李依 食品酶学 丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶的研究
【摘要】
综述了丝氨酸蛋白酶的结构与功能、蛋白质工程、表达系统和应用。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中发挥着重要而又广泛的生理作用，具有广泛的研究和应用价值。它们的活性部位都含Ser、His、Asp，并具有相同的催化机制。丝氨酸蛋白酶超家族成员执行多种多样的生理功能，在很多致病过程以及细胞内的信号转导等方面起着重要作用。正是由于丝氨酸蛋白酶在结构上的微小变化，从而引起了其在功能上的进化。
On serine protease
Abstract： This paper reviews the serine proteases’structures，functions，protein engineering，expression system，and applications．Serine protease is a group of proteolytic enzymes that are important for its potential applications．All serine proteases have serine，histidine and aspartic acid in their active domain，and same catalytic mechanism．The members in the serine protease super family serve a wide range of physiological functions，especially in thepathogenesis of many diseases and intracellular signal transduction．Any minute alternations in their structures canresult in significant functional changes．
【关键词】丝氨酸蛋白酶抑制剂表达结构
【正文】
一丝氨酸蛋白酶的概述
1 简介
丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸（其名字的由来）。在哺乳类动物里面，丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色，特别是在消化，凝血和补体系统方面。
(1)消化酶胰分泌的酶里面有三种是丝氨酸蛋白酶：
A 糜蛋白酶
糜蛋白酶，又称为胰凝乳蛋白酶，水解酶类的一种肽链内切酶，主要促使疏水性氨基酸尤其是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸的羧基端多肽裂解。由胰以糜蛋白酶原的形式分泌，在小肠内经胰蛋白酶作用而激活。糜蛋白酶A及B 分子大小不同，但特异性则相似。
B 胰蛋白酶
胰蛋白酶属水解酶类，促使肽链分裂，作用部位为精氨酸或赖氨酸羧基。此酶以酶原形式由胰释出，在小肠中转化为活性形式。
C 弹性蛋白酶
弹性蛋白酶（EC 3.4.21.36.）：水解酶类的一种，对丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸等含羧基的多肽键起催化水解的作用，因曾认为此酶主要作用于弹性蛋白而有此命名。它是胰以酶原(弹性蛋白酶原)形式分泌的一种丝氨酸蛋白酶，参与肠内蛋白消化。
这三种酶的一级结构（氨基酸序列）和三级序列（所有原子的空间排布）相似。它们的活性丝氨酸残基都是在同一位置(Ser-195)。
(2)凝血因子几种激活的凝血因子都是丝氨酸蛋白酶，包括：
A凝血第十因子（X），也称Stuart因子，参于内源性和外源性凝血途径的一种耐贮存因子。缺乏可致系统性凝血障碍（第十因子缺乏症）。
B凝血第十一因子（XI），即是血浆凝血酶致活酶先质：作用于内源性凝血途径的一种稳定因子。缺乏这种因子会引起系统性血凝缺陷，即C型血友病或Rosenthal综合征，与典型血友病相似。
凝血酶来自凝血酶原，可促使纤维蛋白质变为纤维蛋白的酶；
C纤维蛋白溶酶，胞浆素，：是溶解纤维蛋白或血凝块系统的有效部分，是对纤维蛋白有高度特异性的蛋白分解酶，对已经形成的纤维蛋白凝块有特别的溶解力，对其他血浆蛋白、凝固因子和一般蛋白质也有类似作用。
（3）补体系统补体系统里面有几种蛋白质属于丝氨酸蛋白酶，包括：
A C1r 和 C1s
B C3转化酶裂解补体成分C3为C3a和C3b的酶；经典途径C3转化酶是C4b，2a；旁路C3转化酶是C3b，Bb和C3b，Bb
（4）作用原理
A 通过邻近的氨基酸残基链，丝氨酸残基在活性中心被激活。
B 被激活的羟基与肽键的碳原子发生亲核反应。
C 肽键断裂后，酰基上的碳被酯化，肽键的氮端会被释放游离。
D 水解反应，与酶相连的碳端产物被释放。反应完成。【1】【2】
2 作用
丝氨酸蛋白酶存在于大多数的生物体内。迄今为止,基于不同的氨基酸序列、氨基酸三级结构以及催化残基的序列丝氨酸残基、组氨酸残基、天门冬氨酸残基组成了至少个不同的家族类型。丝氨酸蛋白酶主要包括肠激酶、凝血酶、纤溶酶、类胰蛋白酶、粒酶、胰酶、血浆激肚释放酶等。这类酶都具有丝氨酸残基,组氨酸残基,天门冬氨酸残基,在催化过程中,酶残基中的经基氧对肤链中的拨基碳进行亲核进攻,进而将肤链水解为段。近年来对这类酶已经有广泛研究,发现它们在一系列的生理过程如消化、凝血、胚胎发育以及免疫应答等中起重要作用。丝氨酸蛋白酶催化的串连水解过程是由一系列非活性的丝氨酸前蛋白和一个能引发相应应答的特异性刺激物组成,一旦串连水解被激活,不同的前蛋白就会逐步激活,导致迅速不可逆的特异性细胞应答,这些酶对维持机体的内环境稳定有重要作用,一旦它们处于不规则状态下,机体正常的生理条件就可能遭到破坏。【4】
二丝氨酸蛋白酶的抑制
蛋白酶抑制剂（Ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＰＩ）是一类具有抑制蛋白酶活性的物质，有机体内的内源性蛋白酶抑制剂一般是分子量相对较低的生物大分子，而小的非蛋白类抑制剂大多来源于微生物［１］．丝氨酸蛋白酶抑制剂作为主要的蛋白酶抑制剂之一，可以调控生物体内的多种生理反应、与蛋白酶的活性部位结合、抑制酶的催化作用或阻止酶原转化为有活性的酶．在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用，在一系列的生理病理过程中也起着关键性的调控作用．有关抑制剂对蛋白酶活性的抑制作用机理，目前主要通过Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ的“标准机制”进行解释．同时，Ｒａｄｉｓｋｙ的“排水沟阻塞机制”和Ｄａｖｉｄ的抑制剂分子刚柔性观点则从
不同角度和层次进行了补充．抑制剂及其与相应的蛋白酶形成的复合物的结构及生理功能之间的联系，将随着从结构生物学等方面研究的深入而逐步被阐明。（1）丝氨酸蛋白酶抑制剂的一级结构。
对不同来源的蛋白酶抑制剂的一级结构研究表明，其分子一般由２９～１９０个氨基酸组成，个别可达４００个氨基酸，这些蛋白酶抑制剂大多属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族．其中植物来源的Ｂｏｗｍａｎ—Ｂｉｒｋ型蛋白酶抑制剂的结构中都存在一种由９个氨基酸形成的环状肽段ｌ＿２］，此结合环与蛋白酶的抑制活性有着密切的关系．通过对Ｂｏｗｍａｎ—Ｂｉｒｋ型蛋白酶抑制剂的结合环的氨基酸序列进行分析，结果显示这类抑制剂处于活性区域内结合环上从Ｐ。到Ｐ。’残基有着较为保守的氨基酸组成：即ＣＴＰＳＸＰＰＱＣ（其中Ｐ代表决定抑制专一性的活性残基，Ｘ代表２０种氨基酸中的任意一种。
（2）典型丝氨酸蛋白酶抑制剂分子内的高级结构信息
典型丝氨酸蛋白酶抑制剂均有一个具有特征性构象的暴露在分子外侧的结合环，这种结合环在所有抑制剂分子及酶一抑制剂复合物中都保持一致的构象．构象预测及结晶学研究均显示结合环形状扁平，比较适合于贴近或进人蛋白酶活性部位的缝隙．在该环上有一个活性位点肽键，使得这类抑制剂可以作为所有同源酶的底物．有研究测量了大豆胰蛋白酶抑制剂（ＳＴＩ）与相应胰蛋白酶结合时的氢离子释放情况，通过对反应过程的观察，认为酶和抑制剂形成复合物后，抑制剂分子中的Ａｒｇ。一Ｉｌｅ（Ｐ一Ｐ’）氨基酸间肽键被专一性水解，整条肽链被切割成两个片段ｌｌ４］．而在其他来源的该抑制剂与酶结合时，如：牛胰蛋白酶抑制剂（ＢＰＴＩ），Ｐ位点是Ｌｙｓ残基相应肽键发生水解，并且当Ｌｙｓ残基被乙酰化后，其抑制胰蛋白酶的活性几乎全部丧失。
（3）蛋白酶与抑制剂相互作用的机制
