黄瓜绿斑驳花叶病毒分子检测方法的建立与评价
细胞毒性检测方法总结!
细胞毒性检测方法总结！ 细胞毒性(cytotoxic)是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。 细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测，常用以下几种方法： MTT、XTT法：利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测 一.LDH的方法：通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性 其它酶方法：如检测上清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶的活性等 细胞增殖能力分析试剂 原理：正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质（如MTT、XTT、WST-1等）还原为紫色的结晶状的物质，沉积在细胞周围，然后通过酶标仪读取OD值，从而检测到细胞增值状态 优点：1）快速：96孔培养板形式，可进行高通量检测。2）灵活：可直接通过显微镜观察，也可通过酶标仪进行定量检测。 二.荧光素发光法细胞生存能力检测 原理：腺苷酸激酶（AK）存在于所有真核和原核细胞的胞浆中，AK具有激活ADP 生成ATP。当细胞受损后，细胞膜发生破损，AK会释放到培养上清中。该试剂盒利用荧光素酶和荧光素在ATP作用下可以发光，通过化学发光仪可以定量进行检测。 特点： 1）简单、快速。2）板式检测，可进行高通量 。 三.LDH法细胞毒性检测 原理：LDH（乳酸脱氢酶）是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应形成紫色的结晶物质，可通过500nm酶标仪进行检测。通过检测细胞培养上清中LDH的活性，可判断细胞受损的程度 特点：1）方法简单，安全，不使用放射性物质2）可进行高通量检测
细胞毒性实验方案
细胞毒性实验设计方案 1.准备材料：DMEM(高糖) 胰酶双抗(青霉素/链霉素）DAPI MTT(5mg/mL) DMSO PBS 4%多聚甲醛指甲油 6孔培养板 96孔培养板超薄载玻片培养瓶(25mL) 一包0.45μm滤膜 灭菌： 50mL，10mL，5mL离心管两种枪头 2.实验方案 本实验所用的材料为载药的通过二硫键桥连透明质酸的夹心二氧化硅 （SiO 2 -SS-HA/DOX），在高谷胱甘肽条件下，二硫键断裂，透明质酸脱离，同时 夹心二氧化硅中药物得以释放。本实验的目的为测定透明质酸修饰的夹心二氧化 硅（SiO 2-SS-HA/DOX）的细胞毒性。实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、SiO 2 -SS-HA、DOX， 空白对照组为纯细胞,分别采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型和L929成纤维 细胞为正常细胞模型。 采用HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型，实验组为SiO 2 -SS-HA/DOX、 SiO 2 -SS-HA、DOX，空白对照组为纯细胞。培养基中含有10% (v/v) FBS和1% (w/v) 双抗(青霉素/链霉素)。配制不同浓度的SiO 2-SS-HA/DOX、SiO 2 、HA、DOX药物载 体培养基溶液。 (1).以HepG2人肝癌细胞为肿瘤细胞模型: 培养基的配置：双抗 1% 血清12% DMEM 87% 具体操作步骤： 细胞的复活： ①将冻存于液氮中的细胞取出，迅速放入37℃温水中，使细胞快速溶解。 ②将悬浮的细胞移至离心管中，加5mL无血清培养基，1000rmp,5min离心去上清，再加5mL有血清培养基，转移至培养瓶中。（每次转移时，将之前的离心管洗涤，并用移液枪来回吸，使液体混合均匀。） ③将培养瓶放入培养箱中培养。 细胞的传代： 将0.25%的胰酶分装至小离心管中，每个管中2mL，冻存于-20℃，每次使用一管，避免反复冻融。 ①将培养瓶从培养箱中取出，盖子旋紧，喷75%的酒精放入超净台。 ②将培养液倒入废液缸，残留培养基用吸管吸干净，操作完成后，培养瓶口
黄瓜绿斑驳花叶病毒发生概况、检测鉴定及防治
黄瓜绿斑驳花叶病毒发生概况、检测鉴定及防治纽内姆（北京）种子有限公司齐中举（病理助理） 1.黄瓜绿斑驳花叶病毒病概况 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)，为烟草花叶病毒属，是西瓜、黄瓜、南瓜等葫芦科作物上的一种毁灭性病害，具有危害严重，致病性强，防止难度大等特点。 1.1危害症状：CGMMV 侵染许多葫芦科作物，引起植物叶片斑驳、系统性花叶及果肉恶化等症状。在黄瓜上, 最初新叶上出现黄色小斑点, 随后逐渐发展为花叶、斑驳和浓绿泡状突起等症状, 叶脉间褪色呈绿带状。在西瓜上，初期茎端幼叶呈现淡黄色花叶，随后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻；果实表现有浓绿圆斑，中央有坏死点，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色且出现空洞。在甜瓜上，受害的新叶上出现黄斑，随叶片老化症状减轻；成株侧枝的叶片呈现不定形或星状黄化叶，生长后期顶部叶片有时产生大型黄色轮斑；幼果受害后有绿色花纹，后期为绿色斑，或在绿色斑中央出现灰白色斑。