染色体G显带操作规程

染色体G显带操作规程

1.目的：规范细胞遗传（外周血）诊断的操作过程，以保证结果的准确、可靠。

2.应用范围：外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。

3.职责：

3.1文件编写：实验室技术员。

3.2文件审核：科室负责人。

3.3文件审批：实验室主任。

3.4执行：细胞遗传室的所有工作人员。

4.内容：

4.1实验原理：

4.1.1．淋巴细胞的体外培养

4.1.1.1．外周血（脐带血）中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。

4.1.1.2．离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期：DNA合成前期（G1期），约10～24h，为RNA和细胞质的合成；DNA合成期（S期）约为7h，在G1期的基础上，完成DNA的合成；DNA合成后期（G2期）约为4～6h，为后期RNA和细胞质的合成，活跃的RNA和微管蛋白等合成；细胞分裂期（M期）约为1.5h，又分为分裂前期、中期、后期和末期。

4.1.1.3．培养基分为天然培养基和人工培养基两种；实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基，主要由RPMI1640和牛血清混合而成。另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固，平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH，双抗（链霉素和青霉素）用于抑制细菌的生长等。

4.1.2．纺锤体的抑止

4.1.2.1．在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。因此，破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，不再粘附至细胞内任何结合力上，在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很容易铺展开来。细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管由微管蛋白组成，微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种，α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常呈二聚体形式存在。其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位，秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。但是这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂，因此它可使分裂的细胞停留在中期，获得大量分裂相，以供分析之用。

4.1.2.2．秋水仙素（colchicum）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中取出来，故名。分子式C22H25O6N，纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这样的有丝分裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成两个子细胞，因而染色体加倍。秋水仙素是一种三环结构化合物，第2和第3个环均是7元环。它是甲基醚的类似物，包含4个甲氧基，1个乙酰化的初级氨基以及3个非苯型双键。秋水仙素分子的第一个环上由三个甲氧基，这是作用活性不可缺少的反应基团；第二个环内的氨基被酯化，从而可增加其活性；第三个环的水合基团被甲基取代。正因为如此，秋水仙素不仅易溶于水，而且即便所用的浓度极低，其反应活性仍很高。

4.1.3．低渗

4.1.3.1．细胞经过秋水仙素处理后，尽管染色体已经比较适合观察了，但仍还不能满足要求，因为人类细胞的染色体数目多，形状小，最大的染色体约为7～8微米，加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平面上，这些均有赖于低渗处理。覆盖在染色体上的核仁物质大大地阻碍着染色体的分散，低渗液的渗透作用不仅可使粘附于染色体的核仁物质散开，清楚地显示每一个扭曲的染色体，而且还可以使细胞膨胀，染色体铺展。

4.1.3.2．低渗溶液是指渗透压和离子强度均低的溶液。可以是水，低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol／L）、氯化钾（0.075mol／L）、稀释的平衡盐溶液或培养基。处理的时间一般为20～40min，处理时的温度为23～37℃。早期研究中多用柠檬酸钠或柠檬酸钾作为低渗液，也有些学者使用稀释的人血清。自从1965年后，人们改用0.075mol／L的KCl作为低渗液，它可以使染色体的轮廓清楚，可染色性增强，染色时间缩短。在相差显微镜下观察，KCl低渗处理标本的效果比其他低渗液更好，也适用于显微分光光度分析，当用显带染色时充分显示带型的特点。

4.1.4．固定

4.1.4.1．固定是将组织细胞或其成分选择性地固定于某一特定阶段的过程，其目的是在杀死细胞的同时避免所研究成分受到破坏。就细胞遗传学研究而言，固定的目的是在于提高染色体结构的可见性和显示染色体形态的细节，例如显示常染色质区和异染色质区，初级缢痕和次级缢痕等。

4.1.4.1.1．经秋水仙素处理后的细胞虽可用各种不同的固定液（金属固定液或非金属固定液）予以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织细胞上冲洗掉，否则，沉积在细胞表面的秋水仙素会影响染色体的形态，还会阻碍固定液穿透性。为此，在低渗处理后，应尽早加入固定液进行预固定。固定剂可迅速地穿透细胞，并将细胞瞬间杀死，使正在分裂的细胞立即阻留在各自特定的细胞周期时相上，否则原有的M期细胞的核分裂会继续下去，染色体松解为染色质，导致研究无法进行。另外，预固定可使细胞都处于相同

的固定微环境中，这样固定收获的细胞不会凝结在一起。

4.1.4.1.2．为使染色体结构不受破坏，提高染色体的可见性及染色体的嗜碱性，就需要是染色质物质沉淀。在活体条件下，细胞内不同成分的折射系数之间相差较小，在显微镜下不能分辨出明显的染色体结构；随着核蛋白的凝结和沉淀，染色体的折射系数将会发生很大的变化，从而使它们在细胞内成为明显的小体。因此迄今所用的固定剂都具有交联蛋白的特性，都能使染色质沉淀。常用的染色体固定剂往往是数种化学物的混合物，其中至少有一种化学物必须具备这一特性。

4.1.4.1.3．随着细胞的死亡而出现的另一些变化（特别是蛋白质的自溶作用），往往会破坏染色体的原来结构。在正常情况下，细胞内的酶参与蛋白质的合成，而当细胞死亡时，由于介质变为酸性，这些酶便在相反方向起作用，即使是复合蛋白质裂解为简单的氨基酸也是如此。因为多肽是染色体的主要成分之一，所以，这种变性效应最终引起染色体结构的破坏。因此，作为一种固定剂也应能防止蛋白质的自溶作用。此外，在细胞致死的同时，细菌的活动猖獗致使细胞内成分的分解。因此一种好的固定剂当既能起到防腐作用，又能阻止这种分解作用。

4.1.4.1.4．理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即能增强染色体的嗜碱性。显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此，哪怕是最佳的固定剂，仍难免有不足之处。首先细胞被杀死后发生的一些变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分，最后，即便是操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变。此外，有一些化学物还会导致细胞的皱缩。

4.1.4.2．用作固定剂的化合物又可分为非金属的和金属的两大类。前者如乙醇、甲醇、醋酸、甲醛、丙酸、苦味酸和氯仿等；后者如铬酸、锇酸、氯化铂、氯化汞、硝酸铀和醋酸镧等。其中有几种化合物还可作为蒸汽固定剂（Vapour fixative），也即在接触水或其它溶剂之前使可溶性物质先转变为不溶性物质，这样就可以在原位制作标本。另外，按照正在细胞内沉淀蛋白质的特性不同，又可把固定剂分成沉淀性和非沉淀性两种。沉淀性固定剂如铬酸、氯化汞和乙醇等，非沉淀性固定剂如四氧化锇、重铬酸钾等。

4.1.4.2.1．醋酸是一种理想的染色体的固定剂，它能使核酸沉淀，使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于破坏。经醋酸固定的物质还能抵消乙醇的硬化作用。它可使染色体结构保持完整，且多半不致破坏核蛋白。这种固定剂的一个缺点是会导致染色体片段的过分膨胀，因此如果要研究染色体的详细结构，必须把它与乙醇或类似的化合物一道使用，后者能使组织收缩和硬化。醋酸作为固定液中的一种成分具有以下优点：①可以与迄今所用的任何一种固定剂同时使用；②浓度可以很低或很高；③具有很强的穿透性能。此外，醋酸还是苯胺类染料的一种优良溶剂。因此它是染料和固定液混合物中必需的一种成分，例如醋酸-洋红、醋酸-奥辛和醋酸-间苯二酚蓝等

