大多数McAb都是鼠源的，众多的临床研究表明，将鼠源McAb重复注入人体内会引起患者的人抗鼠抗体(HAMA)反应，出现全身过敏毒性反应并阻断抗体功效的发挥。为了降低鼠源McAb在人体内的免疫原性，尽可能地避免患者出现HAMA反应，从而可以给患者重复应用McAb来实施治疗现在已经发展了三种技术来克服抗体的免疫原性： (1)将鼠源McAb的恒定区(c区)置换为人抗体的C区，构建成人／鼠嵌台抗体； (2)在采用人的C区的基础上，将鼠源McAb的互补决定区( cDR)移植到人抗体的框架区( FR)中，构建成人源化改形抗体；(3)从人类噬菌体抗体库中获得针对特异性抗原的人抗体的可变区(V区)基因，再构建完整的人抗体或抗体片段。在大多数情况下，鼠源McAb的免疫原性都是由抗体的C区引起的，故而采用置换C区的嵌合抗体可大大降低鼠源McAb的免疫原性。 嵌合抗体(chimeric antibody) 属第一代人缘化抗体，有60％～70％的人源区域，是目前研究较多且较为成熟的基因工程抗体，它是应用DNA重组技术将鼠源单抗的V区基因与人免疫球蛋白的c区基因相连接，构建成嵌合基因，插

李斯特氏菌

单增李斯特菌的调查报告 一、单增李斯特菌的概述 生活中李斯特菌到处存在，但其中只有一种为致病菌。李斯特菌可从各种食品样本中分离出来包括乳制品、肉类、蔬菜和海鲜，也可从食品加工过程中的环境中分离而来。 李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。目前国际上公认的李斯特菌共有七个菌株：（1）单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes/L.mono) （2）绵羊李斯特菌 (Listeria iuanuii) （3）英诺克李斯特菌(Listeria innocua) （4）威尔斯李斯特菌(Listeria welshimeri) （5）西尔李斯特菌 (Listeria seeligeri) （6）格氏李斯特菌 (Listeria grayi) （7）默氏李斯特菌 (Listeria murrayi) 其中单增李斯特菌(Listeria monocytogenes/L.mono)是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。 在美国LM被列为7种主要的食源性致死病菌之一,已经被WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病原菌之一。LM为需氧或兼性厌氧菌,生长温度为1~45℃,对不利环境具有较强的耐受能力,在4℃冰箱中也可生长繁殖,在pH 5.0~9.0的环境中, 1年后仍可检出,这使其危害性进一步增大。另外,LM病原体定居在细胞内,因此应用抗生素治疗效果不理想。由于LM引起的疾病及其食源性感染日益引起世界各国的重视,对该病建立快速、灵敏、准确的检测是有效防治本病、诊断病原菌和保证食品卫生安全的重要手段。 二、单增李斯特菌的检测方法 （1）平板培养法（国标）：用不同浓度的沙门菌菌悬液人工染菌二类食品各4o份，用增菌液两步增菌，两种分离培养基分离，对比检出率及分离效果。检出率62．5％，最低检出限为0.5cfu/25g一13cfu/25g。 （2）显色培养基：上海欢奥科贸有限公司 （3）PCR试剂盒：生物梅里埃的检测系统、杜邦：BAX?系统检测法，BAX?系统的单增李斯特菌检测法的灵敏度和特异性比率达到了98%，，并通过USDA-FSIS和AOAC国际的认证，成为官方检测法。 美国伯乐iQ-Check单增李斯特菌的检测：iQ-Check系统采用了所有的实时荧光PCR方法的优点为食品中病原微生物提供快速和可靠地检测解决方案。iQ-Check试剂盒为食品和环境样品中的单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)定性检测试剂盒。 陆桥： 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）荧光定量PCR检测试剂盒1680 48T 索奥： 单增李斯特菌(LM)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)