在黄瓜叶片上引起色斑、水泡及变形，使植株矮化、结果延时，果实大部分黄化或变白并产生黑绿色水疱状的坏死斑，产量损失达15%；可延缓黄瓜植株的生长发育，甚至导致不孕。 1.2发生分布：黄瓜绿斑驳花叶病毒病20世纪30年代在欧洲国家发生，60年代因黄、西瓜和瓠瓜而传入印度和日本，80年代传入台湾。2002年中国从日本引进种苗中截获，2004年厦门从日本进口的南瓜种子上检测到CGMMV，2005年中国辽宁省盖州市感染CGMMV 在我国辽宁盖州地区造成西瓜大面积毁灭,受害面积达333 hm2，约13hm2绝收，CGMMV 现在中国部分地区已造成西瓜毁灭性的损失。农业部发布的第788 号公告，郑重宣布将CGMMV 确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害。 目前，CGMMV 在中国主要分布于辽宁、河北、湖北、广东和山东，发生率达80%，河南、四川、江西、上海、新疆、陕西及宁夏等省份还未发现。 1.3传播方式：该病毒主要侵染甜瓜、西瓜、黄瓜及瓠瓜等多种葫芦科作物，主要通过种子、土壤、机械摩擦、田间农事操作、植物间接触、叶片接触、啮齿动物( 如兔子、小白鼠等) 的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的
药典三部(2015版)-通则-1141异常毒性检查法
1141 异常毒性检查法 异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他原因所致的毒性。 本法系给予动物一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察动物出现的异常反应或死亡情况，检查供试品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。 供试品溶液的制备按品种项下规定的浓度制成供试品溶液。临用前，供试品溶液应平衡至室温。 试验用动物应健康合格，在试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养。做过本实验的动物不得重复使用。 非生物制品试验 除另有规定外，取小鼠5只，体重18～22g，每只小鼠分别静脉给予供试品溶液0.5ml。应在4～5秒内匀速注射完毕。规定缓慢注射的品种可延长至30秒。除另有规定外，全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重19～21g的小鼠10只复试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。 生物制品试验 除另有规定外，异常毒性试验应包括小鼠试验和豚鼠试验，试验中应设同批动物空白对照，观察期内，动物全部健存，且无异常反应，到期时每只动物体重应增加，则判定试验成立。按照规定的给药途径缓慢注入动物体内。 ⑴小鼠试验法除另有规定外，取小鼠5只，注射前每只小鼠称体重，应为18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品溶液0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，应另取体重19～21g的小鼠10只复试1次，判定标准同前。 ⑵豚鼠试验法除另有规定外，取豚鼠2只，注射前每只小鼠称体重，应为250～350g。每只豚鼠腹腔注射供试品溶液5.0ml，观察7天。观察期内，豚鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，可用4只豚鼠复试1次，判定标准同前。
CMV-黄瓜花叶病毒
黄瓜花叶病毒—CMV 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus ，简称CMV)是一 种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的 任何部位。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、 最具经济重要性的植物病毒之一。全世界所有烟草种植 区均有该病毒的分布和危害。世界上分布在英国、德国、 丹麦、俄罗斯、印度、日本、韩国、希腊、罗马尼亚、 匈牙利、捷克、保加利亚、巴西、爱尔兰、摩尔多厄、 瑞典、芬兰、波兰等地区以及中国台湾。 黄瓜花叶病毒-病理概述 苗期染病子叶变黄枯萎，幼叶呈深绿与淡绿相间的花叶状， 同时发病叶片出现不同程度的皱缩、畸形。成株染病新叶呈黄 绿相间的花叶状，病叶小且皱缩，叶片变厚，严重时叶片反卷； 茎部节间缩短，茎畸形，严重时病株叶片枯萎；瓜条呈现深绿 及浅绿相间的花色，表面凹凸不平，瓜条畸形。 重病株簇生小叶，不结瓜，致萎缩枯死。该病从苗期到大田期 均可发生，发病初期叶脉呈半透明状，几天后就出现浓淡不均 的典型花叶。病叶形成黄绿或深绿的泡斑，叶片扭曲畸形，叶 尖细长呈鼠尾状，叶基伸长，侧翼变窄变薄甚至完全消失，发 病早的植株明显矮缩。病株根系发育不良。在田间普通花叶病 与黄瓜花叶病很相似，难以区别，需要作血清学及电镜鉴定。 黄瓜花叶病毒-病态症状 多全株发病，苗期发病子叶变黄枯萎，幼叶呈现浓绿与淡绿相间花 叶状，成株发病新叶呈黄绿相嵌状花叶，病叶小，略皱缩，严重的叶反 卷，病株下部叶片逐渐黄枯。瓜条发病表现深绿与浅绿相间疣状斑块， 果面凹凸不平或畸形，发病重的节间短缩，簇生小叶，不结瓜，以致萎 缩枯死。发病初期表现“明脉”症状，逐渐在新叶上表现花叶，病叶变窄，
