黄瓜绿斑驳花叶病毒病危害西瓜抽样技术初探
植物病毒检测技术研究进展汇总
植物病毒检测技术研究进展 刘茂炎 摘要：随着现代技术的发展特别是分子技术的发展，鉴定和检测病毒的方法越来越多，也越来越精确快速。以PCR为基础的基因工程技术已经广泛应用于病毒核酸分子的鉴定，其高灵敏度和高特异性是与PCR扩增反应的特异性引物相关联的；于此同时传统的鉴定检测技术依然有其发展优势。不论怎样的方法技术，都是以病毒的理化性质以及侵染性为基础的。在此基础上，甚至出现了某些边缘技术在病毒鉴定检测方面的应用。本文主要综述的是对植物病毒鉴定检测技术的研究进展。 关键词：植物病毒；检测技术；PCR 病毒在生物学上特征（如病毒的理化性质，包括病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）是对病毒最直观的认识。常规的对植物病毒的鉴定检测方法有：生物学测定方法、血清学技术、电子显微镜技术、分子生物学技术等。生物学测定依据病毒的侵染性，观察寄主植株或其它生物的症状表现；血清学技术以病毒外壳蛋白(CP)为基础；电子显微镜技术依据病毒的形状大小的不同；分子生物学鉴定则以病毒核酸为基础。 1.生物学鉴定 最直接的方法是目测法，直接观察病毒对植物的病害症状。如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV），病害症状为叶上出现花叶症状，生长陷于不良状态，叶常呈畸形；玉米鼠耳病的诊断主要依据田间症状表现[1]。目测法因观察的主观性和症状的不确定性的影响而不精准。1929年美国病毒学家霍姆斯（Holmes）用感病的植物叶片粗提液接种指示植物，2~3天后接种叶片出现圆形枯斑，枯斑数与侵染性病毒的浓度成正比，能测出病毒的相对侵染力，对病毒的定性有着重要的意义，这种人工接种鉴定的方法就是枯斑和指示植物检测法。国内报道的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf fijivirus，RBSDV)可侵染28属57种禾本科植物，该病毒的主要传毒介体是灰飞虱(Laodelphax striatella)，
黄瓜绿斑驳花叶病毒发生概况、检测鉴定及防治
黄瓜绿斑驳花叶病毒发生概况、检测鉴定及防治纽内姆（北京）种子有限公司齐中举（病理助理） 1.黄瓜绿斑驳花叶病毒病概况 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)，为烟草花叶病毒属，是西瓜、黄瓜、南瓜等葫芦科作物上的一种毁灭性病害，具有危害严重，致病性强，防止难度大等特点。 1.1危害症状：CGMMV 侵染许多葫芦科作物，引起植物叶片斑驳、系统性花叶及果肉恶化等症状。在黄瓜上, 最初新叶上出现黄色小斑点, 随后逐渐发展为花叶、斑驳和浓绿泡状突起等症状, 叶脉间褪色呈绿带状。在西瓜上，初期茎端幼叶呈现淡黄色花叶，随后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻；果实表现有浓绿圆斑，中央有坏死点，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色且出现空洞。在甜瓜上，受害的新叶上出现黄斑，随叶片老化症状减轻；成株侧枝的叶片呈现不定形或星状黄化叶，生长后期顶部叶片有时产生大型黄色轮斑；幼果受害后有绿色花纹，后期为绿色斑，或在绿色斑中央出现灰白色斑。在黄瓜叶片上引起色斑、水泡及变形，使植株矮化、结果延时，果实大部分黄化或变白并产生黑绿色水疱状的坏死斑，产量损失达15%；可延缓黄瓜植株的生长发育，甚至导致不孕。 1.2发生分布：黄瓜绿斑驳花叶病毒病20世纪30年代在欧洲国家发生，60年代因黄、西瓜和瓠瓜而传入印度和日本，80年代传入台湾。2002年中国从日本引进种苗中截获，2004年厦门从日本进口的南瓜种子上检测到CGMMV，2005年中国辽宁省盖州市感染CGMMV 在我国辽宁盖州地区造成西瓜大面积毁灭,受害面积达333 hm2，约13hm2绝收，CGMMV 现在中国部分地区已造成西瓜毁灭性的损失。农业部发布的第788 号公告，郑重宣布将CGMMV 确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害。 目前，CGMMV 在中国主要分布于辽宁、河北、湖北、广东和山东，发生率达80%，河南、四川、江西、上海、新疆、陕西及宁夏等省份还未发现。 1.3传播方式：该病毒主要侵染甜瓜、西瓜、黄瓜及瓠瓜等多种葫芦科作物，主要通过种子、土壤、机械摩擦、田间农事操作、植物间接触、叶片接触、啮齿动物( 如兔子、小白鼠等) 的粪便、栽培营养液、河水、灌溉水、被污染的包装容器、用作肥料的