基因dat对单核细胞增生李斯特r氏菌的生物学特性影响

基因dat对单核细胞增生李斯特r氏菌的生物学特性影响 曾海娟;谢曼曼;丁承超;刘武康;董庆利;刘箐 【摘要】单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种重要的 食源性致病菌,其基因dat编码D-丙氨酸氨基转移酶,可将D-谷氨酸转变为D-丙氨酸,后者是细菌细胞壁肽聚糖的组成成分.在Lm野生株EGDe actA及inlB双基因 缺失株(EGDeΔactAΔinlB)的基础上,利用同源重组的方法进一步构建了缺失基因dat的菌株(EGDeΔactAΔinlBΔdat),并对该缺失菌株生长状态、毒力基因表达水平、细胞侵袭及生物被膜的形成量等基本生物学特性进行研究,运用Real Time- PCR(RT-PCR)测定Lm毒力基因的相对表达量.结果表明,基因的缺失对突变菌株的生长能力以及生物被膜形成有重要的调控作用,并导致毒力基因srtA、plcA表达量下调,VIP、inlA表达量上调,对Coca-2细胞的侵袭无影响.此缺失株的构建为进一 步研究基因dat的功能提供了材料. 【期刊名称】《微生物学杂志》 【年(卷),期】2018(038)003 【总页数】7页(P9-15) 【关键词】单核细胞增生李斯特氏菌;基因敲除;生长能力;RT-PCR;细胞侵袭;生物被膜 【作者】曾海娟;谢曼曼;丁承超;刘武康;董庆利;刘箐 【作者单位】上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;上海理工大学医疗 器械与食品学院,上海 200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;上

海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093;上海理工大学医疗器械与食品学院,上海 200093 【正文语种】中文 【中图分类】Q933;TS201.3 单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是革兰染色阳性的一种重要的食源性致病菌，广泛分布于土壤、污水等环境中[1] 。Lm具有较强的生存能力，pH在4.5～9.0，温度在0～45 ℃均可增殖[2]，在冰淇淋、原奶、生肉、干酪、海鲜及方便食品，如熟肉、熏鱼中均有检出[3-6]。由于食用了被污染的食物导致单增李斯特菌的感染[7]，患者死亡率可达30%以上。单增李斯特菌是典型的细胞内寄生菌，可通过李斯特菌溶血素等的裂解作用下逃离吞噬小体[8-9]，进入并在细胞质中增殖，在其中产生的蛋白将激活CD8+T细胞，部分被吞噬溶酶体直接杀死，降解的蛋白呈递给CD4+T细胞。Lm引起的独有的这种功能免疫应答机制，使得减毒李斯特菌成为一种潜在的可携带肿瘤、病毒及细菌抗原的疫苗载体[10]。基因dat(daaA)存在于多种细菌中，其编码D-丙氨酸氨基转移酶蛋白，经转氨作用可将D-谷氨酸转变为D-丙氨酸(D-Ala)，后者为细菌细胞壁肽聚糖的重要组成成分[11]。在单核细胞增生性李斯特菌中，存在两种途径生成D-Ala：基因dal编码丙氨酸消旋酶(Alr)，可将L-Ala转化为D-Ala；基因dat编码D-氨基酸氨基转移酶蛋白，可将D-谷氨酸与丙酮酸通过转氨作用生成D-Ala与α-酮戊二酸，当dat 与dat基因全部缺失时，由于不能产生D-Ala，在无外源D-Ala添加时，该 dat/dat双基因缺失菌株将发生溶菌死亡[14]。当菌株缺失dat基因时，该缺失菌株在生长状态、毒力基因表达水平、细胞侵袭性、生物被膜的生成量等方面的影响目前尚无研究报道。作为一种潜在的疫苗载体，对李斯特菌进行减毒以保证安全

单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立

单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立 尹海畅;吕兴锋;刘思国;王伟;王建超;孟庆文 【摘要】单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monoc ytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状.现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD50)来评价不同LM菌株的致病性.为建立LM的ICR 小鼠模型,本研究采用1/2a血清型的N21 LM菌株,分别以106、107、108、109和1010CFU的剂量口腔灌注感染6周龄ICR小鼠,每组10只;另取10只接种PBS 作为对照组,测定LM对ICR小鼠的LD5o;另取40只小鼠,平均分为2组,公母各半,以测定的LD50剂量接种LM,分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化及组织中细菌载量进行评价.结果发现,N21 LM菌株对ICR小鼠的LD50为109.25 CFU;感染周期为10 d左右,感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出及体重下降等临床症状.组织病理学分析结果显示,肝脏先后出现实质内灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎.菌落计数和Real-time PCR的检测结果发现肝脏中细菌载量最高,脾脏次之.结果表明,ICR小鼠能作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型.本试验结果为研究LM的致病机制、疫苗研究及抗菌肽转基因小鼠抗LM的评价奠定了基础. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2013(040)009 【总页数】5页(P131-135) 【关键词】单核细胞增生性李斯特菌;感染;ICR小鼠模型 【作者】尹海畅;吕兴锋;刘思国;王伟;王建超;孟庆文