医用无菌敷料细胞毒性的检验方法
０引言 细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。细胞毒性检测主要是根据细胞膜通透性发生改变来进行的检测。四唑盐（MTT）比色法是细胞毒性检测常用方法之一，利用线粒体内部酶的活性，可以将特定的四唑盐类进行转化，然后通过酶标仪进行检测。体外细胞毒性试验方法经常用于对医疗器械进行生物学评价，其结果常常用于判断该器械产品的基本生物安全性。 医用敷料，是包伤的基本常用器械产品，是用以覆盖疮、伤口或其他损害的医用材料。随着对创面愈合过程的病理生理的深入研究，人们对创面愈合过程的理解也越来越深刻，从而导致了医用创面敷料 的不断改进与发展。现在人们对医用敷料的需求也在不断增加，所以相对对各种医用敷料的生物学安全要求也在不断提高。随着产品种类的增多，各种功能的增加，通过适当的体外试验方法来加强其生物安全性的控制与保障显得格外重要。 １材料与方法 1.1材料 （1）仪器设备 311CO2恒温培养箱，Thermo公司；XDS-1B倒置显微镜，COIC公司；BS2000S电子天平，Sartorins （北京）有限公司；MULTISKAN GO酶标仪，Thermo 公司；全自动立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司。 （2）试剂试药 医用无菌敷料细胞毒性的检验方法 ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＭｅｄｉｃａｌＳｔｅｒｉｌｅＤｒｅｓｓｉｎｇＣｅｌｌＴｏｘｉｃｉｔｙＴｅｓｔＭｅｔｈｏｄｓ 罗丹洪燕 Luo Dan Hong Yan （江西省食品药品检验所，江西南昌330029） （Jiangxi Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang330029） 摘要：目的：比较医用无菌敷料不同浸提方法所获得的供试液对其细胞毒性的影响。方法：采用四唑盐（MTT）比色法进行细胞毒性试验。结果：面积浸提法得供试液细胞毒性为3级，质量浸提法得供试液细胞毒性为2级。结论：采用质量浸提法得供试液比面积浸提法得供试液的细胞毒性小。 关键词：医用无菌敷料；四唑盐（MTT）比色法；细胞毒性 中图分类号：R-331文献标识码：A文章编号：1671-4792（2012）12-0241-03 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Objective：Compared medical sterile dressing different leaching method was obtained by liquid on the cell toxicity effect.Method：Using tetrazolium salt(MTT)colorimetric method in cell toxicity test.Result：Area extraction to the liquid cell toxicity for level3,quality extraction to the liquid cell toxicity to level2.Conclu-sion：Using the mass extraction to the liquid ratio area extraction to the liquid cell toxicity small. Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Medical Sterile Dressing；Tetrazolium Salt(MTT)Colorimetric Method；Cytotoxicity 医用无菌敷料细胞毒性的检验方法 ２４１
药典三部(2015版)-通则-异常毒性检查法
精品文档 . 1141 异常毒性检查法 异常毒性有别于药物本身所具有的毒性特征，是指由生产过程中引入或其他 原因所致的毒性。 本法系给予动物一定剂量的供试品溶液，在规定时间内观察动物出现的异常反应或死亡情况，检查供试品中是否污染外源性毒性物质以及是否存在意外的不安全因素。 供试品溶液的制备按品种项下规定的浓度制成供试品溶液。临用前，供试品溶液应平衡至室温。 试验用动物应健康合格，在试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养。做过本实验的动物不得重复使用。 非生物制品试验 除另有规定外，取小鼠5只，体重18～22g，每只小鼠分别静脉给予供试品溶液0.5ml。应在4～5秒内匀速注射完毕。规定缓慢注射的品种可延长至30秒。除另有规定外，全部小鼠在给药后48小时内不得有死亡；如有死亡时，应另取体重19～21g的小鼠10只复试，全部小鼠在48小时内不得有死亡。 生物制品试验 除另有规定外，异常毒性试验应包括小鼠试验和豚鼠试验，试验中应设同批动物空白对照，观察期内，动物全部健存，且无异常反应，到期时每只动物体重应增加，则判定试验成立。按照规定的给药途径缓慢注入动物体内。 ⑴小鼠试验法除另有规定外，取小鼠5只，注射前每只小鼠称体重，应为18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品溶液0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，应另取体重19～21g的小鼠10只复试1次，判定标准同前。 ⑵豚鼠试验法除另有规定外，取豚鼠2只，注射前每只小鼠称体重，应为250～350g。每只豚鼠腹腔注射供试品溶液5.0ml，观察7天。观察期内，豚鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，判定供试品符合规定。如不符合上述要求，可用4只豚鼠复试1次，判定标准同前。
黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生症状及防控措施
龙源期刊网 https://www.docsj.com/doc/bf11687125.html, 黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生症状及防控措施 作者：周红珍张志勇彭辉 来源：《现代农业科技》2013年第18期 摘要介绍黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生症状，并据此提出相应的防控措施，以为黄瓜绿 斑驳花叶病毒病的防治提供参考。 关键词黄瓜绿斑驳花叶病毒病；发生症状；防控措施 中图分类号 S436.421 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2013）18-0138-01 近年来，随着国家和省市对高效农业发展的高度重视和政府投入的增加，睢宁县设施规模农业迅猛发展，尤其是设施蔬菜发展最快。截至目前，睢宁县设施蔬菜面积已发展逾1.33万hm2，其中黄瓜种植面积占设施蔬菜面积30%以上，西瓜约占10%。但有多种病害影响黄瓜、西瓜产量和品质，其中黄瓜绿斑驳花叶病毒病是危害黄瓜的重要病害之一。 黄瓜绿斑驳花叶病毒病是一种危害葫芦科植物（黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦、笋瓜、西葫芦、棱角丝瓜、无花果、叶瓜）的重要植物检疫性病毒病[1-2]。2012年6月，该病首次在江 苏省发现，在睢宁县部分黄瓜田上有发生，导致部分瓜农种植效益受损。做好黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防治，对提高其产量与质量都有重要意义。 1 发生症状 黄瓜绿斑驳花叶病毒病主要通过带毒种子远距离传播或通过接触性传染，在田间主要通过病株汁液、嫁接、土壤中的病残体等方式进行传播，病毒在种子或土壤中可存活1年以上。植株受害后，叶片出现黄斑、花叶或产生绿色突起或凹凸，植株生长缓慢或矮化，严重的可导致不孕；果实外部症状不明显，内部果肉常出现油渍状深色病变，中心纤维质呈深色，向果肉内部条状聚集；种子周围形成暗紫红色油泽状空洞。在不同作物上有以下具体体现。 1.1 黄瓜 黄瓜受害后，有黄色小斑点着生于新叶上，后逐渐变成花叶并带有浓绿色突起，有色斑、水泡及变形情况发生，叶脉间褪色呈绿带状。大部分果实黄化或变白并产生墨绿色水疱状的坏死斑。植株矮化，结果延时，导致产量受损，甚至因不孕而绝产。 1.2 西瓜
侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒的初步鉴定_秦碧霞
侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑驳花叶 病毒的初步鉴定 秦碧霞 蔡健和 刘志明 陈永惠 朱桂宁 黄福新 (广西农科院植保所 南宁 530007) Preliminary identification of a Cucumber green mottle mosaic virus infecting pumpkin .Qin B ixia ,Cai Jianhe ,Liu Zhiming ,Chen Yonghui ,Zhu Guining ,Huang Fuxin (Institute of Plant Protection , Guangxi Academ y of Agricultural Sciences ,Nanning ,530007,China ) A bstact A virus isolate ,P -3(NN )was obtained from pumpkin planted in a agricultural demonstration zone in Guangxi .P -3(NN )was found to cause systemic mosaic ,vein clearing or systemic chlorotic spot in all the Cucuribitaceae plants tested ,cause local c hlor otic spot in Datura stramonium and on infection in other Solanaceae ,Leguminosae or Chenopodiaceae plants tested .The lethal temperature of the virus was 95℃to 100℃.Straight tubular particles were observed under electron microscope .The length of most virus particles was close to 300nm .ELI SA test indicated that P -3(NN )showed a close relationship with Cucumbe r green mottle mosaic virus (C GMMV ).All the results suggest that P -3(NN )is an isolate of CGMMV . Key words pumpkin ,Cucumber gre en m ottle mosaic virus ,virus identification 摘要 从广西某农业展示中心观赏南瓜上分离到一种直杆状病毒,长约300nm ,该病毒分离物P -3(NN )在测试的葫芦科作物上表现为系统花叶、褪绿斑及明脉症状,在曼陀罗上为局部褪绿斑,在测试的其它茄科作物及豆科和藜科作物上无任何症状反应。