芫菁病毒TuMV 黄瓜花叶病毒CMV
芫菁病毒TuMV 黄瓜花叶病毒CMV 白菜软腐病Erwinia carotovora白菜霜霉病Peronospora parasitica 蔬菜菌核病Sclerotinia sclerotiorum蔬菜根肿病Plasmodiophora brassicae 大豆胞囊线虫Heterodera glycines大豆霜霉病Peronospora manschurica大豆灰斑病Cercospora sojina大豆炭疽病Colletotrichum destructivum大豆花叶病毒SMV大豆矮化病毒SDV大豆紫斑病Cercospora kikuchii大豆褐斑病Septoria glycines大豆菟丝子Cuscuta chinenis大豆疫病Phytophthora sojae 花生根节线虫Meloidogyne arenaria 花生锈病Puccinia arachidis花生叶斑病Cercospora personata花生网斑病Ascochyta adzamethic 向日葵菌核病Sclerotinia sclerotiorum向日葵褐斑病Septoria helianthi向日葵锈病Puccinia helianthi向日葵霜霉病Plasmopara halstedii向日葵黄萎病Verticillium dahliae 甘薯黑斑病Ceratocystis fimbriata甘薯茎线虫Ditylenchus destructor甘薯软腐病Rhizopus stolonifer 马铃薯晚疫Phytopthora infestans马铃薯病毒病PVX PVY PLRV马铃薯环腐病Clavibacter michiganense 棉花黄萎病Verticillium dahliae棉花枯萎病Fusarium oxysporum 苹果树腐烂病Valsa mali苹果斑点病Alternaria mali苹果褐斑病Marssonina coronaria （无）苹果轮斑病Alternaria mali梨黑星（有）Venturia pirina （无）Fusiclasium pyrorum 葡萄白腐病Coniella diplodiella葡萄黑痘病Sphaceloma ampelinum （×）1辽宁苹果上主要三种果腐病害指轮纹病、褐腐病和灰霉病。 （×）2葡萄组织在前期幼嫩时抗黑痘病，但易感白腐病。 （×）3花生根结线虫以二龄幼虫为侵染期幼虫，而大豆胞囊线虫为三龄。 （√）4大多植物病害的菌核病菌均为土壤习居菌。 （×）5在辽宁苹果黑星病作为果园的主要病害，被列为检疫对象。 （×）6果园周围禁栽桧柏，是因为锈果病菌在桧柏上越冬，利于病害传播。 （×）7对于棉花枯黄萎病的防治，药剂灌根是一治标治本的根本性措施。 （√）8防治地下害虫是减轻白菜软腐病的主要措施之一。 （√）9十字花科蔬菜病毒病的毒源主要为TuMV和CMV。 （×）10植物病原菌主要靠气流、雨水和昆虫等媒介传播，而人为很少传播。 （√）1苹果锈果病曾认为是由类菌原体引起的，现已证实是由类病毒所致。 （√）2十字花科作物花叶病毒病的病原主要为TuMV，其次是CMV，二者均可蚜虫传播。 （×）3葡萄黑痘病是北方葡萄园的重要病害，已列为检疫对象。 （√）4地蛆和黄曲条跳甲是田间传播大白菜软腐病的重要昆虫。 （√）5梨锈病事宜桧柏为转主寄主的病害，砍掉桧柏对于防治梨锈病十分有效。 （×）6棉花黄萎病和枯萎病发生盛期一般均是在棉花现蕾期。 （×）7大豆胞囊线虫1、2龄幼虫在卵内发育，3龄幼虫破壳而出侵入寄主发病。 （√）8苹果树腐烂病菌是弱寄生菌，主要从伤口侵入已坏死的组织。 （√）9果树早期落叶病主要指绿缘褐斑病、灰斑病、圆斑病及轮纹病。 （×）10沈阳地区葡萄霜霉病菌不能在病组织或随病叶遗留在土壤中越冬，初侵染源是外来菌源。 选择题 1（D）白菜霜霉病发病适宜条件：A高温高湿B高温低湿C低温低湿D低温高湿 2(ABD)大豆病毒病主要传播途径有：A汁液B种子C粉虱D蚜虫 3()保护地蔬菜土传病害的主要控制措施：A栽培管理 B品种轮换C喷药D轮作
基因芯片及其在植物病原物检测中的应用