由于蛋白酶抑制剂分子刚性较强，所以无论在胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰肽酶Ｅ还是枯草杆菌蛋白酶等相应的抑制剂中存在着一种分子间相互作用的“标准机制”，酶促反应动力学公式为：
Ｅ＋ＩｉＫｃａｔＣＥ＋
式中Ｅ为酶，Ｉ为抑制剂，Ｃ为酶一抑制剂形成的中间产物，Ｉ为被酶水解修饰后的抑制剂．从三维空间结构匹配的角度来看，蛋白酶抑制剂可作为相应蛋白酶的合适底物，但从动力学常数间相互关系上来看，在中性ｐＨ值条件下，虽然反应的Ｋｃａｔ／Ｋｍ值很大，但Ｋｃａｔ和Ｋｍ却比酶的正常底物浓度低几个数量级．因此这类蛋白酶抑制剂对酶的抑制作用在于二者之间紧密的结合，形成不易解离的酶一抑制剂复合物．研究也表明抑制剂活性部位肽键的水解和水解后的肽键在复合物形成时再合成的过程都遵循着这种标准机制。【5】
三丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究
丝氨酸蛋白酶抑制剂是一类丝氨酸蛋白酶活性调节剂，参与凝血、纤维蛋白溶解、补体激活、炎性介质反应及组织重建过程。1995年Sprecher等从人胎盘eDNA 文库中首先筛选并分离出一种新型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，命名为PI-9，属于人丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，卵清蛋白家族中的新成员。近些年来，对于P1-9的结构功能、表达分布及调节、抑制细胞凋亡机制、肿瘤及移植免疫耐受等方面的研究已取得一定进展。
1 H-9的分子结构与功能特点
人类PI-9基因定位于染色体6p25，由7个外显子和6个内含子组成，PI-9mRNA大小
分别为3．4 kb和4．4 kb。P1-9编码一种含有374个氨基酸残基的单链蛋白，分子量约为42 kD，定位于细胞核和细胞浆。PI-9与其他丝氨酸蛋白酶抑制剂相似，具有高度保守的三级结构，主要包括9个仅螺旋、3个B折叠和1个位于羧基末端的功能结构域，即功能活性反应中心(reactive center loop，RCL)，但其氨基末端缺乏一个可裂解的信号序列01-2]。RCL位于距羧基端30～40个残基区域，为一环状的结构域，RCL内的氨基酸残基序列和构成并非恒定不变，不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂其RCL氨基酸残基序列和构成不尽相同。RCL上存在一个能被靶酶所识别的位点，即Pl—P1’位点，该位点的氨基酸残基构成将决定该蛋白酶抑制剂功能的特异性。例如，P1-9 RCL的P1位点为Glu340，是人丝氨酸蛋白酶抑制剂家族位于P1位点的唯一酸性氨基酸残基，其与GrB天然底物的结构相似。PI-9因P1位点为Glu可被GrB迅速识别，更为重要的是，PI-9 RCL中P4’位点的谷氨酰胺(Glu344)是其与GrB紧密连接必不可少的结构，P4’与GrB的Lys”形成牢固的盐桥结构，使PI-9与GrB形成高度稳定、难以解离的复合物而导致GrB失活旧J。另外，Mahms等H1研究发现PI-9能被存在CTL和NK中含量较少的颗粒酶M有效地降解，致PI-9功能失活，参与调节细胞凋亡。
2 PI-9表达的作用
PI-9是丝氨酸蛋白酶抑制剂中唯一具有抑制GrB介导的细胞凋亡和白细胞介素一lB转换酶(IL一1 B—convening enzyme，ICE protease，Caspase—1)介导的炎性介质反应的功能蛋白，故其在抗细胞凋亡与抗炎性介质反应过程中发挥重要作用。
2．1抗细胞凋亡
CLs清除体内感染细胞(病毒、细菌)及肿瘤细胞主要通过PFP／GrB和Fas／FasL 路径介导细胞凋亡，维持机体自稳。近来研究发现，PI-9在抗细胞凋亡中可能起到重要作用。GrB是丝氨酸蛋白酶家族中的重要成员，在颗粒酶B介导的靶细胞凋亡过程中起核心作用，能迅速引起靶细胞DNA断裂，最终导致细胞凋亡。PI-9是迄今为止发现的唯一具有抑制GrB活性功能的丝氨酸蛋白酶抑制蛋白能阻断GrB 所致的DNA降解，从而具有抑制GrB诱导的细胞凋亡作用。Bird等¨孔通过对乳腺癌细胞株MCF-7的研究发现，转染野生型PI-9的癌细胞可明显抵抗CLs的杀伤作用，而转染基因突变、无活性的PI-9的癌细胞则大量凋亡。此外他们研究证实，PI-9只通过PFP／GrB抑制细胞凋亡，在Fas／FasL未起作用。最近研究发现，PI-9不仅能抑制PFP／GrB路径介导的细胞凋亡，还能通过抑制Fas／FasL路径介导细胞凋亡，提示在抑制细胞凋亡中
PIO可能发挥越来越重要的作用¨4|。
2．2抗炎性介质反应
Caspase—l可激活促炎症细胞因子IL—l B和IL一18前体，介导免疫和炎性介质反应。James等¨5。研究显示，PI-9是Caspase—l的潜在抑制剂，其表达与Caspase．1活性及IL．1B产物呈负相关，即PI-9低表达时Caspase—l的活性增强，IL—l B产物增多，促进免疫和炎性介质反应，反之亦然。这提示PIO在活体内抑制炎性介质反应和免疫反应中具有重要的调节功能。【3】【8】
四丝氨酸蛋白酶的重组表达
丝氨酸蛋白酶广泛存在于动物、植物、细菌、病毒、真菌中，并且参与生命的各种反应——蛋白质翻译后后加工、细胞分裂、病原体感染、组织降解、细胞凋亡等。可见丝氨酸蛋白酶具有广泛的研究和应用价值。该类酶因其活性中心
具有一个独特易反应的丝氨酸残基而得名，此残基与有机磷如二异丙基氟磷酸有不可逆反应。近来已经有愈来愈多的丝氨酸蛋白酶在组织或微生物体内被发现，但是它们表达水平极低并且只在生命的特定阶段表达。因此，采用生化提取方法分离很难获得足够量的蛋白。目前，基因克隆与表达的技术日益成熟，在酶学研究中很快取代了生化提取方法。并且，通过重组技术直接获得蛋白酶的
结构变化已经广泛用于丝氨酸蛋白酶的机理和功能研究。目前，用于重组蛋白质表达的表达系统种类繁多，根据表达宿主种类的不同可将之分为四类：细菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统。丝氨酸蛋白酶已经在这些系统中获得成功表达。
虽然在各种表达系统中都有丝氨酸蛋白酶成功表达的先例，但是新的丝氨酸蛋白酶表达的结果仍然很难马上预测，所以有必要同时试用多种表达系统。一般说来，如果只是为了表达非活性蛋白酶用于制备抗体，细菌表达系统应为首选。如果原核表达系统不能表达出活性蛋白酶，同时又不需大量产物的话，最好转用真核表达系统。哺乳动物表达系统表达丝氨酸蛋白酶虽然很成功，但其费用昂贵。该系统一般适于必需类似哺乳动物翻译后修饰的蛋白酶。丝氨酸蛋白酶的立体结构是高度保守的，但由于蛋白多肽的表达后加工和修饰不同，其后加工对酶的功能、结构、理化特性产生的影响大小不一，所以现在还没有一个表达系统被证明是适于所有丝氨酸蛋白酶的异源表达的，所以选用之前一定要慎重考虑不同系统的优缺点和研究目的。选择一个最符合表达要求的载体是很明智的，但是如果初次失败了也不要轻易放弃。另外，研究者还需要考虑目的蛋白酶本身的特性，如是否需要辅因子辅助活性的发挥或是金属离子的稳定作用等。从大量文献可以发现，大多丝氨酸蛋白酶在异源表达系统表达时，多表达为酶原形式。这可能是因为1．蛋白酶活性形式对宿主有毒性。有报道表明：对于同一种酶，在相同表达系统中，无活性形式的蛋白酶较活性形式的蛋白酶表达水平高~TM 2．Istv6n 认为糜蛋白酶原的propeptide对其成熟蛋白的折叠和功能发挥有一定影响。“3．有文献报道丝氨酸蛋白酶，如糜蛋白酶有自我裂解的特性。由此看来，欲获得丝氨酸蛋白酶的成功表达需要综合考虑载体、宿主细胞、目的蛋白酶的特性及研究目的等多方面的因素采用不同的表达系统进行表达。【10】
五丝氨酸蛋白酶线粒体细胞肿瘤发生中的作用
丝氨酸蛋白酶在各种细胞中有着广泛的作用，包括凝血、创伤愈合、消化、免疫反应、肿瘤侵袭和转移。定位于线粒体中的丝氨酸蛋白酶ＬＯＮ／ＰＩＭ１和Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２有着重要的生理功能，其异常表达在肿瘤发生过程中起重要作用。
1．ＬＯＮ／ＰＩＭ１蛋白酶的管家和调节功能
ＬＯＮ／ＰＩＭ１蛋白酶对维持细胞的呼吸功能和内环境稳定极其重要。ＬＯＮ类蛋白酶家族成员极其保守，与ＬＯＮ类的蛋白酶特异性相关的差异性序列定位于氨基端的第３个蛋白结构域与两个催化位点之间。ＰＩＭ１蛋白酶是存在于酵母菌的线粒体基质的ＬＯＮ类蛋白酶，其纯化酶以同源七聚体构成了约８００ｋＤ的复合物，两个复合物进一步组装成天然酶。在整个生物界内ＡＴＰ依赖性蛋白酶高度保守，因此基于对酵母菌的研究，可以预测出在高等真核细胞线粒体内的相关同源酶的重要功能。