其致死温度为95～100℃。经DAC -ELISA 测定,P -3(NN )与黄瓜绿斑驳花叶病毒有密切的血清学关系。根据以上结果,初步鉴定P -3(NN )为黄瓜绿斑驳花叶病毒(C GMMV )的一个分离物。 关键词 观赏南瓜 黄瓜绿斑驳花叶病毒 病毒鉴定 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbe r green mottle mosaic virus ,CGMMV )是烟草花叶病毒 属(Tobamovirus )的成员,最早由Ainsworth (1935)记述,主要分布在欧洲、印度和日本等国葫芦科植物上 [1] 。该病毒极易通过汁液传 播,种子带毒是主要的远距离传毒方式,是一种对葫芦科植物具有潜在威胁的病毒之一, 属潜在危险性有害生物。Hseu SH .等[2] 曾在我国台湾的葫芦科作物上分离鉴定出该病毒,但我国大陆目前尚未见该病毒发生的报 — 198— 基金项目:广西青年科学基金项目(桂科青0135006),广西新世纪十百千人才工程项目(2001215),广西农科院科技发 展基金项目(2002025)收稿日期:2004-12-20
细胞膜毒性检测方法概括
首先，可进行细胞的毒性检测，通过台盼蓝拒染法检测细胞存活率变化，MTT或WST法检测细胞的活力。 其次，细胞功能的正常有赖于膜结构的完整及膜特性的保持，所以通过以下方法检测某种物质对细胞膜的毒性 1.细胞膜通透性的变化： 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）广泛存在于生物细胞内，是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可泄漏至细胞外介质中。泄漏出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I 变成还原型辅酶I，通过测定NADH在340 nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力，从而得到细胞膜是否损伤的结果。国外有通过试剂盒检测腺苷酸激酶的释放以及通过共聚焦激光扫描显微镜检测碘化丙啶的吸收量。 检测膜胆固醇采用邻苯二甲醛比色法。测定波长为510 nm，按照试剂盒说明检测。 2.可通过透射电镜观察细胞膜结构及以PI为荧光染料检测核膜完整性，现在更有利用原子力学显微镜（AFM）观察细胞的形态结构及比较细胞表面粘弹力的变化，比较药物对细胞膜作用前后的膜表面结构变化。利用AFM的力曲线得到能表明机械性能参数的粘弹力来分析比较未作用药和作用药后的细胞，一般，作用药组细胞其弹性小于未作用药细胞。 3.细胞膜表面整合素的变化：
整合素是一类广泛存在于细胞表面的糖蛋白，由α和β两个亚基以非共价键连接的异二聚体，目前发现由19种α亚基和8种β亚基以不同方式组合形成24种整合素亚型。用流式细胞仪检测细胞表面整合素(integrinpl)的表达(平均荧光强度） 4.Western blot检测细胞骨架蛋白F-actin和Tubulin-β 细胞骨架是由蛋白质纤维构成的胞内网络，相当于细胞的骨骼，支持着整个细胞，它紧贴在细胞膜下，赋予细胞一定的形状,对细胞及细胞器的运动也起着至关重要的作用。应用流式细胞仪检测细胞内F-actin和tubulin-β蛋白表达的情况（通过平均荧光强度来体现）。一般，药物作用后，使细胞内的钙离子浓度升高，引起一定的信号转导，破坏actin网络，使F-actin解聚，影响到细胞骨架结构对细胞形态的支持作用，造成细胞收缩，形态异常，细胞连接松散，易脱落，细胞生长稀疏，故在倒置荧光下观察药物作用后，细胞数目明显减少。 5.细胞膜Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP酶活性的测定 按照试剂盒的方法进行，测定Na+—K+—ATP酶及Ca2+—Mg2+—ATP 酶活性。 6.细胞膜膜电位的变化：DIBAC4(3)为膜电位敏感的亲脂性阴离子荧光染料,利用它可以快速检测膜电位的动态变化，且不损伤细胞。当DIBAC4(3)进入细胞内增多，荧光增强，表明细胞膜电位负值减小，出现去极化变化；反之，荧光减弱，表明细胞膜电位负值增大，出现超级化变化细胞的去极化与细胞损伤密切相关，造成大量Na+内流,K+外流，细胞内呈高钠低钾状态，细胞膜皱缩。
