氨基酸的分离鉴定纸层析法
氨基酸的分离鉴定纸层析法
引言：
氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。
一、纸层析法的原理
纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。
二、纸层析法的步骤
1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。
2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。
3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。
4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。
5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。
三、纸层析法的应用
1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。
2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。
3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。
四、纸层析法的优缺点
纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：
1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。
2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。
3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。
然而，纸层析法也存在一些缺点：
1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。
2. 定量精度较差：纸层析法的定量精度相对较差，适用于定性分析和快速筛查。
结论：
纸层析法作为一种简单而有效的氨基酸分离和鉴定方法，具有广泛的应用前景。通过纸层析法，可以对氨基酸进行组成分析、质量控制和生物代谢研究。然而，纸层析法的分离效果和定量精度还有待进一步提高。未来，我们可以结合其他方法，如高效液相色谱法等，来提高氨基酸的分离鉴定准确性和精确性，更好地满足科学研究和实际应用的需求。
氨基酸的分离鉴定纸层析法
氨基酸的分离鉴定纸层析法 引言： 氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。 一、纸层析法的原理 纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。 二、纸层析法的步骤 1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。 2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。 3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。 4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。
5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。 三、纸层析法的应用 1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。 2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。 3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。 四、纸层析法的优缺点 纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点： 1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。 2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。 3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。 然而，纸层析法也存在一些缺点： 1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。 2. 定量精度较差：纸层析法的定量精度相对较差，适用于定性分析和快速筛查。
氨基酸的分离鉴定——纸层析
氨基酸的分离鉴定——纸层析 氨基酸是构成蛋白质的基本单元，其在生物体内的作用极为重要。因此对氨基酸的分离和鉴定具有重要的研究意义。 纸层析是一种常用于分离和鉴定氨基酸的方法。其原理是利用氨基酸在纸层析板上的运动速度不同，根据氨基酸之间的相互作用，分离出各种氨基酸。 实验步骤： 1. 纸层析板的制备 将一张高分子量纸，如Whatman No.1滤纸，剪成所需要的大小，并用铅笔在纸上画出氨基酸移行的标线。 2. 氨基酸样品的制备 将所需的氨基酸样品溶解在适量的水中，浓度应为0.2-2%。 3. 样品的上样 将氨基酸溶液利用微量注射器沿着标线往上移行。 在上样后，将纸层析板放在带有盖子的玻璃罩中，罩中放置一些饱和度为70%的异丙醇-水溶液，保持相对湿度为70%，使其充分展开。 5. 鉴定氨基酸 将经过分离的氨基酸溶液阴性反应的氨基酸用二乙酰胺-丙酮混合溶液鉴定。将0.2ml 二乙酰胺-丙酮混合溶液加入几滴氨基酸样品中，加热60℃-80℃，5分钟。加入0.1ml氯仿，振荡混合，分离出上清液，上清液加入干燥瓶中，用喷雾器喷洒Ninhydrin试剂，加热于热水中1分钟，在冷水中快速降温附着氨基酸的部位呈现紫色。 注：二乙酰胺-丙酮混合溶液的组成为45%二乙酰胺，45％丙酮和10%水。 6. 结果的解释 根据氨基酸在纸层析板上的运动速度和比色反应的颜色，确定样品中的氨基酸种类及含量。 优点： 纸层析方法简便易行，无需昂贵的仪器设备，适用于小样品分析，能分离不同种类的氨基酸，并且结果清晰，操作简单。
限制： 纸层析分离结果受到氢键作用和酸碱度等因素的影响，需要控制好上样的数量和浓度。此外，纸层析无法分离胶原氨基酸和类似结构的氨基酸，且鉴定结果在颜色和色谱图谱方 面有些模糊。
