丝氨酸蛋白酶的相关研究
丝氨酸蛋白酶的相关研究
摘要：本文概述了丝氨酸蛋白酶的酶学基础，反应机制，该酶抑制剂的设计及其应用。丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。其激活是通过活性中心一组氨基酸残基变化实现的，它们之中一定有一个是丝氨酸（其名字的由来）。在哺乳类动物里面，丝氨酸蛋白酶扮演着很重要的角色，特别是在消化，凝血和补体系统方面。正是由于该酶的特殊性质，使其在众多领域都有所应用。
关键字：丝氨酸蛋白酶；酶学基础；反应机制；应用
Abstract：This article provides an overview of the serine protease enzyme, reaction mechanism, the design and application of enzyme inhibitors. Serine protease is a protease family, their roles are to break large protein molecules in the peptide bond, to become small molecular protein. Its activation is through the active center of a group of amino acid residues change, they must have a serine (the origin of the name). In mammal animal, serine proteases play a very important role, especially in the digestion, Coagulation and complement systems. Because of the special nature of the enzyme, and it has been applied in many fields.
Keywords: Serine protease; fundamentals of enzymology; reaction mechanism; application
绪论
丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要的广泛的生理作用[1]。它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。通过对蛋白酶原的激活或抑制而起调节因子作用，丝氨酸蛋白酶还在胚胎发育、组织重建，细胞分化，血管形成和病原侵入等过程中都发挥着重要的作用，特别是在消化，凝血和补体系统方面[2-3]。此类蛋白酶的催化基团包括1个不可缺少的Ser残基，DIFP是它们的不可逆抑制剂。
1 丝氨酸蛋白酶学基础
1.1 丝氨酸蛋白酶的分类及作用原理
1.1.1 消化酶
由胰脏分泌的，其中里面有三种是丝氨酸蛋白酶。
⑴糜蛋白酶
又称为胰凝乳蛋白酶，水解酶类的一种肽链内切酶，主要促使疏水性氨基酸尤其是酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸的羧基端多肽裂解。
⑵胰蛋白酶
属水解酶类，促使肽链分裂，作用部位为精氨酸或赖氨酸羧基；此酶以酶原形式由胰释出，在小肠中转化为活性形式。
⑶弹性蛋白酶
弹性蛋白酶（EC 3.4.21.36.），水解酶类的一种，对丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸等含羧基的多肽键起催化水解的作用，因曾认为此酶主要作用于弹性蛋白而有此命名。它是胰以酶原(弹性蛋白酶原)形式分泌的一种丝氨酸蛋白酶，参与肠内蛋白消化。
这三种酶的一级结构（氨基酸序列）和三级序列（所有原子的空间排布）相似。它们的活性丝氨酸残基都是在同一位置(Ser-195)。
1.1.2 凝血因子
几种激活的凝血因子都是丝氨酸蛋白酶。
⑴凝血第十因子(X)
也称Stuart-Power因子，参于内源性和外源性凝血途径的一种耐贮存因子。缺乏可致系统性凝血障碍(第十因子缺乏症)。
⑵凝血第十一因子(XI)
即是血浆凝血酶活酶前质：作用于内源性凝血途径的一种稳定因子。缺乏这种因子会引起系统性血凝缺陷，即C型血友病或Rosenthal综合征，与典型血友病相似。
⑶凝血酶
来自凝血酶原，可促使纤维蛋白原变为纤维蛋白的酶；纤维蛋白溶酶是溶解纤维蛋白或血凝块系统的有效部分，是对纤维蛋白有高度特异性的蛋白分解酶，对已经形成的纤维蛋白凝块有特别的溶解力，对其他血浆蛋白、凝固因子和一般蛋白质也有类似作用。
1.1.3 补体系统
补体系统里面有几种蛋白质属于丝氨酸蛋白酶。包括：C1r 和C1s。C3转化酶裂解补体成分C3为C3a和C3b的酶；经典途径C3转化酶是C4b，2b；旁路C3转化酶是C3b，Bb和C3b，Bb。
1.1.4 作用原理
通过邻近的氨基酸残基链，丝氨酸残基在活性中心被激活。被激活的羟基与肽键的碳原子发生亲核反应，肽键断裂后，酰基上的碳被酯化，肽键的氮端会被释放游离。水解反应，与酶相连的碳端产物被释放。
1.2 丝氨酸蛋白酶的结构与功能
1.2.1 丝氨酸蛋白质的结构
这类蛋白酶以一个特定的Ser残基作为必需的催化基团，属于该家族成员的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶和组织型纤溶酶原激活剂。
丝氨酸蛋白酶的催化机制属于共价催化和广义酸碱催化的混合体，由三个不变的氨基酸残基构成的催化三原体（Ser、His和Asp）起主导作用，这三个氨基酸残基任何一种突变或修饰（例如，Ser被DIPF修饰）均可导致酶活性的丧失。
1.2.2 丝氨酸蛋白酶的功能
虽然各种丝氨酸蛋白酶具有高度的同源性，但构成催化三元体的三个氨基酸残基在肽链中的位置并不完全相同。然而，酶学家已达成共识，将这三个氨基酸残基总是进行一样的编号，即His57、Asp102和Ser195.它们的催化中的具体功能是：
① Ser195充当进攻底物的亲核基团；
② His57作为广义的酸碱催化剂；
③ Asp102的功能仅仅是定向His57，影响His的pKa，改变其酸碱性质。
⑴胰蛋白酶
胰蛋白酶具有很深的底物结合口袋，而口袋的底部又是Asp。特别适合长的碱性氨基酸侧链（Lys和Arg）的结合。
⑵糜蛋白酶
糜蛋白酶的底物结合口袋没有胰蛋白酶深，但比它宽，而且口袋壁分布的是疏水氨基酸，所以特别适合芳香族氨基酸的结合。
⑶弹性蛋白酶
弹性蛋白酶的底物结合口袋非常浅，最适合结合侧链较小的氨基酸残基。
2 丝氨酸酶反应机制实例[4]
2.1 动力学研究（以胰凝乳蛋白酶为例）
凝乳蛋白酶在体外可以水解具有酯键和酰胺键的小分子化合物，但专一性较低。这一特点在生理条件下是不重要的，但在体外动力学机制研究时很有意义。Brian以对硝基苯乙酯作为胰凝乳蛋白酶的底物，反应呈两相进行。