医疗器械生物学评价 第五部分 体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验 1 范围 GB/T 16886 的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。 这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育； a）用器械的浸提液，和／或 b）与器械接触。 这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T 16886 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T 16886.1-2001,idt ISO 10993- 1:1997）CB/ T 16886. 12-2000 医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idt ISO 10993- 12 :1996） 3 术语与定义 GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。 3.1 阴性对照材料negative control material 按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。 注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。 3.2 阳性对照材料 pos itive control material 按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。 注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。 _____________________________________ 1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie, Maryland, USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。 2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMS Portex Ltd,Hythe, Kent,CT21 6JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC 聚氨甲酸乙酯可从Hatano 研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 , Hanagawa257-Japan) 获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO 对使用该产品不提供担保。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项 一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理 Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖 和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 CCK8的优点： ?使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； ?CCK-8法能快速检测； ?CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； ?CCK-8法的重复性优于MTT 法； ?CCK-8法对细胞毒性小； ?CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。 CCK8的缺点： ?与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。 ?CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。 与以往的增殖/毒性测定试剂相比较： 检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水差（需加有机好好好
溶性溶剂溶解） 产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液 使用方法配成溶液后 使用 现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高 检测时间较长较短较短最短 检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm 细胞毒性高，细胞形态 完全消失很低，细胞形 态不变 很低，细胞形 态不变 很低，细胞形 态不变 试剂稳定性一般较差一般很好 批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷 二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法 实验一：细胞增殖分析 1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。 3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。 4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或 者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。 5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如 果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形 成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。 6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。 实验二：细胞毒性分析 1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。 3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。