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸 一、实验目的： 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、实验原理： 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用R f =原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离，在一定的条件下某 种物质的R f 值是常数。R f 值的大小与物质的结构、性质溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素 有关。 三、实验仪器、试剂和材料： 1、仪器：层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿、层析滤纸（新华一号）。 2、试剂和材料： 扩展剂：正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2 显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 氨基酸溶液：0.5%的赖氨酸、色氨酸、颉氨酸、丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分浓度均为0.5%）。 四、实验步骤： 1、将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。（放置20－30秒，盖上盖子） 2、取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张。在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔画一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号。 3、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在不同的位置上;干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米。 4、扩展：用线将滤纸缝成筒状（订书机），纸的两边不能接触。将盛有一定量扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，将滤纸直立于培养皿中。（滤纸不要贴住层析缸壁）（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm）。当溶剂展层至距离滤纸上沿约1cm时，取出滤纸。用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5、显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液；然后置烘箱中烘烤5分钟（100o C）或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6、计算各种氨基酸的Rf值并对Rf值按大小排序，是否与各氨基酸实际Rf值大小排序一致. 作业： 1、本实验操作过程中应注意哪些问题？ 2、影响R f值的主要因素是什么？
氨基酸的纸层析法
实验一氨基酸的纸层析法 一、目的 色层分析法已广泛地用于氨基酸、核酸、激素、维生素、糖类等的分离与分析。其优点是：能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质；设备简单，操作容易，样品用量少，结果也较准确。 本实验的目的在于掌握纸层析法的一般原理和操作技术。 二、原理 纸层析法是以滤纸作为支持物的分配层析法。分配层析法是利用物质在两种不同混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的。通常用@表示分配表示分配系数。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。 α=溶质在静止相的浓度（Cs）/溶质在流动相浓度（CL） 本实验层析溶剂是选用有机溶剂和水组成的。由于滤纸纤维与水有较强的亲和力（纸上有很多-OH基与水以氢键相连），吸附很多水分，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），因此使这部分水扩散作用降低形成静止相。层析时，将滤纸的亲和力很弱，可以在滤纸的毛细管中自由流动，便形成流动相。层析时，将滤纸一端浸入层析溶液中。有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其中的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。分配过程：一部分溶质随有机相移动离开原点而进入无溶质区，并重新分配，即一部分溶质从有机相又进入水相。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配，不断向前移动。各种物质因其分配系数的不同，在两相间分配系数就不同，分配系数小的溶质在流动相中分配的数量多，移动的速度慢。所以各种溶质在层析过程中由于移动的速度不同便可以彼此分开。 移动速度一般用移动速率Rf值表示： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 各种化合物在恒定条件下，经层析后都有其一定的Rf值，也就是说在层析谱中有一定的位置。借此可以达到定性、分离、鉴别的目的。 Rf值决定于很多因素，其中最主要的是所分离物质的分配系数。物质的分配系数是由以下因素决定的： （1）物质极性的大小。水的极性很强，一般极性强的物质就容易进入水相，非极性的物质易进入有机溶剂中。例如侧链含-OH和-NH2、-COOH较多的氨基酸易分配在水相中，Rf 值较小；而含非极性基（如-CH3）较多的物质其分子的极性降低，Rf值增大。 （2）滤纸的质地以及为水分饱和的程度。滤纸的质地必须均一、纯净、厚薄适当，具有一定的机械强度，层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。 （3）溶剂的纯度、PH值和含水量。PH值和含水量改变可使氨基酸和层析溶剂极性改变，Rf值也随之改变。 （4）层析的温度和时间。温度改变使溶剂中有机相含水量改变，Rf值也改变。当所有条件相同时，层析时间短，则Rf值小。 因此，在层析过程中，对以上影响Rf值的因素必须严格控制。 三、实验材料、仪器和试剂 1．实验材料：在25C温箱中萌发2-3天的绿豆芽。 2．仪器： （1）恒温水浴1台 （2）烘箱1个 （3）研钵1个 （4）三角瓶1个
1、氨基酸的分离鉴定--纸层析法
实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法 一、目的： 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理： 层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动 相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。 层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般 化学方法难以分离的各种化合物。如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换 层析等。 纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性 鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一 中分离分析工具。纸层析属于分配层析法。分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个 互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的 羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使 这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经 过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而 进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶 质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因 而可以彼此分开。 纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。 在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。达到平衡时，这种物质在 两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数，用ａ表示）不同，使不同的氨基酸分布在 滤纸的不同位置上而得到分离。 一种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，也就是分配系数（）。