（1）“快速释放”相（Burst Phase）是在很短的时间内，每摩尔酶释放出等摩尔的对硝基酚。（2）稳定相（Steady State Phase）是反应速度降低，进入线性阶段。
这种现象解释为整个反应分两个过程：①迅速释放对硝基酚，酶本身被乙酰化；②乙酰化酶缓慢水解，释放乙酸。
2.2 中间物检测
胰凝乳蛋白酶催化酯的水解分酰化和脱酰两个过程。脱酰反应与溶液的pH值密切相关。当pH值足够低时，脱酰反应十分缓慢，甚至可分离到酰化酶中间物。实验结果显示酰化反应发生在Ser195侧链上。
当酶水解酰胺底物时，脱酰反应速度远高于乙酰化过程，故酰化酶中间物不会“堆积”，即不可能直接收集，只能由实验间接地“捕捉”（Trapping）。如，酶促水解过程中加入高浓度的丙氨酰胺或羟胺类亲核剂与水分子竞争酰化酶。
以酯为底物时，可直接得到乙酰酶中间物，并可测出两种产物的比值。当以酰胺为底物时，加入相同浓度的亲核试剂，可观察到同样产物的比值，因此推测酰胺水解过程中也存在酰化酶中间物。
2.3 鉴定必需基团
为了鉴别胰凝乳蛋白酶分子上的必需基团，曾做过大量的研究工作。这儿介绍一些经X 射线研究证实有功能的侧链修饰实验。
2.3.1 Ser195
用二异丙基磷酸（DFP或DIPE）进行修饰，酶被不可逆失活，除了Ser195外，酶分子上其余的Ser侧链都未参与修饰反应。
DIPE修饰酶起源于人们发现有机磷化合物为强的神经毒剂。DIPE可使乙酰胆碱酯酶失活，乙酰胆碱酯酶为催化胆碱水解的丝氨酸酯酶，该酶失活将阻碍神经冲动。Ser还可以用苯甲烷碘酰氟进行修饰。
2.3.2 His57
一些成功的亲核标记实验，证明了His57与酶催化活性有关。对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）和底物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰甲酯（TPME）结构相似。TPCK可使酶失活，并存在着化学计量关系，修饰部位为His57。但TPCK不能使胰蛋白酶失活，这说明两种酶底物结合口袋不同。相反，对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酮（TLCK）可使胰蛋白酶失活，但不作用于胰凝乳蛋白酶。TLCK与胰蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯（TLME）结构非常相似，这两种试剂在蛋白质顺序研究中应用较多，如制备胰凝乳蛋白酶时用TLCK处理酶以防有胰蛋白酶污染，反之亦然。
2.3.3 Ile16
化学修饰实验还证明看胰凝乳蛋白酶上Ile16的а-氨基具有重要的功能。在通常情况下，要选择性地修饰这一氨基十分困难，双标记（Double Labelling）实验可以解决这一问题。胰凝乳蛋白酶原首先与酸酐（Ac2O）反应，使分子上所有的а-和ε-氨基乙酰化，然后用胰蛋白酶作用产生完全有活性的δ-胰凝乳蛋白酶，其中Ile16具有自由的氨基，再与14C标记的酸酐作用，发现酶失活与掺入Ile16的а-氨基的同位素量成正比，证明了酶活性中这一集团的总要性。
2.3.4 Asp102
专一性化学修饰Asp较为困难，因而采用了定点突变技术直接验证该侧链的功能，将
Asp102换成Asn，胰蛋白酶突变体D102N
动力学分析表明Km不变，但Kcat为天然酶的0.05%，中子扩散技术和X射线衍射法研究都认为Asp102以离子化形式存在，而不是从咪唑环上吸取一个质子成为质子化的形式。2.4 X射线结构研究
牛胰凝乳蛋白酶、牛胰蛋白酶、猪弹性蛋白酶之间氨基酸序列表现出严格的同源性，大约40%的一级结构为保守结构，与催化功能有关的基团非常详实，X射线研究表现三者之间的三维结构也高度相似，胰凝乳蛋白酶的立体结构。分子形状呈椭圆形，最长处距离5.1nm。三条肽链由5个二硫键维系，α-螺旋结构很少，只有两部分，分别位于163-173及235-245残基之间，大部分为反平行的β-折叠片，主要集中在27-112及133-230残基之间。X射线研究发现在猪胰腺凝乳蛋白酶的空间结构中，主要也是由反平行的β-折叠片和少量的螺旋结构组成。尤其需要注意的是牛胰腺凝乳蛋白酶中一些荷电氨基酸，如Asp102、Ile16、Asp194深埋在分子内部，一般非极性氨基酸侧链往往位于分子内部，远离水分子，而极性氨基酸多处于分子表面。如果有例外，这一氨基酸必有特殊作用，说明这些氨基酸侧链对酶的活性有重要贡献。
虽然这三种酶严格同源，但它们作用底物的专一性不同，这与它们底物结合部位的差异有关。
胰凝乳蛋白酶的结合部位为一非极性的口袋，因而喜欢作用具有芳香性或体积较大的疏水性侧链；胰蛋白酶结合部位中Asp189替代Ser189，所以它偏爱带正电荷侧链的底物；弹性蛋白酶结合口袋中Val和Thr分别代替了2个Gly，其他部分与胰凝乳蛋白酶相同，故大体积的底物分子难以进入口袋，偏爱作用于体积较小的疏水侧链，其专一性较宽，可作用Ala、Gly、Val等，并由此而得名。相反，胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶因结合部位不能很好地固定这些小的氨基酸侧链，因而水解具有这些氨基酸残基的肽链速度很慢。
胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶。弹性蛋白酶氨基酸顺序和空间结构的相关性，说明它们在进化上有密切关系，推测可能来自共同的祖先。通过基因突变，出现性能上某些差异而发生趋异进化。另两个来自细菌的丝氨酸酶可以进一步说明丝氨酸蛋白酶家族进化上的关系。Stroptomyces griseus 蛋白酶A（SGPA）是具有胰凝乳蛋白酶专一性的（Chymotryptic Specibicity）丝氨酸蛋白酶。X射线研究表明，该酶与胰脏的丝氨酸蛋白酶比较，保守顺序小于20%，但空间结构极其相似。枯草杆菌蛋白酶（最初从Bacillus subtilus 分离得到）与胰凝乳蛋白酶相比，它们的一级结构和空间结构似乎没有区别，但活性部位的基团基本相同，相应的三级结构的位置也几乎没有区别，但活性部位的氨基酸残基的顺序则大不相同，这是一个趋同进化的典型实例。
此外，学液凝固中的凝血酶也是丝氨酸蛋白酶，其以及结构和三级结构与哺乳动物胰脏来源的酶区别较大，但其活性部位的结构及作用机制却非常相似。上述的实例表明，丝氨酸蛋白酶家族在进化上密切相关。
2.5 作用机制及其验证
2.5.1 丝氨酸蛋白酶的作用机制
丝氨酸蛋白酶的同源性表明它们具有相同的催化机制。基于大量的化学和架构资料的分析，人们描绘了丝氨酸蛋白酶的催化机制，现以胰凝乳蛋白酶为例介绍如下。
A.四面体中间物形成
在胰凝乳蛋白酶活性中心的氨基酸侧链中，当酶与底物结合时，形成米氏复合物，Ser195亲核攻击羟基形成四面体中间物（共价催化）。