详细分析大棚蔬菜病毒病的来源传播途径及防控措施
详细分析大棚蔬菜病毒病的来源传播途径及防控措施 病毒来源 1、种子 种子带毒容易被忽视，虽然通过种子直接传播的病毒不多，但种子表面携带的病毒往往成为设施内蔬菜病毒病发生的重要源头。这类病毒在种子萌发过程中侵入幼苗，造成苗子发病，且这类病毒通常通过接触传播，一棵发病的幼苗成为全田病毒病发生的源头，经过打杈等农事操作逐渐传播到全田。 常见的辣椒花叶病毒病、番茄花叶病毒病、黄瓜绿斑驳病毒病、番茄黄化曲叶病毒病能够由种子传带病毒引起。 带毒种子的源头是制种田发生的病毒病，制种公司往往不重视繁种过程中发生的病毒病。 对种子进行清洗、热处理可以去除种子表面和钝化种子内存在的病毒。
简单清洗方法：盆中加入热水，用凉水和温度计调温度到55℃，加入种子，维持水温在55℃，浸泡15分钟，用于降低和钝化种子表面携带的病毒和其他病原菌。如果病毒病严重或怀疑有病毒，则用10%磷酸三钠溶液浸泡20分钟，捞出用清水洗净。包衣的种子无需用此方法处理。 ? 2、带毒苗子 购买苗子和从外地调运苗子已成为常态，育苗过程中发生的病毒病症状不明显，不容易被发现。番茄黄化曲叶病毒病经番茄苗子调运扩散到我国多个省份，教训深刻。 对于一些无性繁殖材料，特别是根茎、块茎、枝条等，如果最初的材料携带病毒，会导致病毒病在快繁过程中普遍发生，如紫背天葵等叶菜。 ? 3、设施、棚室内外杂草、花卉、绿植等，特别是多年生的杂草，是病毒保存库，使得病毒能够长期存活，通过蚜虫、粉虱等小型害虫传播到设施内的蔬菜上。病毒在杂草上通常不显症，但对茄科等种类蔬菜危害大。 ? 4、小型害虫，如蚜虫、粉虱、蓟马、叶蝉等，群体大，繁殖快，寄主范围广，其传播病毒造成的危害更大。例如蚜虫能传播的黄瓜花叶病毒、瓜类蚜传黄化病毒，粉虱能传播番茄黄化曲叶病毒、番茄褪绿病毒，蓟马能传播番茄斑萎病毒……这些在我国多地都有发生，严重影响番茄、辣椒等蔬菜的品质和产量。 ? 还有两个方面能造成病毒病严重发生，但是在实际生产种却容易被忽视。? 1、土壤 一些种类的病毒在土壤中能存活几年到十几年，如引起茄科、葫芦科蔬菜花叶病毒病的烟草花叶病毒、辣椒轻绿斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒等。目前常用的土壤消毒不能杀死病毒。 2、吸烟 烟叶中大多含有烟草花叶病毒、马铃薯Y病毒等对番茄、辣椒造成严重危害的病毒，这些病毒经烤制后仍具有侵染力，工人吸烟时手会沾染到烟丝
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测 LDH释放检测 方法： a. 根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。 b. 吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理(如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续按常规培养。到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。 c. 到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。 准备工作： a. INT溶液(1X)的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀释液，混匀后即配置为200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜现配现用，配置后4℃保存可于当天使用，不宜配置后冻存。 b. LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。 样品测定: a. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液。 b. 混匀，室温(约25℃) 避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。 c. 计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度) 细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100 d. 可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。
异常毒性检查