4.1.4.2.2．甲醇是焦木酸的一种成分，从木材分解蒸馏制得，广泛地用于动物染色体的固定。它可以使蛋白质沉淀，还具有脱水性，可使蛋白质出现不可逆转的变性，使组织硬化，但其不能有效地固定染色体，易被氧化剂氧化成甲酸，故不能与氧化剂共存。甲酸是一种无色有毒的液体且可以任何比例与水混合。4.1.4.2.3．乙醇的有效浓度与甲醇一样。它和甲醇一样可以使蛋白质沉淀，还具有脱水性。可使蛋白质出现不可逆转的变性，使组织硬化。但是在有氧化剂存在时乙醇会很快被氧化为乙醛，并进而变成醋酸。它最重要的优点是能够迅速地穿透人组织。因此，乙醇也被广泛地用作染色体固定剂的一种成分。乙醇不能与许多金属固定剂（铬酸或四氧化锇）相混用，否则会被氧化。此外乙醇不能有效地固定染色质，原则上也不能与醋酸、甲醛或氯仿混合使用。但是如果要对染色体的酶进行研究时，可以用80%冷乙醇固定1h 或更多时间；如用于单层培养物，往往以纯乙醇或95%的乙醇固定1～15min，因为酶的反应基团一般是不受乙醇破坏的。

4.1.4.2.4．1886年Carnoy首先用醋酸、乙醇混合作为固定剂，故名为卡诺固定液。其特点是穿透快，且很利于染色体结构的研究。目前常用的卡诺固定液是由1份冰醋酸和3份甲醇混合而成的。所有的动植物和人类染色体的固定都可以用卡诺固定液，固定时间为15min至24h，温度为室温或稍冷。随着醋酸比例的增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展，因此必要时可以改变酸和醇的比例，例如改成1:2或1:4等，但是如果过度膨胀则会导致细胞破碎，反而不利于分析。卡诺固定液中缺乏有助于染色体嗜碱性的金属成分，因此经这种方式固定的组织不能被许多碱性染料的水溶液染上色，除非使用一些特殊的媒染剂如铬酸。

4.1.5．制片

4.1.

5.1．固定完成后就进入制片阶段。早期多采用涂片法、挤压法，后来很快被气干法取代，现今气干法在哺乳类和人类细胞遗传学中广泛应用。

4.1.

5.2．涂片法（smear）：细胞是在固定之前就铺展到载玻片上的，而且无需什么处理便可使细胞分散开，整个操作迅速，很适于精细观察。

4.1.

5.3．挤压法（squashing）：需要在固定或染色之后给以特殊的处理，然后放上盖玻片加压，如此方能从结实的细胞团块得到散开的细胞。但标本会临时性和逐步性变质，且操作不是很方便。

4.1.

5.4．气干法（air drying）：主要用于那些容易做成细胞悬液的组织，例如骨髓、外周血淋巴细胞、腹水和生殖上皮细胞等。所制片的染色体铺展较好，且处于同一焦平面上，操作较为简单，标本上的细胞密度较高，便于观察与分析。

4.1.6．染色

4.1.6.1．染色体的结构和行为只能在显微镜下进行研究。鉴于休止期的细胞核和分裂中的染色体折光指数差别甚小，未染色的标本在普通显微镜下很难予以观察，所以需要相差显微镜观察。但是在相差显微镜

下也不能完全显示染色体结构的细节，因此即便是在现在，染色的标本比未染色的标本在有效性和广泛性上仍占有很大的优势，虽然染色的标本也有其局限性。大多数的酸性染料是钾盐或钠盐，而碱性染料大多数是氯化物或硫酸盐。为了使染色体染色，应用碱性染料，因为染色质是强酸性的。酸性染料可以使碱性的细胞质着色。“嗜碱性”和“嗜酸性”这两个术语就是指对碱性或酸性染料的亲和力而言的。所以说染色体是嗜碱性的，而细胞质是嗜酸性的。

4.1.6.2．Gustav Giemsa在探讨Romanowsky染料中的有关因子时，发现其甲基蓝的降价产物——甲基天青与染色质着色有关，而伊红则是通过已参与有天青的染色质相结合而引起作用的。那时他为了改善染色的质量先把天青和甲基蓝等量混合，最后选用天青、伊红、甘油和甲醇的混合物。而这种染料最初是为使血片中疟原虫染色而设计的。经典的细胞遗传学家总是用醋酸奥辛、醋酸洋红、龙胆紫、苏木精和其它染料是染色体标本着色的，几乎不用Giemsa染色；只有血液学家才用它来染色血液和骨髓标本。直到1960年Moorhead等建立人体外周血淋巴细胞体外培养制备染色体标本的方法，很自然地想起用Giemsa染色这些细胞标本，且取得了非常好的效果。从此以后，实际上几乎所有的人类和哺乳类细胞遗传学家都按此照办了。

4.1.6.3．Giemsa不是一种单一的染料，而是数种染料的混合物，它们是甲基蓝及其氧化产物——天青（azure）和伊红Y。其染色的质量随所用染料的比例不同而异。天青A和天青B都是噻嗪系列的成员，是甲基蓝和重铬酸钾一起氧化的产物。天青A是一种碱性染料，分子式C14H14N3SCl，分子量为291.799。它对染色质DNA的反应恰巧与雪夫试剂一样，实际上也是一种醛反应，所以它不仅可取代碱性复红使染色体着色，而且染色体的色泽比碱性复红染色要明亮得多。此外，用天青A较为方便，价格也比天青B便宜。伊红Y本身是一种酸性染料，玫瑰红色，属于呫吨（xanthene）系列。Giemsa染料是由不同的噻嗪染料混合物（最重要的天青B）和曙红组成。染色体的着色有赖于在原位形成噻嗪-曙红（2:1）的沉淀物。着色过程首先是两个噻嗪分子与DNA结合，然后再与一个曙红分子结合；其次是需要有一个疏水环境，以利于染料沉淀物的累积。通过这一机理，着色的水平可达很高的密度，而对DNA的局部浓度则是不敏感的。因此，认为G显带是由于染色体结构的解旋而引起DNA的细微变异的假说是站不住脚的，尽管浓度-敏感染色法支持这一假说。

4.1.6.4．染色体DNA很易与染料结合，而且实际上是作为一种催化剂促使噻嗪-曙红沉淀物的形成，在这一过程中，DNA的量和质都没有什么影响。在染色体上高浓度的疏水蛋白区，容易形成噻嗪-曙红沉淀物，这些区段相当于含有高比例的二硫键交联的区段。这些二硫键在一定的位置或以适当的构型保留着各种疏水的染色体蛋白，而通过一系列的显带预处理就可以除去阴性G带区的疏水蛋白，或使它们的构型变成更为疏水的状态。上述推论似乎与已知的事实是不矛盾的，而且有证据表明，对于着色来说虽然DNA是必需的，但与产生的染色体带型有关的却是染色体蛋白质的差异。可以预料，在G显带中所抽提的

蛋白质是疏水性的，而且主要是抽提出阴性G带的蛋白质。目前普遍公认的G显带染色机制是：胰蛋白酶抽提了和DNA上富含GC碱基对区段相结合的蛋白质，以致降低了该区段和染料的亲和力，即呈浅带；反之，DNA上富含AT碱基对的区段和组蛋白结合紧密，胰酶处理时不易被抽提，故和染料有较强的亲和力，即呈深带。