人源化抗体和全人源化抗体

鼠源单抗人-鼠嵌合单抗人源化单抗完全人源化单抗 1.“不务正业”的化学诺奖又颁给了生物学，2018年10月3日，诺贝尔化学奖授予了格雷格•温特(GregoryP．Winter)等3位科学家，以表彰他们在酶的定向进化，肽类和噬菌体展示技术等方面的成绩。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。 请根据材料回答下列问题：（1）噬菌体的遗传物质是________，如噬菌体外壳蛋白展示胰岛素蛋白原，构建基因表达载体时，胰岛素基因前还要插入________。 （2）将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因中，需要用到的工具酶有________。噬菌体外壳蛋白结构基因用EcoRⅠ切割后产生的片段如图： 图示末端为________，为使外源蛋白DNA序列能与其相连，外源蛋白DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种酶切割，该酶必须具有的特点是________。 （3）从物质基础来看，不同生物之间能够进行基因重组，原因是________。 （4）雷格•温特发明了“拟人化”和全拟人化的噬菌体展示技术，并开发了制造人源化抗体以及在细菌中重组表达人源抗体的技术，这一技术解决了单克隆抗体传统的制备过程中需要将________和________相融合的需求。单克隆抗体常应用于分子靶向治疗，其特点是________。 2.噬菌体抗体库技术是指将人的全部抗体基因插入噬菌体的基因组中，然后让该噬菌体感染大肠杆菌，最终使抗体以复合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成含有人的全套抗体的噬菌体抗体库。回答下列问题：（1）获得人抗体基因的途径之一是从________细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，再通过PCR技术扩增出抗体基因。扩增抗体基因的前提是________，扩增过程中需使用的酶是________。 （2）在噬菌体抗体的制备过程中，不需要用Ca2+处理大肠杆菌，原因是________。 （3）从噬菌体抗体库中用________方法筛选特异性抗体，原理是________。 （4）与动物细胞工程生产单克隆抗体相比，该技术省去了人工免疫动物、________等步骤，使制备过程更简单易行。 3.用人杂交瘤来生产人源单克隆抗体难以成功，因此单克隆抗体大都来自鼠源．在人源化单克隆抗体研制成功之前，单克隆抗体大都来自鼠源．但鼠源单抗在人体内使用时，会产生较强的免疫原性，为解决这一问题，发明了嵌合抗体．大致过程如图所示： （1）图示中获得“肿瘤抗原免疫小鼠”的操作是．鼠源单克隆抗体的生产应用的动物细胞工程技术有． （2）嵌合抗体能降低鼠源抗体的“免疫原性”，从图中可以推测，免疫原性的产生主要与抗体的___（选填“V区”、“C区”）有关． （3）基因嵌合表达载体转染细胞的方法是，转染成功的细胞具有的特点是：能分泌抗体和能力． （4）嵌合抗体的生产属于工程范畴．图示中的嵌合抗体能比较有效的治疗．（5）科学家们用细胞融合实验证明，分化的细胞中存在“闲置不用“的结构基因．他们把大鼠肝肿瘤细胞和小鼠成纤维细胞融合成杂交瘤细胞，筛选出含有两套肝细胞染色体和一套成纤维细胞染色体的细胞．这些