1.1 参与线粒体ＤＮＡ代谢
ＬＯＮ直接参与线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｅｈｏｎｄｆｉａＤＮＡ，ｍ
ｔＤＮＡ）的代谢，而且其与ＤＮＡ和ＲＮＡ结合要受核苷酸抑制和蛋白质促进的调节。人ＬＯＮ蛋白酶以单链形式按照位点和链特异的方式结合ｍｔＤＮＡ单链的富含ＧＴ碱基区域，并且与ＤＮＡ轻链的启动子相重叠。免疫共沉淀实验表明，ＬＯＮ和ｍｔＤＮＡ的多聚酶伽玛和双螺旋链相互作用。ＡＴＰ能抑制ＬＯＮ结合ＤＮＡ和ＲＮＡ，而蛋白质代谢物能提高ＬＯＮ和ＤＮＡ的亲和力约３．５倍。核苷酸抑制作用和蛋白质促进作用协同调节ＬＯＮ和ＤＮＡ的结合，该过程是通过ＬＯＮ全酶的构象改变实现的。研究表明，ＰＩＭ１蛋白酶１０１５位的起催化作用的保守丝氨酸残基突变为丙氨酸时，该酶将完全失去蛋白溶解活性，其相应细胞则不能维护线粒体基因组的完整性；相似情况也见于ＰＩＭ１蛋白酶的ＡＴＰ结合结构域的６３８位保守赖氨酸残基突变为天冬酰胺时。可见，ＬＯＮ类蛋白酶可能通过结合ＤＮＡ并降解与启动子临近位点的调节蛋白的方式来调节ｍｔＤＮＡ的复制和（或）转录。
1.2 维持前体ｍＲＮＡ稳定性
酵母菌线粒体的基因表达涉及到几个前体ＲＮＡ的加工。许多基因缺乏自己的启动子因而被转录为大的转录单位的一部分，例如细胞色素Ｃ氧化酶１、ＡｒｒＰ合成酶亚单位６和亚单位８的基因都被转录为一个多顺反子前体ＲＮＡ，最初的转录体须经过加工才能产生信使ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）和转运ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。在含有野生型ｍｔＤＮＡ且ＰＩＭ１蛋白酶突变的菌株，虽然细胞色素Ｃ氧化酶１和细胞色素Ｂ基因可以正常转录，但Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析却检测不到前体或成熟形式的细胞色素Ｃ氧化酶１和细胞色素Ｂ的ＲＮＡ。ＰＩＭ１蛋白酶在细胞色素Ｃ氧化酶１和细胞色素Ｂ的ＲＮＡ代谢中的作用与这些基因中含有多个内含子有关（细胞色素Ｃ氧化酶１有７个内含子，细胞色素Ｂ有５个内含子），因为在ＰＩＭ１蛋白酶突变且不含有线粒体内含子的菌株中，细胞色素Ｃ氧化酶１和细胞色素Ｂ的ｍＲＮＡ可达到正常水平。
1.3 参与ｍＲＮＡ内含子剪切
为了明确证实ＰＩＭ１蛋白酶在ＲＮＡ剪切中的作用，研究者构建了一个ＰＩＭ１蛋白酶突变的菌株，该菌株含有野生型ｍｔＤＮＡ和仅含有２个内含子ｂＩ１、ｂＩ２的短细胞色素Ｂ基因。内含子ｂＩ１不编码ｍＲＮＡ成熟酶，无论ＰＩＭ１蛋白酶存在与否都可被剪切。内含子ｂＩ２编码ｍＲＮＡ成熟酶，借助细胞色素Ｂ外显子特异的探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，与野生型细胞相比，ＰＩＭ１蛋白酶突变的菌株积累了大量的含有内含子ｂＩ２的稳定的细胞色素Ｂ前体ＲＮＡ，而仅有少量的成熟细胞色素Ｂ的ｍＲＮＡ。这些结果表明，至少有一个编码ｍＲＮＡ成熟酶的内含子在进行有效剪切过程中需要ＰＩＭ１蛋白酶。
2.Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２蛋白酶的调节凋亡功能
２００１～２００２年７个研究机构几乎同时鉴别出Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２是定位于线粒体的具有凋亡调节功能的蛋白酶…Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２蛋白可经由两条途径而起促凋亡作用：①结合凋亡抑制子（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏ．ｓｉｓ，ＩＡＰ）通过天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶（ａｓｐａｓｅｓ）依赖的方式促凋亡；②凭借其丝氨酸蛋白酶活性以非ｃａｓｐａｓｅｓ依赖的方式促凋亡。凋亡即程序性细胞死亡，可由外在的或内在的信号启动，激活内源性蛋白酶如ｃａｓｐａｓｅｓ，引发细胞降解¨。凋亡的生理性调控包括ＩＡＰ、Ｂｃｌ一２、促凋亡因子关蛋白等１４］。ＩＡＰ基因家族高度保守，存在于从昆虫到哺乳动物的多种生物。ＩＡＰ可直接结合并抑制ｃ
ａｓｐａｓｅｓ，同时参与细胞周期调节和调控受体介导的信号转导。
2.1干扰ＩＡＰ和ｃａｓｐａｓｅ的相互作用
ＩＡＰ可以结合并抑制ｃａｓｐａｓｅ从而在凋亡调节过程中发挥关键作用。Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２通过剪刀样的基序与ｘ一染色体连锁ＩＡＰ（Ｘ—ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ—ｌｉｎｋｅｄＩＡＰ，ＸＩＡＰ）结合，研究中发现丝氨酸蛋白酶Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２是第２个具有剪刀样基序并与哺乳动物ＸＩＡＰ结合的蛋白酶。该蛋白酶通过自我加工形成具有与剪刀家族蛋白质相似的氨基端序列。线粒体中有全长序列的Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２，也含有加工成熟的Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２，但不能与ＸＩＡＰ发生相互作用，只有伴随着凋亡的发生时，它们才转移到细胞质中并与ＸＩＡＰ发生相互作用１６］。Ｒａｍｅｓｈ等¨’用杆状病毒凋亡蛋白抑制子第３重复序列作为亲和试剂，通过杆状病毒凋亡蛋白抑制子第３重复序列结合肽的洗提、微序列分析和光谱测定法证实，线粒体中成熟的丝氨酸蛋白酶Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２能直接结合杆状病毒凋亡蛋白抑制子第３重复序列的蛋白质和ｃａｓｐａｓｅ激活子。Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２过表达使细胞对凋亡敏感化，而用ＲＮＡ干扰抑制Ｏｍｉ／ＨｔｒＡ２表达可减少细胞凋亡。
2.2协同丝氨酸蛋白酶活性和拮抗ＩＡＰ能力
Ａｎｎｅ等发现哺乳动物细胞中的同源类似物是ＨｔｒＡ２，能够结合ＸＩＡＰ和杆状病毒ＩＡＰ来调节凋亡。在健康细胞中ＨｔｒＡ２大部分存在于线粒体内，当接受紫外线照射时，ＨｔｒＡ２转移至细胞质中，并与ＩＡＰ发生作用。在体外，ＨｔｒＡ２能够阻止ＸＩＡＰ对活性ｃａｓｐａｓｅ３的抑制，并且在紫外线诱导哺乳动物ＮＴ２细胞凋亡时ＨｔｒＡ２能对抗ＸＩＡＰ对细胞的保护作用。研究表明，成熟ＨｔｒＡ２氨基端在与ＩＡＰ发生相互作用时起重要作用的丙氨酸或者具有蛋白酶活性的丝氨酸残基，两者任意一个发生突变都将减弱ＨｔｒＡ２促进凋亡的能力；而在二者都突变时，促进凋亡活性将全部缺失。由此可见，丝氨酸蛋白酶ＨｔｒＡ２的活性和拮抗ＩＡＰ的能力在促进细胞凋亡过程中是相互协同的。【6】
六丝氨酸蛋白酶的蛋白质工程
蛋自质工程就它的涵义来说, 就是把天然蛋白质分子的一部分加以变更或
改造, 甚或从头设计、创造自然界中不存在的全新蛋白质分子, 使之适合于功能上某一特定的目的。从技术上说, 蛋白质工程应用基因工程的D N A 重组技术, 把克隆了的基因的D N A 编码序列加以改变, 或者人工合成新的基因, 再把改造过的基因或人工合成基因通过载体在合适的宿主系统中加以表达, 从而产生数量几乎不受限制、性能上具有特定功能的突变型蛋白质分子或全新的蛋白质分子。
丝氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶。胰脏分泌的消化酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶, 血液凝固中的凝血酶都属于丝氨酸蛋自酶家族。它们的氨基酸序列表现出广泛的同源性, 它们的三维结构高度相似, 它们的活性部位都含Se r 、H is、并具有相同的催化机制。但是它们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性。这些酶来自共同的祖先, 具有相同功能, 通过基因突变而出现性能上某些差异的现象是趋异进化的结果。另一类丝氨酸蛋白酶—枯草杆菌白蛋白酶, 来源于细菌, 它的氨基酸序列与胰蛋白酶等的完全不一样, 没有同源性; 三维结构也有很大的差别。但是枯草杆菌蛋白酶的活性部位也是由Se