4.2标本采集

4.2.1采集要求：以晨起空腹采集为佳。

4.2.2标本类型：肝素钠抗凝血。

4.2.3标本量：3ml

4.2.4储存容器：一次性无菌肝素钠抗凝管。

4.2.5标本保存：标本4℃～10℃，24小时内尽快送检。

4.2.6运送条件：于4℃～10℃环境中保存运送。

4.2.7标本拒收标准：

4.2.7.1 标本缺唯一性条形码标识；

4.2.7.2 标本量不足检测；

4.2.7.3 标本严重溶血、凝血、脂血、黄疸、污染；

4.2.7.4标本使用非肝素钠抗凝；

4.3.试剂与仪器

4.3.1试剂：

4.3.1.1试剂组成：

1640培养基，秋水仙素，甲醇，冰醋酸，KCL，胰蛋白酶，生理盐水，Giemsa粉，香柏油，无水乙醇等；

4.3.1.2储存和稳定性：

4.3.1.2.1 储存：1640培养基-20℃保存，秋水仙素，胰蛋白酶2℃～8℃保存，其它常温保存即可，切莫

倒置；

4.3.1.2.2 稳定性：未开封，可稳定至标明的保质期；开封后，2℃～8℃，可稳定1周。

4.3.1.2.3 使用方法：1640培养基，秋水仙素，生理盐水香柏油按照试剂说明书使用，甲醇，冰醋酸，

KCL,胰蛋白酶，Giemsa粉，无水乙醇等需配制后使用。

4.3.2 仪器：

CO2培养箱，超净台，恒温水浴箱，水平离心机，干燥箱，显微镜，细胞遗传自动分析系统，冰箱。

4.4质控程序

4.4.1对每批新到的培养基，对每个批号的培养基，必须要做过预实验后方可使用，并做好记录；

4.4.2对每批新到的甲醇和乙酸，必须要做过预实验后方可使用，并做好记录；

4.4.3对每批新到的秋水仙素，对每个批号的秋水仙素，必须要做过预实验后方可使用，并做好记录；4.5操作步骤：

4.5.1培养：将抽取好的外周血分别接种于两瓶培养液中（每瓶接种0.2－0.4ml左右），摇匀，置37℃

恒温培养箱内培养72小时（温差±1℃）。

4.5.2秋水仙素处理：培养至68-70小时之间，向培养液内加入秋水仙素2—4滴，使细胞分裂停在中期，

收获分裂相。

4.5.3收获细胞

4.5.3.1将培养72小时的两瓶培养物倒入1个离心管内，以1500rpm离心10分钟，弃上清，留下沉淀

细胞。

4.5.3.2低渗：向离心管内加入37℃预温的低渗液8ml，用滴管反复冲打分散细胞，置37℃水浴箱中低

渗处理25-30分钟。

4.5.3.3预固定：向低渗的细胞悬液内缓慢加入固定液（甲醇和乙酸按3：1的比例混合）1－2ml，轻轻混

匀后置室温下固定5分钟后，1500rpm离心10分钟，弃上清，留下沉淀细胞。

4.5.3.4固定：沿管壁缓慢加入固定液8ml，轻轻混匀后放37℃水浴箱固定，固定时间为30分钟，然后

1500rpm离心10分钟，弃上清，加入6ml固定液轻轻打匀后放4℃冰箱备用。

4.5.4制片

4.5.4.1以1500rpm离心10分钟，弃上清，留下沉淀细胞，重新加固定液0.5ml（加固定液的量根据沉

淀物的量和制片后细胞的分布情况调整），混匀后滴冰片，过酒精灯干燥。

4.5.4.2烤片：将制好的标本置60℃烤箱内过夜老化或80℃两个小时。

4.5.5显带与染色：取3个50ml立式染色缸，置37℃水浴中。染色缸Ⅰ加入生理盐水42ml，胰酶8ml，用tris10滴，混匀，PH值为7.0－7.2左右，用于细胞遗传消化显带。染色缸Ⅱ内加大约50m生理盐水，用于漂洗。染色缸Ⅲ内加入双蒸水45ml，染色液两管，混匀，用于染片。过程为：取老化的标本片置染色缸Ⅰ中，胰酶消化显带1分8秒，迅速取出置染色缸Ⅱ中，轻轻漂洗几次，放染色缸Ⅲ中染色3—5分钟，取出，用自来水冲洗，置烤箱中将玻片烤干。（实验条件可随实验环境变化而改变）。

4.5.6镜检：先于10倍显微镜下挑选分散好、大小适中的分裂相，然后在油镜下进行计数分析。每一标本

计数30个核型，至少分析5组核型，并画出三组核型。

4.6参考值：正常男性：46，XY 正常女性：46，XX

4.7临床意义：

细胞遗传是遗传物质的载体。其结构的改变导致基因连锁群的变化，从而引起一系列临床症状，即为细胞遗传异常综合征。即使是表型正常的携带者，其后代也可能表现出临床症状。人类细胞遗传的临床检查为探明某些疾病的病因、发病机理、诊断、治疗、预防和预后等提供科学依据。它涉及遗传学、血液学、肿瘤、环境因素引起的遗传损伤等多学科领域，为提高优生优育水平提供了实验依据。

4.8注意事项

4.8.1．在采血接种培养时，注意不要加入太多的肝素钠，因为肝素钠过多可能会导致溶血和抑制淋巴细胞的转化和分裂，但肝素钠量也不应过少，以免采血时发生凝血现象或培养物出现纤维蛋白形成的膜状结构。这种膜状结构一般在培养24h左右出现，此时可在无菌条件下将它除去，以免影响效果。血标本培养前在室温下放置不超过4h，在4℃冰箱内放置时间不超过24h。

4.8.2．在一般温箱内培养，必须将瓶口塞紧，以免培养液的pH值发生较大的变化。如果培养过程中，培养液酸化较严重（培养液呈黄色时）将不利于细胞生长，此时可加入适量无菌的0.14%NaHCO3溶液调正或再加入2～3ml培养液的办法来校正。培养箱的温度应控制在37±0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长，所以在一般温箱上附装一个精确的温控仪器是较理想的。

4.8.3．细胞培养失败的可能原因

4.8.3.1．所购置的培养液不合格，如PHA质量有问题，配液用水不合要求，pH过高或过低等。

4.8.3.2．无菌操作不符合要求，发生细菌污染。

4.8.3.3．一次性抗凝管不合格，被细菌污染，或采血的过程不符合要求等。

4.8.3.4．所采血液是细胞免疫水平低下患者或长期接受放疗、化疗后患者的血液。

4.8.4．细胞培养成功但制片失败的原因

4.8.4.1．秋水仙素处理不当：如秋水仙素质量有问题或秋水仙素的浓度、处理时间不够或处理不合适，结果分裂相少；如果秋水仙素浓度过高或处理时间过长，则使染色体过于缩短，难以进行分析。

4.8.4.2．低渗处理不当：低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，导致分裂细胞丢失，或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。

4.8.4.3．离心速度不合适：如果从培养瓶收集细胞进行离心时的速度太低，则细胞多被丢失，如果低渗后离心速度过高，则往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相多被丢失，以致制出的标本中分裂相少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。

4.8.4.4．标本固定不充分：如固定液不新鲜，或甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时，染色体形象模糊，染色体周围有胞浆背景。