单核细胞增生李斯特菌XS5 野毒株肌动蛋白actA 基因克隆与序列分析

单核细胞增生李斯特菌XS5 野毒株肌动蛋白actA 基因克隆与序列分析 作者：何嘉轩 来源：《畜牧兽医科学》 2020年第3期 何嘉轩 （甘肃省定西市安定区畜牧兽医局石峡湾畜牧兽医站，定西 743023） 摘要：研究以从新疆绵羊病料中分离的LMXS5野毒株的基因组DNA为模板，根据已知的LM 的actA基因序列，设计特异性引物，然后通过PCR技术对LM新疆野毒株肌动蛋白actA基因进行扩增、克隆和测序，并与标准毒株基因进行比对分析，结果XS5流行株actA基因全长均为1 797 bp，与GenBank登录的LM标准强毒株（ATCC19114） actA基因相比，XS5株actA基因存在51个不同的变异位点，其中同义突变 26 位点，错义突变 25 位点，引起25个氨基酸发生改变。该研究为LM actA基因遗传变异研究奠定一定的基础。 关键词：单核细胞增生李斯特菌；肌动蛋白actA基因；克隆；序列分析 中图分类号：S85 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2020.03.005 0 引言 单核细胞增生李斯特菌（LM）引起的是人畜共患散发性传染病，它在发酵不完全的青贮饲料中大量存在，动物食此饲料后导致发病，对养殖业的危害较大。肌动蛋白（actA）是LM重要的毒力因子之一，它与LM在胞内运动和在细胞与细胞之间的扩散密切相关。近年，对LM胞内运动的肌动蛋白作用的研究越来越重视。为从分子水平揭示LM新疆流行株与其他地域分离株致病性的差异，研究从LM新疆流行株XS5中提取基因组DNA，根据已知的LM actA的基因序列，设计特异性引物，然后通过PCR技术对LM actA基因进行扩增、克隆和测序，并与标准株的基因进行比对分析，以揭示新疆流行株actA基因遗传变异的特点和规律。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 DNA提取试剂盒、DH5α感受态细胞、特异性引物、诺维森琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、Taq plus DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、dNTPs、灭菌的PBS、EP管等。 1.2 引物设计 通过登录GenBank下载已知的单核增生李斯特菌肌动蛋白actA基因序列（登录号 GN703931.1），应用DNAMAN分子生物学软件进行序列比对和分析，筛选出高度保守的片段作为选择引物的靶序列，然后运用分子生物学软件primer 5.0设计出其特异性引物，引物跨度1958 bp，然后送到生物工程公司合成。上游引物：5'-CAACTTCCTGCCAAGCCTGA-3'；下游引物：5'-CTTCTTCCGTGACACCGATG-3'。 1.3 单核细胞增生李斯特菌基因组DNA提取及PCR反应

动物细胞转染与GFP的RNA干扰技术

细胞生物学实验报告动物细胞转染与GFP的RNA干扰技术 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员：

一、实验背景 1、GFP荧光蛋白的发现 1962年,下村修在这种水母的发光器官内发现天然绿色荧光蛋白。它之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中,第65至67个氨基酸(丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光发色团。 马丁•查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。1993年，他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，紫外光或者蓝光激发后，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。 1994年在美国《科学》杂志上发表《作为基因标识的绿色荧光蛋白》一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋白投入实验室应用。 钱永健在1995年完成的单点突变S65T(Thr取代Ser65 ）。这个突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。而F64L(Leu 取代Phe64)点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力，综上就产生了增强型GFP，也就是我们常见的EGFP。 2、GFP荧光蛋白的应用 GFP已被广泛应用于：细胞内分子标记、药物筛选、融合抗体基因表达检测、分子间相互作用等。 GFP具有如下特性：GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白能力比荧光素（fluorescein）强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定. GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复.而一些弱还原剂并不影响GFP荧光.中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等.GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析.但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白.由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的.

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达 吴晓薇;徐成刚;马保华;江经纬;叶贺佳;区燕宜;徐小芹;廖明 【摘要】参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列，设计1对引物，采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly（不含有信号肽部分），得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后，将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a—sH1y，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导，将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示，Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达，表达产物分子质量约为65%In this study, the Hly gene ofListeria monocytogenes train C53005 was amplified by PCR using designed primers. Then, the gene was cloned into pMD18-T vector, and indentified by digestion with restriction endonuclease, PCR and sequencing. After the sequenc 【期刊名称】《中国动物检疫》 【年(卷),期】2011(028)008 【总页数】5页(P46-50) 【关键词】单核细胞增生性李斯特氏菌;溶血素基因;克隆;原核表达 【作者】吴晓薇;徐成刚;马保华;江经纬;叶贺佳;区燕宜;徐小芹;廖明 【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;南海出入境检验检疫局,广东佛山528200;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学

核酸探针技术在食品检测中的应用

科目：食品生物技术导论 学院：化学生物与材料科学学院专业：生物技术 班级：090551 学号：09055106 姓名：黄菁

核酸探针技术在食品检测中的应用 摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备方法以及在食品检测中的应用及发展方向。 关键词：食品检测核酸探针基因工程 The nucleic acid probe of the application of the technique in food testing Abstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of introduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in food testing and development direction. Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering 正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义 食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。 生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。 生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。 二、核酸探针技术 化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互

生物选修三测试题

生物选修三测试题 1.从基因文库中获取目的基因的依据是基因的核苷酸序列 和功能。 2.在基因表达载体的构建中，不正确的说法是所有基因表 达载体的构建是完全相同的。 3.通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受 体细胞是大肠杆菌。 4.该生物制品公司生产干扰素的方法是基因工程。 5.科学家将β-干扰素基因进行定点突变导入大肠杆菌表达，使干扰素第17位的半胱氨酸改变成丝氨酸，这是蛋白质工程 技术。 6.动物细胞体外培养需要满足无毒、无菌、合成培养基需 加血清、血浆、温度与动物体温相近、需要O2，不需要CO2 和CO2能调节培养液pH这些条件。 7.蛋白质工程的基本流程是蛋白质分子结构设计、DNA 合成、预期蛋白质功能、据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列。 8.要合成自然界中不存在的蛋白质，首先应设计氨基酸序列。