X射线分析认为Ser195处于不利的位置（邻近和定向效应），是一个有效的亲核攻击基团。His57吸收释放的质子，起广义碱的作用，这一过程为Asp102加强。极化的Asp102与His57的氢发生静电相互作用（静电催化），酶的催化即从形成短暂的四面体结构开始。
B.形成乙酰化酶中间物
四面体结构在His57N（3）质子供体作用下（酸碱催化）分解，形成酰化酶中间物，R′NH2从酶分子上释放并由溶剂H2O替代。这一过程极不稳定，但人们还是分离得到了弹性蛋白酶的酰化酶中间物（-55℃条件下），并进行了X射线结构的研究。
C.脱酰过程
脱酰反应是酰化反应的逆过程，释放生产物羧酸，酶得以再生。在这一过程中，H2O为亲核试剂。
2.5.2 丝氨酸蛋白酶作用机制验证
上述胰凝乳蛋白酶作用模型经很多实验证明是合理的。下面列举一些成功的实验证据。
A.四面体中间物存在的实验依据
Robert Huber 对胰酶和牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）复合物的X射线研究结果是四面体中间物存在的有力证明。BPTI是具有58个氨基酸残基的蛋白质，与胰蛋白酶结合时，因形成复杂的氢键网络而使酶失活。这个复合物的结合常数高达1013（mol/L）-1，是已知的蛋白质之间最强的相互作用。
B.丝氨酸蛋白酶优先于过渡态底物结合
一些丝氨酸蛋白酶与抑制剂结合的复合物，它们的结构经X射线仔细研究、比较，使人们搞清了这些酶作用的结构基础。
(1) 随着四面体中间物形成而产生的构象变化导致了被水解肽键的羰基氧更加靠近活性中心部位，以利于占据称为氧阴离子洞的（Oxyaninon Hole）空穴。
(2) 在此空穴中，酶与羰基氧形成两个氢键，而在正常的结构中不存在这种氢键。
(3) 四面体形变结果，使在水解肽键前，酶与胎骨架上—NH—形成近似氢键，因而酶容易同四面体中间物结合。
这些现象解释了丝氨酸蛋白酶的高催化效率。事实上，由于DIPF四面体结构是过渡态类似物，因而是丝氨酸蛋白酶有效的抑制剂。
C.催化三元组的功能
早期的文献认为Asp102极化了His57，使其直接从Ser195吸取质子，而使Ser195成为有效的亲核攻击试剂（羟基）。事实上，用对硝基苯磺酸甲酯处理胰凝乳蛋白酶，使His57专一性地甲基化，以阻断催化三元组的作用。
然而，产生的酶仍有较好的催化活性，比非酶催化的反应加速2×106倍（天然酶约1010倍）。很明显，催化三元组的功能很大程度上是作为质子供体和质子吸收器（酸碱催化），胰凝乳蛋白酶速度增加的主要因素恐怕主要来源于与反应的过渡态优先结合。
3 酶工程(酶的抑制剂设计)
丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpin）是一类拥有超过500个成员的蛋白酶超家族，其三级结构高度保守，在食物消化、补体激活、血液凝固等生理过程中起重要作用。
3.1 体内凝血过程中丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用
以凝血过程为例，正常生理条件下，由于存在体内凝血系统，伤口处血液流失可以很快被形成的血纤维蛋白凝块中止。但凝血系统异常会导致一系列疾病，如冠状动脉血栓的形成会导致心肌梗塞等。由于血液凝固的级联放大过程中凝血酶位于中心地位，其抑制剂的研究时早起抗血栓药研制的重点。肝素是常用的抗凝血药物，但有时会引起血小板减少和出血症。因此，人们把注意力转向研制凝血酶的抑制剂，但直接抑制凝血酶能再临床上导致出血并发症，尤其与抗血栓药物TPA等合用时后果更严重。此外，凝血酶的抑制剂并不能阻止循环系统中大量的凝血酶原转化为凝血酶。与传统药物肝素等相比，催化凝血酶原转化为凝血酶的活性Xa因子的抑制剂专一性高，副作用小，更为安全有效。
3.2 Xa因子的抑制剂
Xa因子是一种类似于胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶（a表示活化的意思，activatied），在钙离子和V因子存在下，Xa因子和凝血酶原复合物粘附到血小板的带负电荷的磷脂表面，随后凝血酶原被活化。Xa因子切割底物凝血酶原各种底物和抑制剂。天然存在的Xa因子抑制剂有墨西哥水蛭中提取的119个氨基酸组成的多肽ATS（Antistasin），60个氨基酸组成的壁蚤抗凝固胎TAP（Tick Anticoagulant Peptide）和水蛭唾液中提取的由133个氨基酸组成的多肽Yagin。这些抗血栓药物都已实现了DNA重组表达。
3.3 组合胎库法
人工设计的小分子抑制剂至少有几十多种，都死基于敏感键两端Gly-Arg（P2-P1）氨基酸的结构特征进行构建并加以优化合成了各种系列抑制剂。这种基于酶作用机理研究的药物设计是一种非常有效的方法，为了快速寻找和高通量的筛选新的小分子抑制剂，组合肽库是一种很好的方法。该方法的原理基于20世纪60年代提出的多肽固相合成法，以三个配体合成为例，用仅仅三个配体和三部反应就可产生27种化合物，每一种不需分离就可进行检测，一旦检测到有药物活性的“起始化合物”，就可用化学方法优化这种物质的结构，使其性质适合于药物。
通过筛选D-氨基酸、L-氨基酸、环状的D-氨基酸、L-氨基酸肽库，最后在L-氨基酸肽库中找到了Xa因子的多肽抑制剂，其N端的序列特征为L-Tyr/Phe-Ile-Arg，并对Xa因子的底物表现出竞争性抑制。对Xa因子具有抑制性的戊肽，简称SEL1691进行缺失研究发现，C 末端去除1-3个残基对SEL1691抑制活性影响较小，但N末端去除Ala会灭火戊肽的抑制活性。一些非天然的氨基酸如吡啶丙氨酸，甲基苯磺酰甘氨酸等可以替代Tyr，Ile基本不可置换，但环己基甘氨酸替换Ile得到的SEL2316却使抑制活性提高了60倍。N末端分别对氨基苯丙氨酸和环己基甘氨酸形成的SEL2489活性不变，但半衰期较长，进一步用Arg的类似物甲基-吡啶-丙氨酸代替Arg得到的SEL2711稳定性更好。
化学和生物科学的迅速发展使传统的寻找药物的方法发生了根本性的变革，对于天然产物的筛选曾经是药物化学家关注的焦点。传统的样品筛选首先需分离纯化，测试所需的量也较大，而现在筛选多用生物学检测方法，不需要对混合物进行分离，只有测得有生物活性时才需要进行药物提取，且微量样品足以进行活性测定。传统的药物化学家一年可合成数百个样品供药物筛选，这些样品如今通过自动分析仪一天就可完成活性检测，这种快速筛选法反过来对于样品的提供带来了极大的压力。因此，类似于肽库合成的化学组合合成法可提供为数众多的样品供药物筛选，
由此可见，传统的药物设计方法与组合库的方法互为补充，将筛选到的新的化合物进行结构修饰、优化，现已成为药物研究的新的方向。
4 酶应用
随着酶的制备、酶和细胞固定化、酶分子改造、酶反应器等酶技术的不断发展，酶应用的范围亦在不断地扩大，主要是在医药、食品、纺织以及日用化学工业方面，另外在环境保护以及能源开发及生物工程、化学分析以及生物传感器等方面也有重要应用[5]。酶的应用是酶工程的重要内容之一。