4.8.4.5．玻片去油不彻底：玻片有油迹时，将使滴上的细胞悬液不能均匀分散，且将使细胞随液滴流动而丢失。

广州达安临床检验中心作业指导书编号：GZDA-SOP-XBYC-XM001

染色体G显带操作规程第四版

第9页共9页第4次修改4.8.4.6．玻片冷冻不够：合适的冰湿载玻片，从冰水中拿出时，玻片表面浮霜，如冷冻不

够则无此现象，此时细胞难以粘附而可能造成丢失。

染色体G显带操作规程

染色体G显带操作规程 1.目的：规范细胞遗传（外周血）诊断的操作过程，以保证结果的准确、可靠。 2.应用范围：外周血细胞遗传标准实验操作及核型分析。 3.职责： 3.1文件编写：实验室技术员。 3.2文件审核：科室负责人。 3.3文件审批：实验室主任。 3.4执行：细胞遗传室的所有工作人员。 4.内容： 4.1实验原理： 4.1.1．淋巴细胞的体外培养 4.1.1.1．外周血（脐带血）中的淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。 4.1.1.2．离体培养的人体淋巴细胞的有丝分裂周期分为四个时期：DNA合成前期（G1期），约10～24h，为RNA和细胞质的合成；DNA合成期（S期）约为7h，在G1期的基础上，完成DNA的合成；DNA合成后期（G2期）约为4～6h，为后期RNA和细胞质的合成，活跃的RNA和微管蛋白等合成；细胞分裂期（M期）约为1.5h，又分为分裂前期、中期、后期和末期。 4.1.1.3．培养基分为天然培养基和人工培养基两种；实验室常用的外周血淋巴细胞培养基为二者的混合培养基，主要由RPMI1640和牛血清混合而成。另外培养液中加有肝素钠用于防止血液的凝固，平衡盐溶液维持培养液的渗透压和pH，双抗（链霉素和青霉素）用于抑制细菌的生长等。 4.1.2．纺锤体的抑止 4.1.2.1．在细胞分裂时，随着纺锤体的形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。因此，破坏纺锤体，使染色体依然呈游离状态，不再粘附至细胞内任何结合力上，在随后制作标本时一旦受到压力，染色体就很容易铺展开来。细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管由微管蛋白组成，微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种，α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常呈二聚体形式存在。其中β微管蛋白肽链中第201位的半胱氨酸为秋水仙素与之结合的部位，秋水仙素与之结合后会引起微管解聚。故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。但是这一作用不影响染色体的复制和着丝粒的分裂，因此它可使分裂的细胞停留在中期，获得大量分裂相，以供分析之用。

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案

实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征 组别染色体序号形态，大小着丝点位置次缢痕随体

染色体实验原理

【实验原理】 染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。 一. 常规染色体核型分析 1．根据染色体的形态、大小及着丝粒的位置，将染色体分为七组。 A组染色体：包括1～3号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。 B组染色体：包括4～5号染色体，长度次于A组；亚中央着丝粒染色体，短臂较短。 C组染色体：包括6～12号和X染色体，中等长度，亚中央着丝粒染色体。 D组染色体：包括13～15号染色体，具有近端着丝粒和随体。 E组染色体：包括16～18号染色体，16号染色体着丝粒在 3/8处，17号和 18号染色体着丝粒约在 1/4处。 F组染色体：包括19号和20号染色体，中央着丝粒。 G组染色体：包括21号、22号和Y染色体，是染色体组中最小的，为近端着丝粒的染色体。21号和22号染色体具有随体。二．G显带染色体标本分析 G带显示的正常人显带核型特征（见附图1.1、1.2、1.3） A组染色体：包括1～3号染色体。长度最长，1号和3号染色体为中央着丝粒，2号染色体为亚中央着丝粒染色体。 1号染色体 短臂：在320条带左右的分裂相上，近侧段有两条深带，第2条深带稍宽；在处理好的标本上，远侧段可显出34条浅染的深带。此臂分为3个区，近侧的第1深带为2区1带，第2深带为3区1带。 长臂：副缢痕紧贴着丝粒，染色深浅不一，其远侧为一宽的浅带，近中段与远侧段各有两条深带，中段两条深带稍靠近，其中第2条染色较浓。此臂分为四个区，副缢痕远侧的浅带为2区1带，中段第2深带为3区1带，远侧段第1深带为4区1带。 2号染色体 短臂可见四条深带，中段的两条深带较靠近。此臂分为2个区，中段两条深带之间的浅带为2区1带。 长臂：有7条深带，第3和第4深带有时融合。此臂分为3个区．第2和第3深带之间的浅带为2区1带，第4和第5深带之间的浅带为3区1带。 3号染色体 着丝粒区浓染 短臂：在近侧段可见一条较宽的深带，远侧段可见两条深带，其中远侧的一条较

医院细胞遗传室高分辨染色体的制备与识别作业指导书

医院细胞遗传室高分辨染色体的制备与识别作业指导书 1目的 为获得具有550条带及850条带以上的染色体分裂相，从而以此为依据进行人类染色体高分辨分析。 2实验方法 手工显带法 3实验原理 正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的生长活跃、含有丝分裂细胞的细胞群，当细胞增殖到一定数量时，加入5-氟尿嘧啶和尿嘧啶核苷从而阻断DNA的合成，将其同步在S期。17个小时后加入胸腺嘧啶核苷（TDR）释放细胞，使细胞有丝分裂继续，进入分裂期后加入染色体缩短抑制剂溴乙锭（EB），并加入秋水仙胺破坏纺缍丝的形成，最终获得高分辨率染色体。 4性能特征 经G显带处理后可见550-850条显带。 5仪器及耗材

酒精灯，烧杯，天平，离心机，CO2培养箱，冰盒，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器（5ml），离心管，无菌吸管，量筒，培养瓶，试剂瓶等。 6试剂 5%的RPMI1640小牛血清培养基5ml；秋水仙素浓度：20μg/ml；低渗液：0.075mol/L的KCl溶液；卡诺固定液（甲醇:乙酸=3:1）；0.25% EDTA-trypsin；生理盐水；10-5M 5FU （五氟尿嘧啶) ；10-4M Uridine（尿嘧啶核苷）；1/15M KH2PO4；10-3M TDR（胸腺嘧啶）；1/15M Na2HPO4；1mg/ml EB （溴化乙锭）；2.5%胰酶；0.4%酚红。 7操作流程 7.1细胞培养 将0.25-0.3ml外周血入高分辨培养基；培养72小时后，加Frdu和尿嘧啶核苷各100μl；17小时后加TDR100μl；继续培养4小时加EB 50μl；45分钟后加秋水仙胺35μl10分钟后收获。 7.2细胞收获 7.2.1将细胞液移入15ml离心管，1500rpm×10min离心；去上清，加室温（20-25℃）0.075MKCL低渗液至6-8ml，于室温（20-25℃）低渗40min； 7.2.2加1.5ml固定剂，轻柔混匀； 7.2.21500rpm×10min离心，去上清，加固定液至8ml，轻