基因芯片及其在植物病原物检测中的应用 摘要:基因芯片是近年来发展起来的一项新兴技术，是把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成致密、有序的DNA分子点阵，在基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等方面起着重要的作用。基因芯片技术已广泛应用于病原物检测，在植物病害预测和防治中起着重要的作用。 关键词:基因芯片; 病原物检测 1996年，美国Affvmetrix生物公司制造出世界上第一块商业化的基因芯片(Gene chips)，由此掀起了基因芯片研究热潮。基因芯片被迅速而广泛地应用于生命科学与医学的各领域，被誉为继大规模集成电路后又一次意义深远的科技革命[1]。随着基因芯片技术的不断发展，其在生命科学和医学中的研究领域中的应用几乎是全方位的，包括基因定位、DNA测序、突变检测、基因筛选、基因诊断和发现新基因等［2］。本文仅叙述基因芯片原理已经基因芯片在植物病原物检测中的作用。 基因芯片的基本原理 基因芯片，又称DNA芯片(DNA chips)，属于生物芯片(bio-chip)中的一种，是综合微电子学、物理学、化学及生物学等高新技术，把大量DNA探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龙膜等载体上，形成的致密、有序的DNA分子点阵，因固相载体常用硅玻片或硅芯片，故称之为基因芯片［3］。基因芯片技术的基本原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术:将短链核酸分子固定在固相载体上作为探针，待分析样品经过标记后与固定在芯片上的探针杂交。其技术流程主要包括芯片的制备、待测样本的制备和标记、杂交反应、结果检测和数据处理分析等。与传统的核酸印迹杂交技术相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作简单、重复性强以及可以反复利用等诸多优点［4］。
侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒的初步鉴定_秦碧霞
侵染观赏南瓜的黄瓜绿斑驳花叶 病毒的初步鉴定 秦碧霞 蔡健和 刘志明 陈永惠 朱桂宁 黄福新 (广西农科院植保所 南宁 530007) Preliminary identification of a Cucumber green mottle mosaic virus infecting pumpkin .Qin B ixia ,Cai Jianhe ,Liu Zhiming ,Chen Yonghui ,Zhu Guining ,Huang Fuxin (Institute of Plant Protection , Guangxi Academ y of Agricultural Sciences ,Nanning ,530007,China ) A bstact A virus isolate ,P -3(NN )was obtained from pumpkin planted in a agricultural demonstration zone in Guangxi .P -3(NN )was found to cause systemic mosaic ,vein clearing or systemic chlorotic spot in all the Cucuribitaceae plants tested ,cause local c hlor otic spot in Datura stramonium and on infection in other Solanaceae ,Leguminosae or Chenopodiaceae plants tested .The lethal temperature of the virus was 95℃to 100℃.Straight tubular particles were observed under electron microscope .The length of most virus particles was close to 300nm .ELI SA test indicated that P -3(NN )showed a close relationship with Cucumbe r green mottle mosaic virus (C GMMV ).All the results suggest that P -3(NN )is an isolate of CGMMV . Key words pumpkin ,Cucumber gre en m ottle mosaic virus ,virus identification 摘要 从广西某农业展示中心观赏南瓜上分离到一种直杆状病毒,长约300nm ,该病毒分离物P -3(NN )在测试的葫芦科作物上表现为系统花叶、褪绿斑及明脉症状,在曼陀罗上为局部褪绿斑,在测试的其它茄科作物及豆科和藜科作物上无任何症状反应。