丝氨酸蛋白酶在心血管疾病医治方面有广泛的应用。由纳豆芽孢杆菌产生的具有纤溶性的丝氨酸蛋白酶-纳豆激酶，可经口服直接作用于交联纤维蛋白，同时增加内源性纤溶酶的活性。从蚯蚓身上提取的蚯蚓纤溶酶具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有类尿激酶的纤溶酶原激活活性，因此既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成。蛇毒丝氨酸蛋白酶属于糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，大多数能对凝血/纤溶系统起作用。TSV-PV是非常专一的蛇毒纤溶酶原激活剂，对生理性丝氨酸蛋白酶抑制剂有很强的耐受性。
丝氨酸蛋白酶在真菌基础性研究中也有应用。致病性真菌在体外或感染宿主过程中能够分泌内源性和外源性胞外蛋白酶，已引起广泛关注。利用菌株细胞芯片技术结合免疫组化方法可以检测各型新生隐球菌菌株细胞中丝氨酸蛋白酶的表达分布情况，横向对比丝氨酸蛋白酶在新生隐球菌致病过程中的作用。
丝氨酸蛋白酶作为一类重要的水解酶，人们对其结构、功能及重组表达的研究已经很深入，并且已经有不少种类的丝氨酸蛋白酶被应用到医药等领域。在这些研究成果的基础上，人们可以通过丝氨酸蛋白酶基因的克隆、重组、表达以及蛋白互作等方面的研究为丝氨酸蛋白酶的应用提供新的思路。
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木瓜蛋白酶的研究进展
木瓜蛋白酶的研究进展2010-2011学年第2学期《食品添加剂》课程论文 得分
摘要 木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，具有较高的热稳定性。在食品工业中主要用于啤酒和其他酒类的澄清，肉类嫰化，饼干、糕点松化及蛋白质水解生产等，在医药工业中也有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域。由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。 关键字:木瓜蛋白酶固定化食品工业
1.木瓜蛋白酶的概述 木瓜蛋白酶（papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素，别名番木瓜酶,木瓜朊酶,番瓜酵素。木瓜酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 纯木瓜蛋白酶系由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23.406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶。 2.木瓜蛋白酶的特点 木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。 3.木瓜蛋白酶的作用机制 作用方式：木瓜蛋白酶是一种内切酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精以及低聚糖中的a-1,4糖苷键。酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格。 木瓜蛋白酶（Papain）是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。 木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。 4.木瓜蛋白酶在各个行业的应用 （1）医药工业应用： 含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 （2）食品工业应用： 可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，广泛适用于如：鸡、猪、牛、海产品、血制品、大豆、花生等动植物蛋白酶解、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 梁化亮 （生物与食品工程学院，常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。 [关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御
1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体的蛋白酶抑制剂在机体与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类 目前，典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，至少可分为18个家族[5]，如表1－1所示。不同家族抑制剂的空间结构也不同。通常这类抑制剂是β片层或混合了α螺旋和β片层的蛋白质，也可能是α螺旋或富含二硫键的不规则蛋白质。但它们都拥有规的反应活性位点环的构象，从而使这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能[6]。因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化。 1.2 Serpins Serpins是一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，氨基酸残基数为
胶原蛋白的研究进展及其应用
胶原蛋白的研究进展及其应用 林祥明 厦门大学生命科学学院，福建厦门（361005） E-mail：lxmwxr@https://www.docsj.com/doc/b516730910.html, 摘要：胶原蛋白来源广泛，有许多优良性质且用途广泛。本文概述了胶原蛋白的结构、特性、研究现状及其制备方法，阐述了胶原蛋白及其水解产物在化妆品、医药、功能保健食品等相关领域的应用。 关键词：胶原蛋白制备进展应用 1. 引言 胶原蛋白为人体主要的细胞外间质成分之一，是人体蛋白质的一大家族。胶原蛋白分子的异常合成与沉积是纤维化反应的基础。在胚胎发育、组织重建、损伤修复等过程中，生长因子及分化因子对胶原蛋白基因的表达具有重要的调控作用[1]。近年来人们进行了这些因子等对胶原基因转动调控作用的研究，这将有助于阐明胶原蛋白基因表达的调控机制。胶原蛋白基因的表达是其本身的顺式作用、反式作用因子以及诸多调控因子相互作用的结果[2]。 到目前为止，已报道的胶原类型大约有19种，对天然胶原的研究有助于进一步理解靶药物和胶原之间结构功能关系。有人用人成纤维II型胶原的三维结构模型来进行合成胶原组织、胶原的结构和功能的研究，利用这一系统进一步研究侧链基团的立体化学和特定分子的相互作用，继而评价胶原相关疾病的临床治疗效应。