9.目前成功的蛋白质工程包括对胰岛素进行改造，生产速效型药品和生产体外耐保存的干扰素等。 10.动物细胞工程技术的基础是动物细胞培养。 11.关于细胞全能性的理解不确切的是高度分化的植物体细胞仍具有全能性，这是错误的理解。 B。细胞内含有个体发育所需的全部基因，这使得细胞具有全能性的内在条件。 C。试管苗是植物细胞在一定条件下表现全能性的结果，通过植物组织培养得到。 D。动物体细胞也具有全能性，这得以证明是通过动物细胞培养获得细胞株或细胞系。 12.D。 13.A。限制性核酸内切酶专一识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点进行切割。 14.C。与限制性核酸内切酶作用部位完全相同的酶是DNA连接酶。

15.B。细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因，这个抗性基因的主要作用是有利于对目的基因是否导入进行检测。 16.B。基因工程的正确操作步骤是②将目的基因导入受体细胞④获取目的基因①构建基因表达载体③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求。 17.D。将目的基因导入微生物细胞之前，要用Ca2+处理 细胞，处理过的细胞叫做接受态细胞。 18.C。质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子，作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选 择的标记基因。 19.B。PCR技术的原理是在生物体外复制特定的DNA片段，不是DNA双链复制。 20.C。DNA连接酶缝合的部位是DNA双链上的磷酸二酯键。

高中生物选修3知识点总结(全)

选修3易考知识点背诵 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间 的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间 的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末 端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 （1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 （3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反 转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理：DNA双链复制 （2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建 1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

单核细胞增生性李斯特菌作为肿瘤疫苗运送载体的研究进展

单核细胞增生性李斯特菌作为肿瘤疫苗运送载体的研究进展段斐斐;殷月兰;康美琴;谈卫军;陶成武;潘志明;黄金林;焦新安 【摘要】单核细胞增生性李斯特菌是一种兼性胞内寄生菌，能直接感染抗原递呈细胞，使所运送的外源抗原可以同时进入M HCⅠ类和M HCⅡ类抗原递呈途径，从而诱导强烈的CD＋8 T 细胞和CD＋4 T 细胞免疫应答。目前，减毒李斯特菌作为一种新型的活疫苗载体，在运送宫颈癌、黑色素瘤等肿瘤相关抗原方面业已取得较好的免疫保护效果，在抗肿瘤治疗中显示出诱人的前景。本文综述了单核细胞增生性李斯特菌的免疫应答特性及其作为治疗性肿瘤疫苗载体的相关研究进 展。%Listeriamonocytogenes is a facultative intracellular bacterium that enters professional antigen presenting cells , presents passenger antigens to the major histocompatibility complex class I and II pathways ,then elicits CD+4 and CD+8 T-cell-mediated immune responses .It was demonstrated that attenuated Listeriamonocytogenes as a novel live vaccine vector in deliv-ering tumor antigens of cervical cancer and melanoma etc .,could induce strong protective immune response ,and shows effec-tive antitumor immunotherapeutics .This review discussed the characteristics of immune responses elicited by Listeria monocy-togenes ,and the progress of its antitumor immunotherapeutics as delivery vaccine vector . 【期刊名称】《中国人兽共患病学报》 【年(卷),期】2014(000)007 【总页数】5页(P743-746,752)

抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定

抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步 鉴定 作者：董慧, 焦新安, 殷月兰, 潘志明, 黄金林 【摘要】目的: 研制抗李斯特菌溶血素(LLO)的单克隆抗体(mAb)。方法: 通过诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX6p1hly), 以SDS PAGE分离菌体蛋白, 切割目的蛋白LLO GST条带, 研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠, 取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。利用亲和层析法纯化目的蛋白, 作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定腹水效价, Dot ELISA、 Western blot分析mAb的特异性。结果: 获得3株稳定分泌抗LLO mAb的杂交瘤细胞株3B6、 4D1、5D10, 其Ig亚类均为IgG1。3B6、 4D1、 5D10腹水的ELISA效价分别为1∶2×105、 1∶2×105、 1∶1×105。Western blot试验中, 3株mAb均能与融合蛋白LLO GST发生反应出现特异性条带, 而与纯化蛋白GST不反应。在Dot ELISA试验中, 3株mAb均能与表达LLO 的细菌发生特异性反应。结果表明, mAb 3B6、 4D1、 5D10是针对LLO 的特异性mAb。结论: 成功地制备了抗LLO的mAb, 为进一步研究LLO 的生物学特性、产单核细胞李斯特菌的致病机制, 以及建立产单核细胞李斯特菌(LM)快速检测技术奠定了基础。 【关键词】李斯特菌溶血素产单核细胞李斯特菌单克隆抗体