实验十 人类染色体G显带技术及G带核型分析

实验十人类染色体G显带技术及G带核型分析实验目的 1、初步掌握染色体G带标本的制备技术。 2、了解人类染色体的G显带的带型特征。 实验用品 1、材料：常规方法制备的中期人类染色体标本（标本片龄不超过30天为宜）。 2、器材：显微镜、恒温培养箱、烤箱、恒温水浴箱、冰箱、染色缸、小镊子、玻片架、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸。 3、试剂：0.125％胰蛋白酶溶液、0.02％EDTA溶液、胰蛋白酶一EDTA混合液、0.85％生理盐水、蒸馏水、Giemsa原液、Giemsa稀释液、1／15mol ／L磷酸缓冲液。 实验原理 人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T 带），G带是目前被广泛应用的一种带型。因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。 研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。关于G显带的机理目前有多种说法，例如，Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含GC多的染色体段则不易着色。总的来说，G显带的机理还未搞清。 内容与方法 一、人类染色体G显带标本制备 1、胰蛋白酶法 ①将常规制备的人染色体玻片标本（未染色的白片）置70℃烤箱中处理2小时，然后转入37℃培养箱中备用，一般在第3～7天进行显带。 ②取 2.5％的胰蛋白酶原液 2.5ml加生理盐水至50ml，配成0.125％的工作液并用NaHCO3调pH值至7左右。 ③将配好的胰蛋白酶工作液放入37℃水浴箱中预热。 ④将玻片标本浸入胰蛋白酶中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理1～2分钟（精确的时间自行摸索）。 ⑤立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗两次。 ⑥染色。将标本浸入37℃预温的Giemsa染液（1:10的Giemsa原液和pH6.8的磷酸缓

染色体分析-绒毛的培养

染色体分析－绒毛的培养 1 检验目的和方法 1.1检验项目：流产绒毛细胞染色体制备及分析。 1.2 检验方法:培养瓶法，G显带 2 检验原理和检验目的 1.2 2.l 检验原理 1.3绒毛细胞由受精卵发育分化的滋养层细胞及绒毛间质中的胚外中胚层细胞组成,绒毛细 胞和胎儿组织同源,通过绒毛检测，可客观反映胎儿情况。绒毛既可以直接制片进行染色体观察,也可以经培养制备染色体，进行产前诊断。 2.2 检验目的 1.4用于胚胎停止发育的染色体诊断，规范流产绒毛细胞染色体制备程序，获得足够的染色 体核型进行分析，保证及时准确的发出报告。 1.53 检验前程序 1.63.1 绒毛采集要求 1.73.1.1无菌条件子啊吸取流产绒毛组织少量放入无菌离心管内，加入适量无菌生理盐水保 存样本。 1.83.1.2采集前核对患者姓名、性别、年龄以及离心管上的标签。 1.93.1.3严格执行各种操作技术常规及无菌技术，染色体标本采集、交接过程应防止污染。 3.2 拒收样本的规定 3.2.1接收标本时应注意核对装有绒毛无菌管上的患者是否一致，发现错误应及时拒收标本并与采集者取得联系。 3.2.2检查绒毛标本是否符合实验要求，所取组织是否为蜕膜等。不符合要求将标本退回，通知临床医生，并登记在《不合格标本登记本》。 3.2.3检查合格后，在产前诊断系统上记录。 3.3 让步标本的规定 3.3.1培养过程中发现的轻度污染； 3.3.2绒毛量少于5mg或未见典型绒毛组织等。 上述几种情况均视为让步条件，应先接收样本并接种，待标本处理完毕，确定是否能制备出足够多的能满足分析要求的核型再作进一步处理。若核型数量不足或质量不理想，应及时联系手术医师择期重新抽取样本并培养。 3.4 样本储存规定 3.4.1采集的样本应常温下及时运送至实验室进行接种。 3.4.2标本采集后应尽快接种培养。 1.103.4.3未能当天进行接种的样本应放于4℃冰箱中，保存时间不超过3天。 方法的局限性 本检查为G显带320-400条带范围，不能排除微小染色体异常或基因突变所致的疾病。 9 注意事顼 9.l 在显微镜下鉴定绒毛枝以及严格无菌操作是培养成功的关键。 9.2 妊娠10周后平滑绒毛膜逐渐退化，仅留下叶状绒毛，逐渐发育成胎盘，故孕周稍大的流产绒毛或胚胎停止发育时间过久的标本不易于培养，有培养失败的可能。 9.3绒毛生长最适宜的PH为7.4，高于8.0和低于7.0均不适于人毛细胞生长。 9.4 对绒毛检查结果有异常应复查羊水或脐带血。

人类染色体标本的制备与G显带核型分析报告

人类染色体标本的制备与G显带核型分析报告概述 核型分析是指通过对细胞的染色体观察，了解它们的数量、形态，从而判断个体的性 别以及是否存在染色体异常。本文将介绍人类染色体标本的制备方法以及采用G显带染色 技术进行核型分析的过程和结果。 材料与方法 标本制备： 1.通过体内生长的细胞系培养得到细胞，并将它们发送至染色体形态捕获系统实验 室。 2.将收到的细胞进行样品准备。先加入均浆剂净水，并初次混合。待与细胞量相等的5％高马尔谷酸(Na2HPO4)特性缓冲液和1％偏硫酸，最后混合。 3.轻轻转动管子，并且离开它说较长时间，使得细胞得以与溶液完全变淡。 4.通过四氯化碳进行固定，直至样品中的细胞结构都没有被损坏。 5.利用各种化学剂处理样本，以预处理出更好的结构。 G显带染色： 1.将钟室内的标本压片，使细胞的核形成按制定的标准排序，并在有机玻璃片底部粘贴。 2.加入如下染料： a. Giemsa液：Giemsa指的是罗马帝国时期的波尔多区Giemsa教授。G显带染色技术将溶液中的Giemsa染色质直到他们的总量到达6倍于DNA总量。Giemsa染料在滴定时间内还要使染色质呈现某些将染色质透过玻片清楚可见的颜色。 b. Sorenson’s Buffer：Sørensen’s缓冲液是一种被设计为模仿人类体液的缓冲液。在G显带染色过程中，它发挥的作用是将不同颜色的细胞内组成分离出来，使得它们不会 在一幅核型图像中混杂在一起。 3. 在加入染料后将玻璃片封起来，等待颜料与核相结合。 4. 将镜头放置在显微镜底座中，并通过显微镜观察标本。 分析：

我们使用的显微镜是能见度很好的显微镜，能够让细胞结构非常清晰可见。我们可以在屏幕上观察到标本图像。 我们首先计算出图像中每个单独的染色体的数目以及它们的大小和形状。在一张图像上，我们可以很容易地区分每个单独的染色体，并根据它们的大小、形状和位置来确定它们在细胞核中的位置。 结果 我们的细胞核型分析结果显示，这个体细胞核内的染色体数目为46个。其中，22对为自动体染色体，1对为性染色体。根据染色体长度和颜色的不同，我们将每个染色体分类，并将它们打上标记标识，从而将核型信息呈现出来。 讨论 我们的结果显示，这个样本的核型正常，不包含任何染色体的数量、形态异常。我们的G显带染色技术也证明了这个样本的普通核型类型。这项研究的结果有助于了解人类染色体的结构与功能，为诊断基因疾病提供参考。但是，由于我们只用了一种样本，因此需要更多的研究来确保我们的结果是可靠的。

遗传性疾病检验技术—显带染色体检验

显带染色体检验 非显带染色体制备技术不能将每一条染色体的特征完全显示出来，只能根据各染色体的大致特征（大小、着丝粒位置）来识别。对于染色体结构畸变的诊断和研究受到很大限制。 染色体显带技术是在非显带染色体的基础上发展起来的，它能显示染色体本身更细微的结构，有助于准确识别每一条染色体及诊断染色体异常疾病。 自20世纪60年代末以来各种染色技术的应用，染色体显带技术得到了很大的发展。可以将染色体的个体特征显现出来，据此可准确识别23对不同类型的染色体，从而提高了染色体核型分析的精确度，为临床染色体疾病的诊断提供了更有效的手段。 染色体经过一定程序处理并用特定染料染色后，在普通光学显微镜或荧光显微镜下可显现出不同深浅颜色的带纹或不同强度的荧光 节段叫做染色体带，各号染色体带的形态不同，称带型。染色体显带的分类通常是按能产生某种带型的方法来划分的。如用C、G、Q或T 显带技术产生的带分别称为C带、G带、Q带或T带。按此显带技术可分成两大类：一类是产生的带分布在整条染色体上，如Q、G和R 带；另一类只能使染色体上少数特定的带或结构着色，如C带、T带和N带等。 1971年巴黎会议确定的四种显带技术是：胰酶Giemsa法（G显带）、氮芥喹吖因荧光法（Q显带）、逆向Giemsa法（R显带）和着丝