此外，连接分子末端非螺旋末端肽是胶原分子抗原性的主要来源，而且用胃蛋白酶除去末端肽的缺失胶原是很有应用前景的药物载体，特别是用于基因递送[3，4]。 胶原蛋白是构成动物机体的重要功能物质，它具有其他合成高分子材料无法比拟的生物相容性和生物可降解性。胶原蛋白质结构和功能特点的多样性和复杂性，决定了其在许多领域的重要地位，以及良好的应用前景。目前胶原已广泛地应用于食品、化妆品、营养保健品、生物肥料以及医用材料等领域。 2. 胶原蛋白的概况 胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质，是由动物细胞合成的一种生物性高分子，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中，是结缔组织中极其重要的一种蛋白质，占哺乳动物体内蛋白质总量的25%~30%，相当于体重的6%[5]，是人体重要的细胞外基质成份。胶原还可作为组织的支持物，起着支撑器官、保护机体的功能，对细胞、组织乃至器官行使正常功能并对外伤修复有重大影响。 胶原蛋白的种类很多，一般皮肤和骨骼中的是Ⅰ型胶原蛋白，软骨中的是Ⅱ型胶原蛋白，胚胎皮肤中的是Ⅲ型胶原蛋白，细胞基底膜中的是Ⅳ型胶原蛋白。通常胶原蛋白由三条多肽链构成三股螺旋结构，氨基酸的主要组成为脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）。胶原特有的左旋α链相互缠绕构成胶原的右手复合螺旋结构，这一区段称为螺旋区段，其最
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展教学提纲
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 梁化亮 （生物与食品工程学院，江苏常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体内，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。[关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御
1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主内环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体内的蛋白酶抑制剂在机体内与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体内免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体内的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体内环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体内的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞内蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类
常见蛋白酶抑制剂
当前位置：生物帮 > 实验技巧 > 生物化学技术 > 正文 蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 日期：2012-06-13 来源：互联网 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9;
木瓜蛋白酶应用及研究进展
木瓜蛋白酶应用及研究进展 摘要本文主要介绍了木瓜蛋白酶的作用机理，在医药、食品、化工、科研等方面的应用，以及在木瓜蛋白酶的固定等方 面的最新研究进展。 关键字木瓜蛋白酶应用酶的固定化发展 一、简介 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，主要应用于啤酒及食品工业。 二、作用机理 木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。这种酶属于内肽酶，能切开蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。是一种存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。木瓜蛋白酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。这种酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
胶原蛋白的研究进展
胶原蛋白研究进展 *：通讯作者.23465145378@https://www.docsj.com/doc/b516730910.html, 摘要: 胶原蛋白以其独特的生物特性而具有广阔的应用前景．对近年来国内外学者与生产厂家对胶原蛋白的制备、生物学功能作用及应用方面的研究进展进行了综述，以期充分有效地利用该生物资源． 关键词: 胶原蛋白; 制备; 功能; 应用 引言: 胶原蛋白( collagen) 是细胞外基质的主要成分，约占胶原纤维固体物的85%，占动物体内蛋白质总量的25% ～30%，它广泛存在于动物的结缔组织( 骨、软骨、皮肤、腱、韧等) 中，对机体和脏器起着支持、保护、结合，以及形成界隔等作用［1］．目前，已发现的胶原蛋白有20 多种，它们在动物体内有着不同生理功能，其中，科研人员研究较多较深入的是Ⅰ型胶原蛋白．Ⅰ型胶原蛋白( 以下所述胶原蛋白均指Ⅰ型胶原蛋白) 分子长度约为300 nm，直径约为115nm，呈棒状，由3 条多肽链构成3 股螺旋结构，即: 2条αⅠ链，1条αⅡ链，αⅠ链和αⅡ链只是在氨基酸顺序上有微小差异．胶原蛋白特有的左旋α链相互缠绕构成胶原蛋白的右手复合螺旋结构，在螺旋区段，氨基酸呈现( Gly-X-Y) n 周期性排列．胶原蛋白中，甘氨酸( Gly) 含量较大，约占30%，脯氨酸( Pro)和羟脯氨酸( Hyp) 共占约25%，而一般动物蛋白质中羟脯氨酸含量极微少．可以说，羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸，其含量多少与胶原蛋白的稳定性、变性温度成正性相关［2］．同时，胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和增殖，使动物的骨、腱、软骨和皮肤保持一定的机械强度．此外，胶原蛋白因其弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域用途广泛．目前,国内外关于胶原蛋白的研究极为活跃，本文拟对胶原蛋白的制备、生物学功能及应用进行综述，以期充分有效利用该生物资源． 1.胶原蛋白的制备 目前，对胶原蛋白的提取主要有3 种方法，即酸法、酶法与碱法．因此，根据提取方法的不同，胶原蛋白也可以分为酸溶性胶原蛋白、酶溶性胶原蛋白以及碱溶性胶原蛋白，这3 种胶原蛋白的结构、理化性质与用途都不同．此外，随