r 、H is、AsP 所组成, 它的催化功能和机制与胰蛋白酶也类似。这种来源各异而催化活性中心相同的现象是趋同进化的结果。不少丝氨酸蛋白酶的一级、二级、三级结构已被测定,它们的催化机制、活性部位、底物结合部位也已阐明。这些数据可以用来探讨酶与底物的结合、过渡态、反应物、酶与抑制剂的相互作用, 以及自然变异与定位突变对酶分子结构与功能的影响, 因此是蛋白质工程的极好模型。【7】【9】
【参考文献】
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【3】丝氨酸蛋白酶抑制剂PI-9的研究进展雷晓晔周业江’
【4】合成类丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展刘宝玉,孟昭力山东大学药学院药物化学研究室,济南 250012
【5】丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构特点及作用机制赵飞，王转花（化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学生物技术研究所，山西太原０３０００６）
【6】线粒体中的丝氨酸蛋白酶在肿瘤发生中的作用张雁林朱运峰
【7】丝氨酸蛋白酶的蛋白质工程张龙翔 (北京大学生物学系, 北京1 0 0 5 7 2 )
【8】丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究及应用张梅，朱柞铭（南开大学分子生物学研究所，天津３０００７１）
【9】HCV NS3丝氨酸蛋白酶分子间及与其辅助因子NS4A 分子间相互作用的研究欧武朱千政邓小艺杨翠红* 于曼秦鄂德杨佩英军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京100850
【10】丝氨酸蛋白酶的重组表达徐义辉梁国栋 (中国预防医学科学院病毒基因工程国家重点实验室北京 10005
李依
食品（2）班
0902062043
溶菌酶及其在食品工业中的应用
溶菌酶及其在食品工业中的应用 Research advances in egg bioactive component—lysozyme and its applications in food industry 徐敬宜徐永平* 刘姝金礼吉?(请确认是否少写了作者姓名) XU Jing-yi XU Yong-ping*LIU Shu Yu Wang?Yongsheng Ma? （1.大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系,山东大连116024； 2.国家精细化工重点实验室,山东大连116012） （1.Department of Bioscience and Biotechnology,School of Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology, Dalian,Shangdong116024,China；2.State Key Laboratory of Fine Chemicals,Dalian University of Technology,Dalian,Shangdong116012,China） 摘要：溶菌酶是一种对人安全且具有保健作用的蛋白酶，是国际公认的绿色天然酶制剂。它在食品工业中被广泛用作食品添加剂和防腐剂。溶菌酶广泛存在于人、动植物及微生物体内，尤以鸡蛋清中含量较高，具有巨大的开发应用价值。 关键词：溶菌酶；鸡蛋；溶菌性；食品 Abstract:Lysozyme is a bacteriolytic enzyme commonly found in nature and is present in almost all secreted body fluids and tissues of human and animals. It has also been isolated from some plants,bacteria and bacteriophages.The chicken egg white is a rich and easily available source of lysozyme.Lysozyme is used as an antimicrobial agent in various foods,either as a preservative or to control microbial processes in cheese,beer and wine production. Keywords:Lysozyme；Egg；Bacteriolytic；Food 溶菌酶（Lysozyme，法定编号：EC3.2.1.17，美国化学文摘服务社（CAS）编号[9066-59-5]）是一种安全性很高，且具有一定保健作用的蛋白酶。溶菌酶能选择性地分解微生物及植物细胞壁，对人体细胞不会产生降解作用，常作为绿色天然防腐剂被广泛应用于食品、医药等行业。WHO（World Health Organization）及许多国家，如奥地利、澳大利亚、比利时、丹麦、芬兰、法国、德国、意大利、日本、西班牙和英国都公 基金项目：国家自然科学基金（项目编号：30371053） 作者简介：徐敬宜(1980－),女,大连理工大学环境与生命学院在读研究生。 通讯作者：徐永平 E-mail:bam@https://www.docsj.com/doc/fb3479562.html, 收稿日期：2005-10-29
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展教学提纲
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 梁化亮 （生物与食品工程学院，江苏常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体内，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。[关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御
1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主内环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体内的蛋白酶抑制剂在机体内与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体内免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体内的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体内环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体内的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞内蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 梁化亮 （生物与食品工程学院，常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。 [关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御
1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体的蛋白酶抑制剂在机体与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类 目前，典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，至少可分为18个家族[5]，如表1－1所示。不同家族抑制剂的空间结构也不同。通常这类抑制剂是β片层或混合了α螺旋和β片层的蛋白质，也可能是α螺旋或富含二硫键的不规则蛋白质。但它们都拥有规的反应活性位点环的构象，从而使这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能[6]。因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化。 1.2 Serpins Serpins是一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，氨基酸残基数为
酶工程在食品工业中的开发应用