[Abstract] AIM: To prepare the monoclonal antibodies (mAbs) against listeriolysin O (LLO), which is the major virulence factor of Listeria monocytogenes. METHODS: The BALB/c mice were immunized with the SDS PAGE product of BL21(pGEX 6p1hly). The purified LLO GST protein was used as antigen for detection. mAbs against LLO were prepared by using the lymphocyte hybridoma technique. The specificity of mAbs was characterized by Dot ELISA and Western blot. RESULTS: Three hybridoma cell lines named 3B6, 4D1 and 5D10 secreting mAbs against LLO were obtained. The immunoglobulin subclasses of the mAbs were IgG1. The ELISA titer of the ascitic fluids of 3B6, 4D1 and 5D10 was 1∶200000, 1∶200000 and 1∶100000, respectively. Western blot analysis confirmed the three mAbs reacted on fusion protein LLO GST but didn’t react on protein GST. Dot ELISA proved the three mAbs only react on the bacteria expressing LLO. CONCLUSION: The successful preparation of three mAbs specific to protein LLO lays a foundation for further study of the biological characteristics of LLO and the pathogenesis of Listeria monocytogenes. [Keywords]listeriolysin O; Listeria monocytogenes; monoclonal antibody

新教材高考生物二轮复习大题分析与表达练7基因工程类大题突破含答案

大题分析与表达练7基因工程类大题突破 1.新型冠状病毒主要通过其表面刺突蛋白(S蛋白)与人体细胞膜上的ACE2蛋白结合实现感染。截至2021年4月12日,中国成为全球首个能提供三种生产新型冠状病毒疫苗技术路线(灭活疫苗、重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗)的国家。三种新型冠状病毒疫苗研发途径的技术原理如下:灭活疫苗是用各种理化方法灭活病原微生物及其代谢物,再通过纯化等步骤制备出相应疫苗;重组蛋白疫苗是将病毒的目标抗原基因整合到表达载体中,然后将表达载体转化到中国仓鼠卵巢细胞中,经诱导表达出大量的抗原蛋白,再通过纯化而得到的疫苗;腺病毒载体疫苗是以腺病毒作为载体,将目标抗原基因重组到载体病毒基因组中得到的疫苗。回答下列问题。 (1)上述灭活疫苗中的“灭活”是使新型冠状病毒失去,但并不破坏该病毒 的。 (2)制备重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗均需要获取S蛋白基因,获取过程是提取新型冠状病毒总RNA,在酶的作用下合成DNA,再采用PCR技术选择性扩增出S蛋白基因。PCR技术的前提是要有一段,以便根据这一序列设计出特异性的引物。 (3)腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因重组到改造后的腺病毒内,导入人体,在体内产生S蛋白,刺激人体产生相应抗体。改造后的腺病毒载体应具备的条件是(答出两点即可)。与重组蛋白疫苗相比,腺病毒载体疫苗的优点体现在。(4)腺病毒载体疫苗注入人体后,其发挥作用的机理是 。 2.基因工程抗体又称重组抗体,是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配,经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。下图为某研究所制备小鼠抗甲型肝炎病毒抗体的流程图。回答下列问题。 (1)实验室构建重组质粒时,为保证目的基因与载体的正确连接,过程①最好选择的限制酶 是。 (2)在重组质粒中,目的基因首端的启动子能够,从而驱动目的基因的转录。除启动子之外,重组质粒还应该包含等。 (3)为了筛选出导入目的基因的骨髓瘤细胞,可以在过程③的培养液中添加,过程③所获得的细胞具有的特点。 (4)临床试验发现,过程⑤提取的小鼠抗甲型肝炎病毒抗体具有外源性,容易被人体的免疫系统清除,从而导致其治疗效果大大降低。下页左上图抗体中的A区是与抗原特异性结合的区域,B区是引起人