氨基酸的测定--纸层析法
【实验目的】 1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理 2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 层析分离技术是利用被分离的混合物中各组分物理化学的性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相（流动相和固定相）中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rat e of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值： 物质的移动速率以 R f 值表示： Rf=原点至层析点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离=X/ Y 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 【器材与试剂】 （一）器材 1. 层析缸 2. 点样毛细管 3. 小烧杯 4. 培养皿 5. 量筒 6. 喷雾器 7. 吹风机（或烘箱）8. 层析滤纸（新华一号）9. 直尺及铅笔 (二) 试剂 1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液) 2. 氨基酸溶液 3. 显色剂:茚三酮溶液 【实验步骤】 1.准备滤纸:在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，间隔2㎝作一记号。 2.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在标记的位置上，点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在 0.3cm 之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次,重复2～3次。 3.扩展：层析缸中加入30ml扩展剂，将缝成筒状的滤纸直立其中,采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端 1 cm 时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。用铅笔描出溶剂前沿界线，吹干。 4.显色：滤纸表面均匀喷上茚三酮溶液，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤纸用热风吹干或置烘箱中（100℃）烘烤5min。 5.结果:用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 R f 值，与标准氨基酸的 R f 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。 计算：各种氨基酸的Rf值。 注意事项：
氨基酸的纸层析法
氨基酸的纸层析法 实验目的】通过氨基酸的分离1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，纸层析所用展层溶剂大多由有机溶剂和水组成。其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。因为滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，溶剂由下向上移动的称上行法；由上向下移动的称下行法。这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，即不同的氨基酸在相同的溶剂中溶解度不同, 所以利用在滤纸上迁移速度不同分离氨基酸不同，氨基酸随流动相移动的速率就不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上而形成距原点距离不等的层析点。。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：即原点到层析点中心的距离/原点到溶液前沿的距离 Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。在一定条件下，某种物质的Rf值是常数。 本实验采用纸层析法分离氨基酸。氨基酸是无色的，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 【器材与试剂】
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸 一、前言 1、分离氨基酸的主要方法： (1) 离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤.离子交换法也有自身的局限性，由于离子交换法是利用氨基酸等电点的不同，所以当两个或者多个氨基酸的等电点相近时，便无法分离，另外，氨基酸在树脂当中扩散速度较快，就要求料液的流速也相对较慢，这样自然造成了分离的缓慢，离子交换本身的生产原理也决定了反应难以连续还进行，这给工厂自动化生产带来影响，难以大规模地推广。 (2)沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。
现在较为成熟的分离方法有精氨酸与苯甲醛在低温条件下，缩合成溶解度小的苯亚甲基精氨酸，从而析出沉淀，析出的沉淀用盐酸处理即可分离得到目标氨基酸精氨酸的盐酸盐；亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应，可生成亮氨酸的磺酸盐。沉淀法的优点是方法简单，选择性强，但是缺点同样明显，沉淀剂回收困难，造成废液排放污染加剧。(3) 萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法等。其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。 (5)电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。电透析主要有毛细电透析等方法，通过这种方法可以高效而精确地分离氨基酸。 2、纸层析法的优缺点： （1）优点：操作简单，便于掌握；显色均匀，便于定量和半定量分析。
氨基酸的鉴定(纸层析法)