酶工程在食品工程中的开发应用 系部：安全工程系 学生姓名: 张开科 专业班级：2014级食品营养与检测 学号：1401050204 指导老师：刘振平
酶工程在食品工业中的开发应用 食品营养与检测 学生：张开科导师：刘振平 摘要: 酶工程在食品工业中的应用，介绍酶工程在水解纤维素、生产功能性糖类、生产环状糊精、干奶酪制品、酿酒工业中以及其他食品加工中中的应用，从而对酶工程在新世纪发的展做出了展望 酶工程技术就是利用了酶所具有的催化功能生产人类生活所需产品的技术，其中包括了酶的生产与研制，酶和其细胞或细胞器的固定化技术，酶分子的改造和修饰，以及生物传感器。酶是活细胞产生的具有高度专一性、高度受控性和高效催化功能的特殊蛋白质。酶的催化作用可在在常温、常压下进行，又有可调控性，酶工程技术在食品工业中是使用最广泛的也是众多行业中使用最早的 生物技术在食品工业中应用的典型代表可以说是酶在食品工业中的各种 应用。酶制剂在食品工艺中的应用为新时代的食品工业注入了新的活力，开辟了新的发展方向，极大地推动了新世纪食品生产工业技术的发展。80年代末，就已经研发出多种蛋白酶、脂肪酶，到目前为止，国际上食品工业酶的应用超过了50多种。主要有、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、糖化酶、纤维素酶等。主要应用于食品保鲜，瓜果蔬菜的加工、蛋白质制品加工、淀粉生产以及改善食品品质等。酶工程技术在食品工业中的应用不仅降低了生产成本，更提高了食品的质量，还为食品工业生产带来了巨大的经济效益和社会效益。 关键词：酶工程食品工业
目录 第一章酶工程的概述 (3) 1.1 酶工程的概念 (3) 1.2酶工程的发展史 (3) 1.3酶的主要用途 (3) 第二章酶基本概念、命名及其分类 (4) 2.1酶的生产方法 (4) 2.2酶的分类 (5) 2.3酶的命名 (6) 2.4酶的分离纯化 (6) 第三章微生物发酵产酶 (6) 3.1 产酶细胞的要求 (6) 3.2 酶发酵生产常用的微生物 (7) 3.3 提高酶产量的措施 (7) 第四章酶工程在食品工业中的应用 (7) 4.1酶工程技术在乳品加工中的应用 (7) 4.2酶工程技术在果蔬加工中的应用 (8) 4.3 鱼肉制品的加工 (8) 参考文献： (9)
常见蛋白酶抑制剂
当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期：2012-06-13 来源：互联网 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;
丝氨酸蛋白酶抑制物在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者中的意义
丝氨酸蛋白酶抑制物在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者中的意 义 目的分析血清丝氨酸蛋白酶抑制物（vaspin）在2型糖尿病（T2DM）合并颈动脉粥样硬化（CAS）患者中的意义。方法根据有无CAS，将197例T2DM 患者分为CAS T2DM组（A组）和单纯T2DM组（B组）与正常对照组（NC 组）比较血清vaspin水平。结果T2DM患者vaspin高于NC组（P＜0.05）；B 组vaspin较A组高（P＜0.05）。结论vaspin在T2DM合并CAS患者血管病变中有保護作用。 标签：Vaspin；血管病变；糖尿病，2型 [Abstract] Objective To analyze the significance of serine protease inhibitor in patients with type 2 diabetes and carotid artherosclerosis. Methods 197 cases of T2DM patients were divided into the CAS T2DM group （A group）and simple T2DM group （B group）according to whether there was CAS，and the serum vaspin level was compared with that in the normal control group. Results The vaspin in the T2DM patients was higher than that in the NC group（P＜0.05），and the vaspin in the group B was higher than that in the group A（P＜0.05）. Conclusion The vaspin has a protection effect in the vascular lesion of patients with T2DM and CAS. [Key words] Vascular；Vascular lesion；Diabetes；Type 2 2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者死亡原因中大血管病变占59%[1]。丝氨酸蛋白酶抑制物（vaspin）参与了糖尿病大血管病变的发生发展的过程。该研究探讨T2DM患者血清vaspin与颈动脉粥样硬化（carotid atherosclerosis，CAS）的关系，并探讨其机制。 1 资料与方法 1.1 一般资料 选取2016年1—5月于保定市第一中心医院内分泌一科住院治疗的T2DM 患者197例（T2DM组），均符合WHO1999年推荐的T2DM诊断与分型标准。其中男性107例，女性90例。按照有无CAS分为T2DM合并CAS组（A组）111例和单纯T2DM组（B组）86例，其中A组男56例，女55例，B组男51例，女35例。排除标准：其他类型糖尿病者；合并严重其他系统疾病者；糖尿病急性并发症者；应激状态者；近期有创伤、手术者。正常对照组（NC组）70名，为同期健康体检者，NC组男45名，女25名。 1.2 方法
第二节-食品加工中重要的酶---食品伙伴网
第二节食品加工中重要的酶 一、淀粉酶 凡催化淀粉水解的酶，称为淀粉酶。淀粉酶是糖苷水解酶中最重要的一类酶。因水解淀粉的方式不同，可将淀粉酶分为四类：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和脱支酶。 （一）α-淀粉酶 α-淀粉酶广泛存在于动物、植物和微生物中。在发芽的种子、人的唾液、动物的胰脏内含量甚多。现在工业上已经能利用枯草杆菌、米曲霉、黑曲霉等微生物制备高纯度的α-淀粉酶。天然的α-淀粉酶分子中都含有一个结合得很牢固的Ca2＋，Ca2＋起着维持酶蛋白最适宜构象的作用，从而使酶具有高的稳定性和最大的活力。α-淀粉酶是一种内切酶，以随机方式在淀粉分子内部水解α-1,4糖苷键，但不能水解α-1,6糖苷键。在作用于淀粉时有两种情况：第一种情况是水解直链淀粉，首先将直链淀粉随机迅速降解成低聚糖，然后把低聚糖分解成终产物麦芽糖和葡萄糖。第二种情况是水解支链淀粉，作用于这类淀粉时终产物是葡萄糖、麦芽糖和一系列含有α-1,6糖苷键的极限糊精或异麦芽糖。由于α-淀粉酶能快速地降低淀粉溶液的黏度，使其流动性加强，故又称为液化酶。 不同来源的α-淀粉酶有不同的最适温度和最适pH。最适温度一般在55～70 ℃，但也有少数细菌α-淀粉酶最适温度很高，达80 ℃以上。最适pH一般在4.5～7.0之间，细菌中α-淀粉酶的最适pH略低。 （二）β-淀粉酶 β-淀粉酶主要存在于高等植物的种子中，大麦芽内尤为丰富。少数细菌和霉菌中也含有此种酶，但哺乳动物中还尚未发现。 β-淀粉酶是一种外切酶，它只能水解淀粉分子中的α-1,4糖苷键，不能水解α-1,6糖苷键。β-淀粉酶在催化淀粉水解时，是从淀粉分子的非还原性末端开始，依次切下一个个麦芽糖单位，并将切下的α-麦芽糖转变成β-麦芽糖。β-淀粉酶在催化支链淀粉水解时，因为它不能断裂α-1,6糖苷键，也不能绕过支点继续作用于α-1,4糖苷键，因此，β-淀粉酶分解淀粉是不完全的。β-淀粉酶作用的终产物是β-麦芽糖和分解不完全的极限糊精。 β-淀粉酶的热稳定性普遍低于α-淀粉酶，但比较耐酸。 （三）葡萄糖淀粉酶 葡萄糖淀粉酶主要由微生物的根霉、曲霉等产生。最适pH为4～5，最适温度在50～60 ℃范围。 葡萄糖淀粉酶是一种外切酶，它不仅能水解淀粉分子的α-1，4糖苷键，而且能水解α-1,6糖苷键和α-1,3糖苷键，但对后两种键的水解速度较慢。葡萄糖淀粉酶水解淀粉时，是从非还原性末端开始逐次切下一个个葡萄糖单位，当作用于淀粉支点时，速度减慢，但可切割支点。因此，葡萄糖淀粉酶作用于直链淀粉或支链淀粉时，终产物均是葡萄糖。工业上用葡萄糖淀粉酶来生产葡萄糖。所以也称此酶为糖化酶。 （四）脱支酶 脱支酶在许多动植物和微生物中都有分布，是水解淀粉和糖原分子中α-1,6