蛋白酶抑制剂的研究进展
蛋白酶抑制剂的研究进展 郭川 微生物专业，200326031 摘要：自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，本文就各大类蛋白酶抑制剂的结构特点，活性部位的研究概况及其在各领域应用的原理及进展。 关键词：蛋白酶抑制剂；结构；应用 天然的蛋白酶抑制剂(ＰＩ)是对蛋白水解酶有抑制活性的一种小分子蛋白质,由于其分子量较小,所以在生物中普遍存在。它能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合,抑制酶的催化活性或阻止酶原转化有活性的酶。在一系列重要的生理、病理过程中:如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等，PI发挥着关键性的调控作用,是生物体内免疫系统的重要组成部分。从Ｋｕｎｉｔｚ等最早分离纯化出一种ＰＩ至今,已有多种ＰＩ被发现,根据其作用的蛋白酶主要分以下几类:抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等的巯基蛋白酶抑制剂,抑制胃蛋白酶、组织蛋白酶Ｄ等的羧基蛋白酶抑制剂、抑制胶原酶、氨肽酶等的金属蛋白酶抑制剂等。而根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸序列的同源性,可将自然界发现的PI分为四大类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂[1]。 1 结构与功能 1.1丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine Protease Inhibitor,Serpin） 丝氨酸蛋白酶抑制剂是一族由古代抑制剂趋异进化5亿年演变而来的结构序列同源的蛋白酶抑制剂。Sepin为单一肽链蛋白质。各种serpin大约有30％的同源序列，疏水区同源性高达70％。血浆中的serpin多被糖基化，糖链经天东酰胺的酰胺基与主链相连。位于抑制性serpin表面、距C端30～40个氨基酸处的环状结构区RSL（reactive site loop）中，存在能被靶酶的底物识别位点识别的氨基酸P1[2]；近C端与P1相邻的氨基酸为P1’，依此类推，即肽链结构表示为N端-P15～P9～P1-P1’～P9’～P15’-C端。在对靶酶的抑制中。Serpin 以RSL中的类底物反应活性位点与靶酶形成紧密的不易解离的酶-抑制剂复合物，同时P1-P1’间的反应活性位点断裂。几种perpin氨基酸序列比较发现，serpins各成员的抑制专一性是由P1决定的，且被抑制的酶特异性切点一致。如抗凝血酶，抑制以Arg羧基端为敏感部位的丝氨酸蛋白酶，其中P1为Arg[2]。 1.2巯基蛋白酶抑制剂（Cytsteine Proteinase Inhiitor，CPI） 对于丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)已有大量研究,巯基蛋白酶抑制剂(CPI)的研究则相对要晚一些。而动物和微生物来源的CPI已有一些研究,发现它们在结构上具有同源性,Barrett等将CPI统称为胱蛋白超家族,并按分子内二硫键的有无与数量,分子量大小等将此家族分为3个成员(F1、F2、F3)。在3个家族中,大多数F1和F3的CPI中都有Glu53-Val54-Val55-Ala56-Gly57保守序列,其同源序列在其它CPI中也被发现,如Ｆ2中的Gln-Ｘ-Val-Ｙ-Gly和CHα-ras基因产物中的Gln-Val-Val肽段。人工合成的Glu-Val-Val-Ala-Gly 短肽也显示对木瓜蛋白酶有抑制活性,因此可以认为这一保守区段在抑制活性中起着全部或部分的关键作用[3]。对植物来源的ＣＰＩ研究的不多,已有报道的有水稻、鳄梨和大豆。水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin,OC) 具有102个氨基酸残基,有典型的Glu-Val-Val-Ala-Gly保守序列,应与动物CPI同源进化而来。从OCI没有二硫键来看,它应归为F1成员,但从序列比较看,则更接近F3。对OCIGlu---Gly保守序列进行点突变试验表明,突变使其抑制活性大幅度下降,其中当Glu被Pro替代时则活性全无,由此说明,这一段保守序列在OCI的抑制活性中,同动物CPI一样必不可少。除Glu---Gly保守区域外,OCI序列中其
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展 赵电波，陈茜，张丽尧 (郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002) 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶的组成，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Progress of Extraction and Application of Technology of PapainZHAO Dianbo, CHEN Xi, ZHANG Liyao（College of Food and Biotechnology Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, HenanZhengzhou 450002, P. R. China）Abstract: The composition of papain was described, and its extraction methods, research of extractiontechnology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing itwas further described, and its applicationsinpharmaceutical, chemical industry and the future prospects offood processing have been prospected in this article.Key words: papain;extractiontechnology; food processing; application 中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：1001-8123(2010)11-0019-05 木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M）[1]，其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。