氨基酸的鉴定(纸层析法) 1、掌握纸层析法的基本原理 2、通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并学会分析未知样品中的氨基酸组分。实验原理： 1、层析法又称色谱法(Chromatography)，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附办、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。操作方式: 纸层析、薄层层析、柱层析等。分离机理: 分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。 2、纸层析法是用滤纸作为情性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂(流动相) 沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示：
3、在一定条件下，物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 4、本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。试剂： 1、酸性展层剂正丁醇：88%甲酸:水=15:3:2
纸层析法分离鉴定氨基酸
纸层析法分离鉴定氨基酸 纸层析法是一种常用的分离和纯化化学物质的实验方法，被广泛应用于有机合成、生 物化学和食品科学等领域。本文将介绍纸层析法在氨基酸分析中的应用。 一、实验原理 氨基酸的分离和鉴定是生物化学实验中常用的手段。氨基酸分子中含有羧基和氨基， 可以通过纸层析法实现其分离。纸层析法是一种基于物质分子间不同的吸附性能而进行分 离的方法。在纸层析实验中，将试样涂在纸层析片（通常为滤纸）的一侧，并将其放入溶 剂（通常为水、丙酮、甲醇等）中，溶剂会沿纸层析片向上移动，分离出不同物质组分。 氨基酸分子的羧基和氨基分别具有不同的亲水性和疏水性，因此在纸层析分离中会表 现出不同的吸附行为。例如，疏水性较强的疏水基团会被生物样品或溶剂吸附，从而较慢 地从纸层析片上移动，这些氨基酸通常出现在较高位置；而亲水性较强的羧基团则会被水 吸附，因此移动速度较快，这些氨基酸通常出现在较低位置。 二、实验步骤 1、制备样品：取大约1mg的氨基酸标准品或被测样品，加入1mL的去离子水中，并轻轻搅拌，制成1mmol/L的溶液。 2、制备纸层析片：取一张长约50cm的滤纸，将其叠成4层，然后将中间部分剪成 30cm的长条，每条的宽度为1cm左右，用铅笔在底部标记出位置，离开1cm到1.5cm的距离。 3、涂样：在每个标记位置上滴加不同氨基酸溶液，每次加约5µL。所有样品均按照氨基酸的相对极性从小到大进行涂样，从左到右编号，以便于鉴定。 4、溶剂选择：选择一种适宜的溶剂，通常为水、丙酮、甲醇等。将滤纸上端放入溶 剂中，约1cm左右的位置即可。 5、开始实验：用三角架和夹子将滤纸张贴在玻璃板上，使其呈现较小的倾斜面。在 滤纸的底部悬挂一张白纸，以便于观察样品在纸层析上的位置变化。待溶剂无法再升高时，实验结束。 6、结果读取：按照行（从上到下）顺序，观察样品的移动距离。 三、实验结果及分析 纸层析法可以分离并识别出存在于试样中的氨基酸分子，在实验中，通过观察样品从 纸层析片底部开始向上移动的情况，可以确认每个氨基酸的相对位置和含量。根据与标准
实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法
实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法 实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法 【实验目的】 1.学习氨基酸纸层析法的基本原理 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm 的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值： 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 【器材与试剂】 （一）器材 1.层析缸 2.点样毛细管 3.小烧杯 4.培养皿
5.量筒 6.喷雾器 7.吹风机（或烘箱） 8.层析滤纸（新华一号） 9.直尺及铅笔 (二) 试剂 1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液) 将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。 2. 氨基酸溶液 0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）。? 3. 显色剂 0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 【实验步骤】 1.准备滤纸 取层析滤纸（长22㎝、宽14㎝）一张，在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔3㎝作一记号，如右图所示。 2.点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上，干后重复点样2～3次。每点在纸上扩散
氨基酸的分离与鉴定
实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法 目的要求 （1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。 （2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。 原理 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示： 溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。 本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。 试剂和器材 一、试剂 （1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。 （2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。 （3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。 （4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38 硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。 正丁醇（需重蒸），95%乙醇，88%甲酸，12%氨水（因氨易挥发，稀释前需测出毕重）。 0.5%茚三酮丙酮溶液。 二、器材 新华中速薄层析滤纸，层析缸（高约430mm，直径约290mm，具有磨口盖子），鼓风恒温箱，国产72型分光光度计，水浴锅，喷雾器，电吹风机，点样架，点样管，加溶剂的漏斗，针、线和尺子，橡皮（或线）手套，结晶皿。
实验六 氨基酸的纸层析法
氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。
氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离（纸层析法） 一、实验原理 1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。 操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 溶质在固定相中的浓度 分配系数 溶质在流动相中的浓度 物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示： 原点到层析点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，值是常数，故可根据值作定性依据。氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。
三、实验试剂 1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2 2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。 戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色 将滤纸卷成圆筒形，用钉书针固定成圆筒状，纸的两边不能接触。 将滤纸垂直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析缸盖（点样点的一端朝下，展层剂液面需低于点样线1cm左右）。 待溶液前沿线距滤纸末端1~2cm（展层长度10cm，约2h）后，取出滤纸（需带上手套），用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹干（通风橱中进行），即可看见层析斑点。 3、结果处理 用铅笔将层析图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到层析前沿的距离，计算各种标准氨基酸的值，并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。
实验三 氨基酸的分离鉴定
实验三氨基酸的分离鉴定—纸层析法 一、实验目的 通过对氨基酸的分离，学习运用纸层析法分离混合物的基本原理，掌握纸层析的操作方法。 二、实验原理 纸层析从层析原理来讲属于分配层析，它是以纸作固定相的载体，纸纤维上的羟基具有亲水性，因此滤纸吸附的水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。 将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展开，样品中的各种溶质（如氨基酸）即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，因此不同的溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。 溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示： Rf＝原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 只要条件（如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等）不变，Rf值是常数。故可根据Rf值作定性分析。无色物质的纸层析图谱可用显色法鉴定，氨基酸纸层析图谱常用茚三酮作为显色剂。 三、仪器与试剂 （一）实验器材 大烧杯（1个）、毛细管（10支）、喷雾器（公用）、培养皿（1个）、层析滤纸（2张）、烘箱、镊子（1把）、刻度尺、铅笔、针线、手套 （二）实验试剂 1、扩展剂：是4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。 2、氨基酸溶液：0.5％缬氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸、甘氨酸溶液：分别称取上述5种氨基酸各0.5g，分别溶于20ml蒸馏水中，测其pH值并用5％KOH或HCl调至中性，然后用pH7.40.01mol/L磷酸缓冲液稀释至100ml。PH7.4时Na2HPO4溶液与NaH2PO4溶液的体积比为81∶19。 样品1：用等量的组氨酸、谷氨酸、亮氨酸溶液混合。 样品2：用等量的缬氨酸、甘氨酸溶液混合。 3、显色剂：50~100mL 0.5%水合茚三铜正丁醇容液。 四、操作步聚 1.检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内100℃烘干。
纸层析法—氨基酸的分离与鉴定
纸层析法——氨基酸的分离与鉴定 一、 实验目的 1、 了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、 实验原理 1、 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团，滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。 2、 所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH ）与氨基（—NH 2），唯一的不同则在于R 基团。因此R 基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R 基团分别是—CH 3，—CH 2—C 6H 5，—CH 2—COOH ，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 3、 Rf 值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件下，Rf 值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH 值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。 4、 显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。 Y X R f ==原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距
三、试剂 （一）提前配制试剂 8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。 8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。 8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。（将上述三种溶液装于小瓶中实验时，每两组共用一组试剂） 正丁醇 88%甲酸 蒸馏水 茚三酮晶体 注：实验时，以上试剂均为每两组同学共用一组试剂。 （二）当堂配制试剂 丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸的混合液:将上述溶液等体积混合即可 四、实验仪器 每组： 钟罩：1 试管：15mm*10cm *5 试管架：1 培养皿：95mm*1 移液管：10ml *1 洗耳球：1 小烧杯：25ml *2 （可以用其他小规格的烧杯如20,10,8ml的代替）100ml*1 滤纸：15cm*15cm *1 铅笔：1 直尺：1 毛细吸管：4 保鲜膜：1 细玻璃棒：1 公用： 电吹风：3 酒精灯：3 订书机：3 电子天平或分析天平：3 称量纸：若干烘箱：1