蛋白酶抑制剂的研究进展
蛋白酶抑制剂的研究进展 郭川 微生物专业，200326031 摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。 关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用 天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。 1 结构与功能 1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitor,Serpin） 丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactive site loop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin 以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物，同时P1-P1’间的反应活性位点断裂。几种perpin氨基酸序列比较发现，serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的，且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶，抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶，其中P1为Arg[2]。 1.2巯基蛋白酶抑制剂（Cytsteine Proteinase Inhiitor，CPI） 对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如Ｆ2中的Gln-Ｘ-Val-Ｙ-Gly和CHα-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly 短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用[3]。对植物来源的ＣＰＩ研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) 具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu---Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu---Gly保守区域外,OCI序列中其
粗粮含蛋白酶抑制剂
粗粮含蛋白酶抑制剂。荞麦、燕麦、莜麦、高粱面、红薯等粗粮中，含有抗营养素蛋白酶抑制剂。其中，荞麦、莜麦含量最高。粗粮发酵以后，酵母菌大大降低蛋白酶抑制剂的活性，所以粗粮发酵后蒸窝头、贴饼子等食用为好。 各种粗 粮 甘蓝含有硫苷。卷心菜、紫甘蓝、荠菜、萝卜、洋葱、花菜等十字花科蔬菜中，含有抗营养素——硫苷。硫苷降解的某些产物能抑制甲状腺素的合成和对碘的吸收。硫苷具有两面性，虽然它有副作用，但对子宫癌、乳腺癌等多种癌有显著的抑制作用。硫苷对热敏感，将蔬菜炒熟后，可去除其中的大部分硫苷。理想的做法是，将其一半生吃一半熟吃，这样既可保留防癌成分，又有利于其他营养成分的吸收。 黄瓜等含有抗坏血酸氧化酶。黄瓜、西葫芦、莴笋、水芹、花菜、南瓜等食物中，含有抗营养素——抗坏血酸氧化酶。抗坏血酸氧化酶会破坏蔬菜和水果中维生素C的含量。所以食用黄瓜时不必切开，生吃即可。西葫芦、莴笋、水芹、花菜等蔬菜宜大火快炒，最好不要加醋。 蛋白质抑制剂:这是大豆和其它豆类中存在的一种特殊蛋白质，可以抑制体内胰蛋白酶等十几种消化酶的流活性，其代表为胰蛋白酶抑制剂，它能抑制蛋
白酶对蛋白质的消化吸收。它需经蒸发气加热30分钟或高压蒸气加热15~2 0分钟才能被破坏。 皂角素：大豆中含有的皂角素，对消化道粘膜有强烈的刺激性，人吃了没有煮熟的大豆或豆浆，常会产生恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状，就是由于皂角素没有完全破坏所引起。皂角素需加热至100度才破坏，因此食用豆类或豆浆必须煮开10~20分钟后才能食用。 凝血素：也是一种特殊蛋白质，称为植物血球凝集素，可使人体细胞凝集，但加热即可被破坏，或在体内经蛋白酶作用也可使其失去活性，不致被肠道吸收后引起凝血。 棉子糖合成酶:众所周知，多吃大豆后肚子容易胀气。其原因是大豆中含有一种棉子糖合成酶，它进入人体后，可以合成大量低聚糖，如棉子糖、水苏糖等。这些糖不能被子人体吸收，大部分在肠中被细菌分解利用，同时产生大量二氧化碳、氢和甲烷。但大豆充分加熟后，此酶即被破坏，产气也随之减少；加工成豆制品或发酵制品也可去除这种酶，故吃豆腐、腐乳等豆制品就不会胀气。 植酸:这是一种含磷化合物，一般植物性食品中都含有。但大豆中含量很高，大豆中占60%~80%的磷都是以植酸形式存在，植酸可与蛋白质、无机盐及矿物元素钙、磷、铁、锌等结合而影响其消化吸收。大豆中的锌很难吸收，就是受了植酸的影响，可利用发芽米分解植酸，提高大豆中铁、锌、钙、镁等矿物元素的生物利用率。
常见蛋白酶抑制剂
蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 3)溶液在4℃稳定六个月以上;
4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml); 5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。 胃蛋白酶抑制剂(pepst anti n) l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶; 2)1mg/ml溶于甲醇中; 3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月; 4)1作浓度:0.7ug/ml(1umol/L) 5)在水中不溶解。 亮抑蛋白酶肽(leupeptin) 1)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B; 2)lOmg/ml溶于水; 3)储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度0.5mg/ml。 胰蛋白酶抑制剂(aprotinin) 1)抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶; 2)lOmg/ml溶于水，pH7~8 3}储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度:0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L); 5)避免反复冻融: 6)在pH>12.8时失活。 蛋白酶抑制剂混合使用 35ug/ml PMSF…………………………………丝氨酸蛋白酶抑制剂 0.3mg/ml EDTA…………………………………金属蛋白酶抑制剂 0.7ug/ml胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)…………酸性蛋白酶抑制剂 0.5ug/ml亮抑蛋白肽酶(Leupeptin)……………广谱蛋白酶抑制剂
常见蛋白酶抑制剂