1木瓜蛋白酶的提取工艺 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等[2]用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，且产品的纯度较低。木瓜蛋白酶的提取也曾广泛采用单宁沉淀法，乙引等[2] 用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀 单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。1.2目前较为常见的提取方法 目前生产中多采用超滤、絮凝、盐析等方法提取木瓜蛋白酶。 1.2.1超滤法提取木瓜蛋白酶
胶原蛋白的研究进展
https://www.docsj.com/doc/b516730910.html, 肉类研究 MEAT RESEARCH 2010.1 收稿日期：2009-11-04 作者简介:王丽娜,1986-,女，硕士研究生，研究方向：兽医公共卫生学.Email：wannnglina@https://www.docsj.com/doc/b516730910.html, 通讯作者：黄素珍 山西农业大学动物科技学院 邮政编码：030801 胶原蛋白的研究进展 王丽娜，黄素珍 （山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801） 摘 要：本文对胶原蛋白的性质、提取方法以及它的功能和发展前景等研究进行了简单的综述。主要对胶原蛋白的来源做了详细的介绍。关键词：胶原蛋白；来源；功能；研究进展 Research Progress About Collagen WANG Lina ，HUANG Suzhen (Veterinary Medicine and Animal Science, Shanxi Agriculture University, Taigu Shanxi 030801)Abstract: This paper is mainly introduce the development ,the characterize and the distill method of collagen. We make a detail introduction to the source of collagen.Key words: collagen; source; founction; research process 中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1001-8123(2010)01-0016-07 0 前言 胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质，占人体内蛋白质总25％，相当于体重的6％。它存在于动物皮肤与骨胳中，如猪皮、牛筋、禽的皮肤及骨骼中含有大量的胶原蛋白。 胶原蛋白的营养十分丰富。胶原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18种氨基酸，其中维持人体生长所必需的氨基酸有7种，胶原蛋白中的甘氨酸占30％，脯氨酸和羟脯氨酸共占25％，是各种蛋白质中含量最高的，丙氨酸、谷氨酸的含量也比较高，同时还含有在一般蛋白中少见的羟脯氨酸和焦谷氨酸。 胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，分子量为300kD，其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，它们交叉相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构，胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并 且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。结构决定性质，性质决定用途，胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位。胶原蛋白产品具有良好的应用前景。 1 胶原蛋白的特性 1.1 低免疫原性 林炜[1]等认为胶原具有三种类型的抗原因子：第一类是由胶原肽链非螺旋的端肽引起的；第二类是由胶原三螺旋的构象引起的；第三类是由α链螺旋区的氨基酸顺序引起的。第二类抗原因子仅存在于天然胶原分子中，第三类只出现在变性胶原中，而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在。 1.2 生物相容性 胶原的生物相容性是指胶原蛋白与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。胶原本身是构成细胞外基质的骨架，其三股螺旋结构及交联所形成的纤维或网络构成了细胞重要组成成分，对细胞起到锚定和支持作
常见蛋白酶抑制剂
蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全 标签： 相关专题：解析蛋白酶活性测定聚焦蛋白酶研究新进展 摘要: 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 PMSF 1)抑制丝氨酸蛋白酶(如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶); 2)10mg/ml溶于异丙醇中; 3)在室温下可保存一年; 4)工作浓度:17~174ug/ml(0.1~1.0mmol/L); 5)在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。 EDTA 1)抑制金属蛋白水解酶; 2)0.5mol/L水溶液，pH8~9; 3)溶液在4℃稳定六个月以上;