粒区异染色质法（C显带），其中G显带是目前通常采用的显带技术之一，Q显带、R显带和C显带等技术也被用于染色体研究。四种常用显带技术各具优缺点，有不同的应用。 （一）染色体G显带检验技术 G显带是一种广泛应用的技术。它是用胰蛋白酶处理染色体标本，使染色体蛋白质变性，然后用Giemsa染色，染色体吸收染料，各条染色体上显出深色和浅色相间的带型——G带。G带在普通光学显微镜下即可观察分析。 G显带法包括四种处理技术，即醋酸-钠盐-Giemsa法、碱处理和磷酸缓冲液温育方法以及胰蛋白酶处理Giemsa染色法等，目前多采用胰蛋白酶处理Giemsa染色法。 1.检验原理 染色体经胰蛋白酶处理，染色体上出现了深浅不同的带纹，称为G带。这一显带技术应用最广，用一定浓度的胰酶处理染色体，使染色体蛋白变性，但阳性的G带是表明富含A～T DNA的区段，而阴性G带则富含G～C。出现明暗相间的带纹主要是染色体蛋白质的差异。 2.检验方法学 （1）器材及试剂 1）器材： 超净工作台、恒温培养箱、通风橱、冰箱、低温冰柜、恒温水浴

染色体制备及显带常用试剂

染色体制备及显带常用试剂 1、进口肝素管 NH Sodium Heparin 肝素具有抑制细菌分裂作用，肝素含量过多时可抑制淋巴细胞的转化。 2、秋水仙素 浓度为20μg/ml用量：每瓶培养基用35μl秋水仙素 秋水仙素具有特异性地破坏纺锤丝的形成，阻抑分裂中活动，从而使细胞分裂停滞于中期。 秋水仙素的浓度不够或处理时间不足，可造成分裂相少；相反浓度过高或处理时间过长，可使染色体过于缩短或发生异常分裂现象，甚至染色体断裂。 3、低渗液 0.075mol/L Kcl溶液=2.794g Kcl粉+500ml双（三）蒸水【使用前应37℃恒温水浴箱平衡】。 低渗处理可使细胞体积胀大【红细胞破裂，淋巴细胞膨胀】、染色体松散。 低渗处理时间过长时，细胞膜往往过早破裂，染色体丢失；低渗处理不够，染色体分散不佳，有细胞胞浆蓝色背景。 4、固定液 甲醇：冰乙酸=3：1混合（临用现配） 冰醋酸固定液具有膨胀、固定作用，它与醇类混合固定，有利于染色体松散，可获得分散好，易于分析的分裂中期染色体标本。标本固定不充分，如固定液不新鲜或甲醇、冰醋酸的质量不佳，结果染色体模糊或残留胞浆痕迹，使背景不清。 5、胰酶（现配为佳） 0.2g胰酶粉+100ml Hank液→摇匀调PH值7~7.2（常用0.1mol/LNaOH与0.1mol/LHcl调节PH）【使用前应37℃恒温平衡】胰酶消化蛋白。 胰酶的浓度、PH值、胰酶液温度和作用时间，直接影响G显带，带纹是否清晰可辨。 1】、胰酶液的温度偏高，反应速度就快，反之反应速度慢，将配好的胰酶放入水浴箱，37℃平衡15min左右，使胰酶染色缸温度保持在37±0.5℃； 2】、胰酶处理时间一般在染色后，镜下观察。如果细胞呈蓝紫色显不出带纹，说明胰酶作用时间不够；如果染色体边缘发毛或染色体之间连成一片，数不清单条染色体，染色体不规则或形成空泡状说明胰酶作用时间太长；如果细胞的色泽为桃红色，高倍镜下观察，染色体的带纹清晰可辨，说明胰酶的作用时间适当；3】、标本片龄越长，对胰酶处理的抵抗性越长；片龄太长的标本，分带后往往不会出现带纹，而是斑点状染色体，烤片温度太高，带纹不清楚，烤片时间和温度不够带纹发毛； 4】、胰酶染色缸要洗干净，用蒸馏水冲2次，除去溶液中二价阳离子； 5】、胰酶PH值偏高，玻片偏蓝； 6、Hank液（g/L） Nacl 8.00g Kcl 0.40g Cacl20.14g MgSO4-7H2O 0.20g Na2HPO4 0.06g KH2PO4 0.06g NaHCO3 0.35g 葡萄糖 1.00g 酚红0.02g

人类染色体G显带

1ｐ短臂近侧１／２有两条宽阔和浓染的深带，远端有３－４条较窄较淡的带。长臂有５条深带，中央有一条最亮最深的带。ｑ长臂的次溢痕深染。 ２号染色体（亚中） ｐ有间隔较均匀的４条深带，中间的两条稍靠近。着丝粒染色很浅。长臂根据标本的质量可间６－８条深带。 1号染色体： 着丝粒和次缢痕 短臂——近侧段和中段各有一条深带，其中段深带稍宽，在处理较好的标本上，远侧段可显出3～4条淡染的 长臂——次缢痕紧贴着丝粒，染色浓。其近侧为一宽的浅带，中段和远侧段各有两条深带，以中段第2深带染色较浓，中段两条深带稍靠近。此臂分为4个区， 次缢痕远侧的浅带为2区1号带， 长臂——可见6-7条深带，此臂分为3个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1 短臂——可见4条深带，中段的两条深带稍靠近。此臂分为两个区，中段第2、3深带之间 明显宽阔的 着丝粒染色浓。 长臂——一般在近侧段和远侧段各有短臂——一般在近侧段可见两条深带，远侧段可见3条深带，其中远侧段近端部的一条较窄，且着色较淡，这是区别3号染色体短臂的显著特

３号染色体（中央） ｐ和ｑ中部色浅是３号染色体的特点。ｐ近着丝粒区通常有两条深带。远端可见３条，中间的一条最宽最浓。ｑ臂近端可见两条深带，中间一条明显的浅带，远侧有４－５条深带。 ４号染色体（亚中） ｐ有１－２条深带，ｑ有均匀分布的４条深带，在较好的标本还可以分出较好的更多的带纹。 5号染色体（亚中） ｐ有１－２条深带，ｑ中段有３条深带（有时为１条），远端有１－２条深带。 明显宽阔的浅带 短臂——可见1～2条深带，其远侧段的深带宽而且色短臂——可见一条深带，长臂q ——可见均匀分布的四条深带， 在处理比较好的标本上，在第2、3深带之间还可显出一条较窄的深带。此臂分为3个区，近侧段第1、2深带之长臂——近侧段有两条深带，染色较淡，有时不显；中段可见3条深带，染色较浓；远侧段可见1～2条深带，近末端的一条着色较浓。此臂分为3个区，中段第2深带为2区1号着丝粒较浓