当前位置:生物帮〉实验技巧 > 生物化学技术＞正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期:2012—0６－13 来源:互联网 标签: 相关专题:解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质得同时可释放出蛋白酶,这些蛋白酶需要迅速得被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中,需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解、以下列举了5种常用得蛋白酶抑制剂与她们各自得作用特点,因为各种蛋白酶对不同蛋白质得敏感性各不相同,因此需要调整各种蛋白酶得浓度 恩必美生物新一轮2－5折生物试剂大促销！?Iｂiｄi细胞灌流培养系统－模拟血管血液流动状态下得细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质得同时可释放出蛋白酶,这些蛋白酶需要迅速得被抑制以保持蛋白质不被降解、在蛋白质提取过程中,需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解、以下列举了5种常用得蛋白酶抑制剂与她们各自得作用特点,因为各种蛋白酶对不同蛋白质得敏感性各不相同,因此需要调整各种蛋白酶得浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中得溶解度极低,尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂得沉淀。在宝灵曼公司得目录上可查到更完整得蛋白酶与蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PＭSＦ 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶,胰蛋白酶,凝血酶)与巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); ２)1０ｍg/ｍｌ溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; ４)工作浓度:17~17４ug／ml(0。1～1.0mｍoｌ／L); ５)在水液体溶液中不稳定,必须在每一分离与纯化步骤中加入新鲜得PMSF。 EDTA １)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5ｍol/L水溶液,pH8～９; 3)溶液在4℃稳定六个月以上;
丝氨酸蛋白酶 (2)
丝氨酸蛋白酶 摘要：丝氨酸蛋白酶是一种种类丰富的酶类【1】，之所以以此命名是因为在酶的催化活性位点上包含丝氨酸在内的丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸组成的催化三联体。有些丝氨酸蛋白酶类如凝血酶类蛋白酶，其中包括凝血酶，组织纤维蛋白溶酶原激活剂、血纤维蛋白溶酶，它们参与凝血的发生以及炎症应答反应；也有些如胰蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶类的参与消化的酶类，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶；还有一些表达在神经系统中的丝氨酸蛋白酶类，这些酶类与神经系统正常的维持或是介导病理情况的发生。其实丝氨酸蛋白酶类在执行功能的时候也受到许多因素的限制，如受一些抑制剂的影响等，这些物质对蛋白酶功能的执行起到重要的作用。 关键词：丝氨酸蛋白酶催化机制功能调节 酶的功能 已知所有的蛋白分解酶类丝氨酸蛋白酶占到了其中的三分之一，这些酶又可以细分成很多种类有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂、神经源类的丝氨酸蛋白酶等。这些酶类具有消化凝血、纤溶、消化、受精、生长发育、凋亡、免疫等方面都有重要的作用。 酶的催化位点 由于丝氨酸蛋白酶的种类很多根据其催化的特点以及种树亲疏性可以分成不同的类别，不同的组织器官，不同的生物种系中酶的分布与种类是不同的(见表格)。但是其催化特点通常都是其反应的催化三联体，丝氨酸的亲核攻击，即丝氨酸的羟基攻击酰胺键的羰基碳，但是在生物进化的长时间了这种催化活性结构也发生了改变。如在有些酶中其催化三联体不在是固定的丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸，而是只有丝氨酸与天冬氨酸或是组氨酸的一种组成催化活性位点，也有的如组氨酸成对出现于丝氨酸组合形成新的催化结构，但是无论怎样其上的丝氨酸残基是固定保守的。 酶的活化 对于丝氨酸蛋白酶类的活化，一般来说是通过对酶前体【2】的加工使其形成具有催化活性的酶，或者是通过一些辅助因子的协同作用使其由闭合的非活化状态转成活性状态，也有通过信号的捕获诱发一系列的级联反应从而活化蛋白，或是通过一些关键因子的作用使得构想发生改变来实现活化等等。通常来说酶的状态一种是抑制非活化状态，另一种是活化的活性状态，但是在一些研究中酶具有新的状态，而这种状态与酶原或是缺少辅因子而显示无活性的酶的状态是不同的，虽然这种状态下的酶也没有活性，但是其结构上出现一些特有的变化，在对凝血酶的研究中发现，这种状态称为E*【3】，其伴有一些氨基酸链陷入酶的催化活性部位从而破坏其中的氧离子空穴，致使没得活性受阻，因此对于这种酶的活化一定有其他的方式，研究发现当E*状态下在远离活性部位连接一种配体时会将这种氨基酸陷入活性位点的状况扭转过来，从而恢复酶的活性位点，并在其他因子的作用下得到活化。 酶的催化机制 对于丝氨酸蛋白酶类的催化活性，有的是通过前体酶原的活化，比如胰蛋白酶类
酶在食品中的应用
多种酶在食品中的应用 学生：李慧娜指导老师：胡亚平所在学校：湖南农业大学 摘要：酶是生物活细胞产生的一类具有催化功能的蛋白质。酶的催化效率高，具有很高的专一性，需比较温和的条件。因此，酶在食品科学中相当重要，通过酶的作用能引起食品原料的品质发生变化，也能在比较温和的条件下加工和改良食品。食品加工中几种重要的酶有淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、多酚氧化酶、脂肪酶以及其他一些氧化酶等。酶在食吕保藏中也起着非常重要的作用。酶不仅影响着食品的感观功能而且也影响着食品的营养功能。不同的酶在在不同的产品中发挥着不同的作用。 关键词：多种酶食品应用 随着食品工业的快速发展，人们的食品安全和健康意是益增强，对食品的要求愈来愈高。为了让人们吃得放心，吃得健康，研究酶在食品中的应是一个具有重大意义的项目。目前，绿色健康消费已经成为新的消费时尚，首选绿色天然食品的观念已在消费者心中根深蒂固，酶法保鲜广泛应用于食品的贮藏之中。因此，大力推广酶在食品贮藏中的应用已成为广大消费者的心声。由于酶的高效性，专一性，以及影响反应速度的因素的可控制性使得酶的研究逐具有广大的前景。 一、酶对食品感观功能的影响以及营养功能的影响 （一）酶对食品感观功能的影响 内源酶类对食品的风味、质构、色泽等感观质量具有重要的影响，其作用有的是期望的，有的是不期望。如动物屠宰后，水解酶类的作用使肉嫩化，改善肉食原料的风味和质构；水果成熟时，内源酶类综合作用的结果会使各种水果具有各自独特的色、香、味，但如果过度作用，水果会变得过熟和本酥软，甚至失去食用价值。 （二）酶对食品营养功能的影响 脂肪氧合酶催化胡萝卜素降解而使面粉漂白，在蔬菜加工过程中则使胡萝卜素破坏而损失维生素A源；在一些用发本酵方法加工的鱼制品中，由于鱼和细菌中的硫胺素酶的作用，使这些制品缺乏维生素B1；果蔬中的Vc氧化酶及其它氧化酶类是直接或间接导致果蔬在加工和贮存过程中维生素C氧化损失的重要原因之一。 二、多种酶在食品中的应用 （一）淀粉酶 淀粉酶在食品工业上应用很广泛。淀粉酶制剂是最早实现工业化生产和产量最大的酶制剂品种，约占整个酶制剂总产量的50%以上，被广泛应用于食品、发酵及其他工业中。 淀粉酶用于酿酒、味精等发酵工业中水解淀粉；在面包制造中为酵母提供发酵糖，改进面包的质构；用于啤酒除去其中的淀粉浑浊；利用葡萄糖淀粉酶可直接将低黏度麦芽糊精转化成葡萄糖，然后再用葡萄糖异构酶将其转变成果糖，提高甜度等。目前商品淀粉酶制剂最重要的应用是用淀粉制备麦芽糊精、淀粉糖浆
蛋白酶抑制剂选择指南
蛋白酶抑制剂选择指南 1 蛋白酶抑制剂选择指南 抑制剂 工作浓度 分子量 抑制蛋白酶种类 稳定性 AEBSF终浓度1mM MW:239.5不可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制胰蛋白酶,糜 蛋白酶,纤溶酶,凝血酶及激肽释放酶. 可溶于水,其pH7的水溶液在4o C可保持稳定1-2个月,在pH>8的情况下会发生缓慢水解 Aprotinins 抑肽酶终浓度2ug/ ml MW:6512 可逆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制纤溶酶,激肽 释放酶,胰蛋白酶,糜蛋白酶,但不抑制凝血酶和 Factor Xa。 非常稳定,当pH>12.8时失去活性,可溶于 水(10mg/ml),-20o C下可长期保存 Bestatin终浓度10uM MW:308.4 可逆的丙氨酰-氨基肽酶抑制剂, 工作液可保存一天,1mM的甲醇贮存液在 -20o C可保存至少一个月 E-64 Protease Inhibitor终浓度10uM MW:357.4 不可逆的半胱氨酸酸蛋白酶抑制剂,抑制半胱氨酸 酸蛋白酶而不会影响其他酶的半胱氨酸残基,与小 分子量的巯基醇如beta-巯基乙醇不会产生反应, 具有高度特异性。工作液在正常pH值下可保持稳定数天,1mM的水溶液在-20o C可保存几个月 EDTA, 4Na终浓度10mM MW:380.2 金属蛋白酶的可逆性螯合物,可能同时影响其他金 属依赖性生物过程。其水溶液很稳定,其贮存液(pH8.5的0.5M 水溶液)在4o C可保存数月 Leupeptin, 半硫酸盐 亮抑酶肽（亮肽素） 终浓度100uM MW:493.6 可逆的丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶制剂,可抑制胰蛋 白酶样蛋白酶及一些半胱氨酸蛋白酶如:Lys-C内 切蛋白酶,激肽释放酶,木瓜蛋白酶,凝血 酶,Cathepsin B及胰蛋白酶。 工作液的稳定期为数小时,贮存液(10mM 水溶液)在4o C时稳定期为一周,-20o C时 稳定期为一个月 Pepstatin A 终浓度1uM MW:685.9 可逆的天冬氨酸蛋白酶,可抑制胃蛋白 酶,Cathepain B&L,血管紧张肽原酶(renin)及以1mg/ml溶于甲醇,搅拌过夜可以 1mg/ml溶于乙醇,333mg/ml溶于6N的
蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展
蛋白酶抑制剂基因及转基因植物研究进展 摘要： 植物蛋白酶抑制剂是除Bt之外又一个愈来愈研究较多的抗虫基因资源，其分布广泛，在豆科、茄科、禾本科、葫芦科及十字花科等植物中存在较多。植物蛋白酶抑制剂抗虫基因主要通过2种途径获得并在多种植物中进行转化，获得抗虫转基因植株。植物蛋白酶抑制剂在基因工程中的应用已有很大的发现进展。 关键字：蛋白酶抑制剂基因作用机理转基因 正文： 一蛋白酶抑制剂作用机理 广泛存在于植物组织中的蛋白酶抑制剂是一种多肽物质, 对许多昆虫有防 卫作用。该基因及其编码区域较小、没有内含子。研究表明, 这些蛋白酶抑制剂在植物对危害昆虫以及病原体侵染的夭然防御系统中担当着重要角色。昆虫饲喂实验发现, 某些纯化的蛋白酶抑制剂具有明显的抗虫作用。利用蛋白酶抑制剂基因来提高植物的抗虫能力, 已成为植物基因工程研究的一个热门领域。在植物中发现有三类蛋白酶抑制剂: 丝氨酸蛋白酶抑制剂, 琉基蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中对丝氨酸类蛋白酶抑制剂的研究最为透彻, 目前在植物中至少已经发现有6 个家族, 其中的弧豆胰蛋白酶抑制剂, 马铃薯蛋白酶抑制剂兀的抗虫效果最为理想。蛋白酶抑制剂的杀虫机理蛋白酶抑制剂杀虫的机理在于: 它能与昆虫消化道内的蛋白消化酶相互作用形成酶抑制剂复合物( E l ) 阻断或减弱消 化酶的蛋白水解作用。所以, 一旦昆虫摄食进蛋白酶抑制剂, 就会影响外来蛋白的正常消化, 同时, 蛋白酶抑制剂和消化酶形成E l 复合物, 能刺激消化酶的过 量分泌, 通过神经系统的反馈, 使昆虫产生厌食反应。由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进食及消化过程, 不可避免地将导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸, 最终造成昆虫的非正常发育或死亡。 二植物蛋白酶抑制剂基因作用机理及获得的途径 蛋白酶抑制剂基因的作用机理及其应用蛋白酶抑制剂( P l ) 是自然界含量 最为丰富的蛋白种类之一, 存在于所有生命体中。国内外有关抗虫的植物蛋白酶抑制剂基因的获得大多通过2种途径。一种通过从植物不同部位的组织或细胞中提取抗虫活性蛋白，然后分析其起作用的活性核苷酸序列，继而克隆和转化到寄主细胞，进行筛选和选育抗虫树种。利用该方法获得抗虫树种的研究越来越多，该方法中最为关键的环节是蛋白酶抑制剂提取和活性测定方法的选择和建立。植物蛋白酶抑制剂分离和纯化的策略主要依据不同植物中的蛋白酶抑制剂生理生
中性蛋白酶在生活中应用
中性蛋白酶在生活中的应用 中性蛋白酶是蛋白酶中的一种，在日常生活中应用广泛。 众所周知，蛋白酶是一种活性酶是生物体内的一种酵素（酶），通过打断肽键有效催化分解蛋白质，是一种最重要的工业酶制剂，可催化蛋白质和多肽的水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。大量使用于干酪生产、肉类嫩化和植物蛋白改性中。 目前在焙烤工业中使用的蛋白酶有霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶和植物蛋白酶。面包生产中使用蛋白酶能改变面筋性能，其作用形式和面包调制时力的作用及还原剂的化学反应不同。蛋白酶的作用不是破坏二硫键，而是断开形成面筋的三维网状结构。蛋白酶在面包生产中的作用主要表现在面团发酵过程中。由于蛋白酶的作用，使面粉中的蛋白质降解为肽、氨基酸，以供给酵母碳源，促进发酵。 而中性蛋白酶是指能够在中性或弱酸、弱碱性环境中发挥作用的一类蛋白酶，最适pH 值介于6.0～7.5，能催化蛋白质肽键的水解，具有催化反应速度快、无工业污染、反应条件适应性宽等优点。根据催化机制不同，中性蛋白酶又可分为丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶等四大类。 中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌发酵而来的，其用途广泛。 例如可用于动植物蛋白的水解、生产高级调味品和食品营养强化剂。再比如，可利用各种动物来源性抽提物生产功能性骨、肉提取物(骨素)、水产提取物、蛋白胨、肽等，并可研究开发一些高附加值的功能食品。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油的生产中，添加中性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质分解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，水解度高，风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂。 这是由于中性蛋白酶可以水解面团蛋白胨、肽和氨基酸，从而减弱面团的强度，使其具有良好的可塑性和延伸性，保持清晰和美丽的版画。同时还可提高产品的光泽，使饼干节清楚，结构均匀，口感清爽舒适。中性蛋白酶还能水解大豆分离蛋白成小分子肽，大大提高了大豆分离蛋白的生物效价，使其易为人体消化吸收，同时还提高了溶解，降低了粘度，改善了大豆分离蛋白的功能特性。 此外，中性蛋白酶也可广泛用于皮革脱毛、软化、丝绸脱胶。 总之，中性蛋白酶是一种非常重要的蛋白酶，在我们日常生活中被广泛应用。随着生
蛋白酶抑制剂的配制
How to make protease and phosphotase inhibitors Protease inhibitors are rapidly inactivated in aqueous solutions and should be added to solutions immediately before use. Cocktail solutions are stored at -20 degrees and are good for approximately 6 months. I. Protease Inhibitor Cocktail The Protease inhibitor cocktail is used as 100X for extract preps and as 1000X for column elution buffers. Cocktail is made in 100% EtOH and contains: Some components are not completely soluble in 100% EtOH. Vortex solution well before use to obtain a cloudy suspension and add to buffer - they become soluble in aqueous II. 100 mM PMSF PMSF is very unstable in aqueous solutions. The 100 mM stock solution is made in isopropanol and stored in the dark at -20 degrees. Must be warmed (37 degrees) to get into solution. Use at 1 mM in solutions.