关于注射剂安全性检查法应用指导原则（修订稿）的讨论（续）(2007-11-18 13:59:42)标签：知识/探索分类：药品安全性检查 检查限值的设定 一、异常毒性检查： 本法系将一定量的供试品溶液注入小鼠体内，规定时间内观察小鼠出现的死亡情况，以判定供试品是否符合规定。供试品的不合格表明药品中污染了超过正常产品毒性的剧毒杂质，临床用药将可能增加急性不良反应。 （一）、方法：参照中国药典2005年版（二部）附录异常毒性检查法。 （二）、设定限值前研究：参考文献资料数据并经单次静脉注射给药毒性试验确定该注射剂的小鼠急性毒性数据（LD50和LD1及其可信限）。有条件时，有不同实验室用不同供试品和动物来源进行试验求得的LD50和LD1数据。静脉注射速度0.1mL/秒，观察时间为72小时。 （三）、设定限值：异常毒性检查的限值应低于该注射剂的正常产品的毒性最小致死剂量，一般应高于人临床一次公斤体重最大剂量。考虑到实验室间差异、动物反应差异和制剂的差异，建议限值至少应小于LD1可信限下限的1/3(建议采用1/6) ，或小于LD50的1/4(建议采用1/8)。如药品半数致死量与临床体重剂量之比小于20时，可采用LD1可信限下限的1/3。静脉注射最大剂量0.8ml/20g体重仍未见毒性反应或死亡，可以此作为检查限值。注射速度可按常规速度（0.1mL／秒），如有特殊要求可在限值中注明。 一般采用静脉注射给药，特殊品种采用其他适宜方法，应说明理由并在正文中字明。 讨论： 1．确定异常毒性检查限值时，应避免因药品正常毒性出现的假阳性。据文献报告，实验室间同一药物静脉注射LD50有差异但相对较小（同种系小鼠一般不超过1倍）。由于异常毒性检查观察时间为48小时，因此，限值设定前必须进行以一定注射速度静脉单次给药观察72小时急性毒性试验（常用昆明种小鼠），求得LD50和LD1及其可信限。如用14天的结果，有的药品因LD50变小而降低限值水平。 小鼠急性毒性数据（LD50和LD1及其可信限），可采用2组以上动物（每组10只）进行试验，结果用简化机率法（顾汉颐法）或点斜法计算LD50和LD1及其可信限（参考周海钧著“药品生物检定”和孙瑞元著“定量药理学”）
MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 简介： MTT 比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。MTT 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色Formazan 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定波长附近的吸光度。细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。 Leagene MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒采用了Leagene 自主研发Formazan solvent ，使检测本底低，灵敏度高，线性范围宽。 组成： 自备材料： 1、 细胞培养液 2、 胰蛋白酶消化液 3、 低速离心机 4、 96孔培养板 5、 细胞计数板或计数器 6、 细胞培养箱 7、 摇床 8、 显微镜 9、 酶联免疫检测仪 操作步骤(仅供参考)： 1、 细胞用含血清的培养液培养至对数生长期，常规胰蛋白酶消化液消化细胞(悬浮细胞无需消化)。 2、 低速离心，收集细胞沉淀。 3、 用培养液重悬细胞沉淀，制备成单细胞悬液，并计数。 编号 名称 CT0026 500T Storage 试剂(A): MTT solution(5mg/ml) 5ml -20℃ 避光 试剂(B): Formazan solvent 60ml RT 使用说明书 1份
4、细胞接种于96孔培养板，一般接种密度为3000～10000个细胞/孔。通常细胞增殖实 验每孔加细胞，细胞毒性实验每孔加入细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定。 5、CO2继续培养或按照实验具体需要进行培养。 6、按照实验具体要求，给予干预药物处理，CO2继续培养至合适时间。 7、弃培养液，每孔加入MTT solution和100μl 新鲜培养液，在细胞培养箱内继续孵育。 8、弃培养液，每孔加入Formazan solvent，置摇床上低速振荡，使结晶物充分溶解。如 果紫色结晶较小或较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大或较多，溶解的时间会长一些。 9、在酶联免疫检测仪570nm测定各孔吸光度。 注意事项： 1、MTT solution尽量减少反复冻融的次数，当颜色变为灰绿色时，请勿使用。 2、由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，应注意蒸发问题。 3、MTT solution在低温情况下会凝固，置于室温或20～25℃水浴至全部融解后使用。 4、Formazan solvent可以-20℃储存，当产生沉淀或凝固时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。 5、观察formazan是否完全溶解，亦可以借助光学显微镜观察。 6、培养细胞时尽量细菌避免污染。 7、应注意设立OD调零孔和对照。 8、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 CC0033Hanks平衡盐溶液(1×HBSS,无酚红) CC0130胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%) CT0025MTT溶液(5mg/ml) DA0065台盼蓝染色液(0.4%) NR0001 DEPC处理水(0.1%) PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)