人类染色体G带观察与核型分析

人类染色体G带观察与核型分析 一、实验目的 掌握人类体细胞染色体组型分析的方法 二、实验原理 ○1核型： 染色体组型又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群(亚种、种、 属等)的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。核型模式图是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。核型( karyotype )是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像,通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴面成。正常细胞的核型能代表个体的核型。组型( idiogram )是以模式图的方式表示,它是通过对许多细胞染色体的测量取其平均值绘制而成的,是理想的、模式化的染色体组成。它代表了一物种染色体组型的特征,核型的研究对人类医学遗传研究及临床应用,对探讨动植物起源、物种间亲缘关系、鉴定远缘杂种等方面都有重大意义。 ○2带染色技术也称为改良的 iemsa 染色法。因用 iemsa 染色,所以称为带。它是目前应用最广泛的染色体分带技术之一。染色体标本放到37℃胰酶中是带显示的一种预处理方式,它可以从染色体上抽取蛋白质特定的成分,从而经 iemsa 染色后获得良好一致的分带类型。带的形成与 iemsa 染料的组成及染色特性分不开。 iemsa 染料即噻嗪-曙红染料,染色首先取决于两个噻嗪分子同DNA 的结合,在此基础上它们结合一个曙红分子,其次取决于一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。通过胰前预处理可以使阴性带区的疏水蛋白被除去或使它们的构型变为更疏水状态。从而造成了染色体蛋白质的差异,这种差异就是明暗相间的染色体带。 染色体带技术为染色体遗传病诊断、杂种细胞检定、特殊细胞株标记、染色体的识别等开创了一系列检测方法,大大加速了染色体研究的进展。 ○3对任何一个染色体的基本形态学特征来说，重要的参数有3个：描述染色体的三个参数: 1.相对长度：指单个染色体长度与包括X（或Y）染色体在内的单倍染色体总长之比，以百分率表示。(相对长度可以用来表示每条染色体的长度) 相对长度= 每条染色体长度x100% （单倍常染色体+X染色体）总长度 2. 臂指数：指长臂同短臂的比率(臂指数可以用来确定臂的长度) 臂指数= 长臂的长度q x100% 短臂的长度p 为了更准确地区别亚中部和亚端部着丝粒染色体，1964年Levan 提出了划分标准: ○1 1.0-1.7之间，为中部着丝粒染色体(M) ○2 1.7-3.0之间，为亚中部着丝粒染色体(SM) ○3 3.0-7.0之间，为压端部着丝粒染色体(ST) ○47.0以上，为端部着丝粒染色体( 3.着丝粒指数:指短臂占该染色体长度的比率，它决定着丝粒的相对位置。（着丝粒指数可以决定着丝粒的相对位置） 按Levan 划分标准: ○150.0-37.5 之间为M ○237.5-25.0之间为SM

——上传用7人类外周血染色体标本制备、G带观察和核型分析

实验七、人类外周血染色体标本制备、G带观察及核型分析 姓名：学号：班级： 同组同学：带教教师实验日期： 一、实验原理（Principle） 在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。 在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa染色。胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。通过胰酶处理使G带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。由此可见在G带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。 二、操作步骤（Operational procedure） （1）人类外周血染色体标本制备 1、采血 2、培养:RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。 3、秋水仙素(colchicine)处理:在终止培养前2-3小时，加入秋水仙素。 4、离心:以1000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀并用吸管打匀。 5、低渗处理:加8毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution），用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。 6、预固定:低渗后，加新配的固定剂（甲醇：冰醋酸，3:1 ）１毫升，打匀。 7、离心:以1000 rpm离心10分钟，弃上清。 8、固定:加入5ml新配置的固定液，悬浮细胞，室温固定10-15分钟。 9、离心:1000rpm离心10分钟，弃上清。 10、再固定：加入5ml固定液（甲醇：冰醋酸=1：3），室温固定10-15分钟。 11、再离心:1000转/分离心10分钟，弃去上清液。 12、再固定:加入固定液（甲醇：冰醋酸1：1）打匀，固定10－15分钟。 13、制片:固定后，1000转/分离心留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在酒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥。

人类G显带染色体核型分析

人类G显带染色体核型分析 引言 人类基因组中的染色体是遗传信息的主要载体。其中，性染色体在性别决定中 起着重要的作用。在人类中，性别由两种类型的性染色体决定：XX对应女性，XY 对应男性。正常情况下，人类的细胞核中共有46条染色体，其中44条为非性染 色体，另外2条为性染色体。本文将对人类G显带染色体核型进行分析。 G显带染色体 G显带染色体技术是一种常用的染色体核型分析方法，它使用某些特定的染色 剂对染色体进行染色，以便更好地观察和研究染色体的形态和结构。G显带染色技术具有高分辨率和高对比度的特点，可以清晰地显示出染色体上的各种条纹和细节，有助于鉴定染色体异常和进行核型分析。 人类G显带染色体核型 人类的G显带染色体核型是指对人类细胞中的染色体进行G显带染色后所观 察到的染色体图型。正常情况下，人类的核型为46,XX或46,XY，表示每个细胞核 中都包含有22对自动染色体和一对性染色体。其中，自动染色体按照从长到短的 顺序编号为1-22号染色体，性染色体用X和Y表示，女性的核型为46,XX，男性 的核型为46,XY。 核型异常与疾病关联 核型异常是指染色体在数量或结构上发生异常变化。在人类中，核型异常与一 些遗传性疾病的发生和发展密切相关。例如，唐氏综合征是由于21号染色体的三 体性引起的，患者的核型为47,XX(+21)或47,XY(+21)。爱德华综合征也是一种常 见的核型异常疾病，其核型为47,XXY。核型异常的检测对于某些疾病的早期诊断 和预防具有重要意义。 G显带染色体核型分析的步骤 进行G显带染色体核型分析需要经过以下几个步骤： 1. 细胞培养和处理 首先，需要从被检测的样本中提取出细胞，常用的样本包括外周血、羊水、胎 盘组织等。然后，将提取得到的细胞进行培养，使其增殖到一定数量。接下来，使用适当的方法处理细胞，使其进入到有利于显带形成的状态。

人类G显带核型分析

人类G显带核型分析 简介 人类基因组由一系列的染色体组成，其中包含有关个体遗传特征的信息。通过 分析人类染色体的形态和结构，可以获取有关个体的核型信息。在人类染色体核型分析中，G带染色体是一种常用的技术，它能够提供高分辨率的核型信息。 G带染色体技术 G带染色体技术是一种常用的核型分析方法，它能够显现染色体的带状结构。 该技术利用了染色体的染色质中富含的AT和GC碱基对的差异，通过特定染色剂 的作用，可以将染色体分成明显的带状结构。G带染色体技术通常与显微镜观察相结合，可以得到高分辨率的染色体核型图。 G带染色体核型分析步骤 G带染色体核型分析通常分为以下几个步骤： 1.细胞培养：首先需要从个体的脐带血、外周血或骨髓等获得细胞样本， 然后将其进行细胞培养，使细胞增殖到足够数量。 2.处理染色体：将细胞处理以使染色体展开，并进行固定。通常通过加 入适量的高渗液来使细胞膨胀，然后进行固定。 3.涂片制备：将处理后的细胞进行涂片制备，通常使用玻璃片或载玻片。 制备涂片时需小心操作，避免细胞损伤或重叠。 4.染色：将涂片进行染色，常用的染色剂包括吉姆萨染色剂或戈姆萨染 色剂。染色剂的选择会影响染色体的分辨率和对比度。 5.显微镜观察：使用显微镜观察染色后的涂片，通过对各染色体的形态 和带状结构进行分析，得到染色体的核型信息。 G带染色体分析的应用 G带染色体分析广泛应用于临床遗传学和生物学研究中，主要用于以下方面： 1.检测染色体异常：通过G带染色体分析，可以检测到染色体数目异 常、结构异常或重排。这些异常经常与遗传疾病相关，对于儿童发育异常或个体的生育能力评估具有重要意义。