4)工作浓度:0.5~1.5mmol/L. (0.2~0.5mg/ml); 5)加入NaOH调节溶液的pH值，否则EDTA不溶解。 胃蛋白酶抑制剂(pepst anti n) l)抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶D和凝乳酶; 2)1mg/ml溶于甲醇中; 3}储存液在4℃一周内稳定，-20℃稳定6个月; 4)1作浓度:0.7ug/ml(1umol/L) 5)在水中不溶解。 亮抑蛋白酶肽(leupeptin) 1)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶B; 2)lOmg/ml溶于水; 3)储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度0.5mg/ml。 胰蛋白酶抑制剂(aprotinin) 1)抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶; 2)lOmg/ml溶于水，pH7~8 3}储存液4℃稳定一周，-20℃稳定6个月; 4)工作浓度:0.06~2.0ug/ml(0.01~0.3umol/L); 5)避免反复冻融: 6)在pH>12.8时失活。 蛋白酶抑制剂混合使用 35ug/ml PMSF…………………………………丝氨酸蛋白酶抑制剂 0.3mg/ml EDTA…………………………………金属蛋白酶抑制剂 0.7ug/ml胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)…………酸性蛋白酶抑制剂 0.5ug/ml亮抑蛋白肽酶(Leupeptin)……………广谱蛋白酶抑制剂
木瓜蛋白酶在食品工业中应用的研究进展
木瓜蛋白酶在食品工业中应用的研究进展 江甜 （武汉轻工大学，湖北武汉430023） 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Applications of papain in the food industry JIANG Tian （Wuhan Polytechnic University，Wuhan, 430023） Abstract: The papain was described, and its extraction methods, research of extraction technology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing it was further described, and its applications in pharmaceutical, chemical industry and the future prospects of food processing have been prospected in this article. Key words: papain; extraction technology; food processing; application 木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内，未成熟果实的乳汁中含量最丰富[1]。木瓜蛋白酶的作用范围很广，水解温度为10℃～80℃，在pH值3～9的范围内对底物均有作用，且稳定性好。在密封容器内，4℃的条件下或阴凉干燥处保存6个月酶活力仅下降0～10 或10 ～20 [2]。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白酶水解和合成能力，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，利用木瓜蛋白酶的酶促反应，可把大分子的蛋白质水解成容易消化吸收的小分子多肽或氨基酸[3-4]，不仅可以用来改善植物蛋白的营养价值或功能性质，而且也广泛应用于食品行业，如啤酒的澄清、肉的嫩化以及制革、纺织和日化用品等行业中，同时也受了医学界的极力关注和重视[5-6]。 1木瓜蛋白酶的制备 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，
丝氨酸蛋白酶 (2)
丝氨酸蛋白酶 摘要：丝氨酸蛋白酶是一种种类丰富的酶类【1】，之所以以此命名是因为在酶的催化活性位点上包含丝氨酸在内的丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸组成的催化三联体。有些丝氨酸蛋白酶类如凝血酶类蛋白酶，其中包括凝血酶，组织纤维蛋白溶酶原激活剂、血纤维蛋白溶酶，它们参与凝血的发生以及炎症应答反应；也有些如胰蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶类的参与消化的酶类，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶；还有一些表达在神经系统中的丝氨酸蛋白酶类，这些酶类与神经系统正常的维持或是介导病理情况的发生。其实丝氨酸蛋白酶类在执行功能的时候也受到许多因素的限制，如受一些抑制剂的影响等，这些物质对蛋白酶功能的执行起到重要的作用。 关键词：丝氨酸蛋白酶催化机制功能调节 酶的功能 已知所有的蛋白分解酶类丝氨酸蛋白酶占到了其中的三分之一，这些酶又可以细分成很多种类有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂、神经源类的丝氨酸蛋白酶等。这些酶类具有消化凝血、纤溶、消化、受精、生长发育、凋亡、免疫等方面都有重要的作用。 酶的催化位点 由于丝氨酸蛋白酶的种类很多根据其催化的特点以及种树亲疏性可以分成不同的类别，不同的组织器官，不同的生物种系中酶的分布与种类是不同的(见表格)。但是其催化特点通常都是其反应的催化三联体，丝氨酸的亲核攻击，即丝氨酸的羟基攻击酰胺键的羰基碳，但是在生物进化的长时间了这种催化活性结构也发生了改变。如在有些酶中其催化三联体不在是固定的丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸，而是只有丝氨酸与天冬氨酸或是组氨酸的一种组成催化活性位点，也有的如组氨酸成对出现于丝氨酸组合形成新的催化结构，但是无论怎样其上的丝氨酸残基是固定保守的。 酶的活化 对于丝氨酸蛋白酶类的活化，一般来说是通过对酶前体【2】的加工使其形成具有催化活性的酶，或者是通过一些辅助因子的协同作用使其由闭合的非活化状态转成活性状态，也有通过信号的捕获诱发一系列的级联反应从而活化蛋白，或是通过一些关键因子的作用使得构想发生改变来实现活化等等。通常来说酶的状态一种是抑制非活化状态，另一种是活化的活性状态，但是在一些研究中酶具有新的状态，而这种状态与酶原或是缺少辅因子而显示无活性的酶的状态是不同的，虽然这种状态下的酶也没有活性，但是其结构上出现一些特有的变化，在对凝血酶的研究中发现，这种状态称为E*【3】，其伴有一些氨基酸链陷入酶的催化活性部位从而破坏其中的氧离子空穴，致使没得活性受阻，因此对于这种酶的活化一定有其他的方式，研究发现当E*状态下在远离活性部位连接一种配体时会将这种氨基酸陷入活性位点的状况扭转过来，从而恢复酶的活性位点，并在其他因子的作用下得到活化。 酶的催化机制 对于丝氨酸蛋白酶类的催化活性，有的是通过前体酶原的活化，比如胰蛋白酶类