人类染色体G显带示意图 口诀教学提纲

人类染色体G显带示意图 口诀： 一秃二蛇三蝶飘四像鞭炮五黑腰 六号ｐ似小白脸七上八下九两条 十号ｑ三深带好十一低来十二高 十三四五一个样着色深带一二一 十六深带连着点十七深带跑得远 十八人小肚子大十九中间一点腰 二十头重脚轻二十一像葫芦瓢 二十二两两一点Y黑脚，Xｐｑ一担挑 １号染色体（中央） ｐ近侧１／２有两条宽阔和浓染的深带，远端有３－４条较窄较淡的带。长臂有５条深带，中央有一条最亮最深的带。ｑ的次溢痕深染。 ２号染色体（亚中） ｐ有间隔较均匀的４条深带，中间的两条稍靠近。着丝粒染色很浅。长臂根据标本的质量可间６－８条深带。 ３号染色体（中央） ｐ和ｑ中部色浅是３号染色体的特点。ｐ近着丝粒区通常有两条深带。远端可见３条，中间的一条最宽最浓。ｑ臂近端可见两条深带，中间一条明显的浅带，远侧有４－５条深带。 ４号染色体（亚中） ｐ有１－２条深带，ｑ有均匀分布的４条深带，在较好的标本还可以分出较好的更多的带纹。 5号染色体（亚中） ｐ有１－２条深带，ｑ中段有３条深带（有时为１条），远端有１－２条深带。６号染色体（亚中） ｐ中段为一明显宽阔的浅带，这是6号染色体的特征。远端和近端各有一条深带，后者紧邻着丝粒。在质量较好的标本可细分ｑ有６条深带。 7号染色体（亚中） ｐ上有３条深带，末端一条较宽且色深，有如“瓶盖”，ｑ有３条明显的深带，远端一条较浅，且可分为两条。 8号染色体（亚中）最后一条深带宽浓粗壮 p的两条深带被一条浅带隔开，最后一条深带宽浓，粗壮，这是8号染色体的特征，q的3－5条带，近侧段内带和末端较浅的一条带常不明显 9号染色体（亚中）苗条 ｐ有3条深带，远侧的两条深带有时融为一条。ｑ有２条较亮的间隔均匀的深带，远端的一条有时一分为二，次溢痕不着色，长度变异大，但可用ｃ带等选择性染色。 10号染色体（亚中）第一条宽浓 ｐ中段有１－２条深带，ｑ有间隔基本均匀的３条深带。远端２条相距较近。近侧的一条着色最深。 11号染色体（亚中）着丝粒可能染色 ｐ中央有一宽阔的深带有时再分出较窄的一条。着丝粒可能染色。ｑ近着丝粒有

流产绒毛细胞染色体分析规范流程

1 检验目的和方法 1.1 检验项目：流产绒毛细胞染色体制备及分析。 1.2 检验方法:培养瓶法，G显带 2 检验原理和检验目的 2.l 检验原理 绒毛细胞由受精卵发育分化的滋养层细胞及绒毛间质中的胚外中胚层细胞 组成,绒毛细胞和胎儿组织同源,通过绒毛检测，可客观反映胎儿情况。绒毛既 可以直接制片进行染色体观察,也可以经培养制备染色体，进行产前诊断。 2.2 检验目的 用于胚胎停止发育的染色体诊断，规范流产绒毛细胞染色体制备程序，获得足够的染色体核型进行分析，保证及时准确的发出报告。 3检验前程序 3.1 绒毛采集要求 3.1.1无菌条件子啊吸取流产绒毛组织少量放入无菌离心管内，加入适量无菌生理盐水保存样本。 3.1.2采集前核对患者姓名、性别、年龄以及离心管上的标签。 3.1.3严格执行各种操作技术常规及无菌技术，染色体标本采集、交接过程应防止污染。 3.2 拒收样本的规定 3.2.1接收标本时应注意核对装有绒毛无菌管上的患者是否一致，发现错误应及时拒收标本并与采集者取得联系。 3.2.2检查绒毛标本是否符合实验要求，所取组织是否为蜕膜等。不符合要求将标本退回，通知临床医生，并登记在《不合格标本登记本》。 3.2.3检查合格后，在产前诊断系统上记录。 3.3 让步标本的规定 3.3.1培养过程中发现的轻度污染； 3.3.2绒毛量少于5mg或未见典型绒毛组织等。 上述几种情况均视为让步条件，应先接收样本并接种，待标本处理完毕，确定是否能制备出足够多的能满足分析要求的核型再作进一步处理。若核型数量不足或质量不理想，应及时联系手术医师择期重新抽取样本并培养。 3.4 样本储存规定 3.4.1采集的样本应常温下及时运送至实验室进行接种。 3.4.2标本采集后应尽快接种培养。 3.4.3未能当天进行接种的样本应放于4℃冰箱中，保存时间不超过3天。 4 实验用品 酒精灯，烧杯，天平，离心机，CO2培养箱，载玻片，玻片盒，光学显微镜，灭菌注射器，离心管，吸管，量简，培养瓶，试剂瓶，染色缸，剪刀，镊子，手术刀，培养皿等 5 实验试剂 5.1 培养基：GBICO AmnioMAX-II COMPLETE 羊水培养基,BIO-AMF-2 羊水培养基。

人类染色体G显带

1p 短臂近侧1/２有两条宽阔和浓染的深带，远端有３-4条较窄较淡的带。长臂有5条深带,中央有一条最亮最深的带。q 长臂的次溢痕深染。 2号染色体(亚中) p 有间隔较均匀的４条深带，中间的两条稍靠近。着丝粒染色很浅。长臂根据标本的质量可间6-８条深带。 ３号染色体(中央） ｐ和ｑ中部色浅是3号染色体的特点。ｐ近着丝粒区通常有两条深带。远端可见3条，中间的一条最宽最浓。q 臂近端可见两条深带,中间一条明显的浅带，远侧有4-５条深带。 1号染色体： 着丝粒和次缢痕染色深。 短臂——近侧段和中段各有一条深带，其中段深带稍宽，在处理较好的标本上，远侧段可显出3～4条淡染的深带。此臂分为3区，近侧的深带为2区1号带，中段深带为3区1号带。 长臂——次缢痕紧贴着丝粒，染色浓。其近侧为一宽的浅带，中段和远侧段各有两条深带，以中段第2深带染色较浓，中段两条深带稍靠近。此臂分为4个区，次缢痕远侧的浅带为2区1号带，中段第2深带为3区1号带，远侧段第3深带为4区1号带。 长臂——可见6-7条深带， 此臂分为3个区，第2和第 3深带之间的浅带为2区1 号带，第4和第5深带之间 为3区1号带。 短臂——可见4条深带，中段 的两条深带稍靠近。此臂分为 两个区， 中段第2、3深带之间的浅带为2区1号带。 明显宽阔的 浅带 着丝粒染色 浓。 长臂——一般在近侧段和远侧段各有一条较宽的深带。在处理较好的标本上，远侧段的深带可分为3条深带，此臂分为两个区，中段浅带为2区1号带。 短臂——一般在近侧段可见两条深带，远侧段可见3条深带，其中远侧段近端部的一条较窄，且着色较淡，这是区别3号染色体短臂的显著特征。此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带。 明显宽阔的浅带