其致死温度为95～100℃。经DAC -ELISA 测定,P -3(NN )与黄瓜绿斑驳花叶病毒有密切的血清学关系。根据以上结果,初步鉴定P -3(NN )为黄瓜绿斑驳花叶病毒(C GMMV )的一个分离物。 关键词 观赏南瓜 黄瓜绿斑驳花叶病毒 病毒鉴定 黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumbe r green mottle mosaic virus ,CGMMV )是烟草花叶病毒 属(Tobamovirus )的成员,最早由Ainsworth (1935)记述,主要分布在欧洲、印度和日本等国葫芦科植物上 [1] 。该病毒极易通过汁液传 播,种子带毒是主要的远距离传毒方式,是一种对葫芦科植物具有潜在威胁的病毒之一, 属潜在危险性有害生物。Hseu SH .等[2] 曾在我国台湾的葫芦科作物上分离鉴定出该病毒,但我国大陆目前尚未见该病毒发生的报 — 198— 基金项目:广西青年科学基金项目(桂科青0135006),广西新世纪十百千人才工程项目(2001215),广西农科院科技发 展基金项目(2002025)收稿日期:2004-12-20
CMV-黄瓜花叶病毒
黄瓜花叶病毒—CMV 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus ，简称CMV)是一 种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的 任何部位。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、 最具经济重要性的植物病毒之一。全世界所有烟草种植 区均有该病毒的分布和危害。世界上分布在英国、德国、 丹麦、俄罗斯、印度、日本、韩国、希腊、罗马尼亚、 匈牙利、捷克、保加利亚、巴西、爱尔兰、摩尔多厄、 瑞典、芬兰、波兰等地区以及中国台湾。 黄瓜花叶病毒-病理概述 苗期染病子叶变黄枯萎，幼叶呈深绿与淡绿相间的花叶状， 同时发病叶片出现不同程度的皱缩、畸形。成株染病新叶呈黄 绿相间的花叶状，病叶小且皱缩，叶片变厚，严重时叶片反卷； 茎部节间缩短，茎畸形，严重时病株叶片枯萎；瓜条呈现深绿 及浅绿相间的花色，表面凹凸不平，瓜条畸形。 重病株簇生小叶，不结瓜，致萎缩枯死。该病从苗期到大田期 均可发生，发病初期叶脉呈半透明状，几天后就出现浓淡不均 的典型花叶。病叶形成黄绿或深绿的泡斑，叶片扭曲畸形，叶 尖细长呈鼠尾状，叶基伸长，侧翼变窄变薄甚至完全消失，发 病早的植株明显矮缩。病株根系发育不良。在田间普通花叶病 与黄瓜花叶病很相似，难以区别，需要作血清学及电镜鉴定。 黄瓜花叶病毒-病态症状 多全株发病，苗期发病子叶变黄枯萎，幼叶呈现浓绿与淡绿相间花 叶状，成株发病新叶呈黄绿相嵌状花叶，病叶小，略皱缩，严重的叶反 卷，病株下部叶片逐渐黄枯。瓜条发病表现深绿与浅绿相间疣状斑块， 果面凹凸不平或畸形，发病重的节间短缩，簇生小叶，不结瓜，以致萎 缩枯死。发病初期表现“明脉”症状，逐渐在新叶上表现花叶，病叶变窄，
植物病毒分子检测方法概述
植物病毒分子检测方法概述 邵碧英 (福建出入境检验检疫局 福州 350001) 植物病毒粒体主要由核酸和蛋白外壳构成,蛋白外壳由许多外壳蛋白(CP)组成。 CP和核酸因病毒的不同而异,是检测、鉴定植物病毒的主要依据。广义的植物病毒分子检测方法包括蛋白质检测(或血清学试验)和核酸检测方法,本文分别介绍。 1 以病毒外壳蛋白为基础的检测方法 植物病毒的CP具有抗原性,很多病毒可以被提纯并制备成高效价的抗血清,根据特异性的抗原抗体反应可检测植物病毒的存在。血清学方法有很多,应用较广泛的是酶联免疫吸附反应,在此基础上加以改进也发展了一些新的检测方法。 111 酶联免疫吸附反应(EL ISA) EL ISA是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板)吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法。酶标抗体(或抗抗体)与相应抗原反应时形成酶标记的免疫复合物,酶遇到相应的底物时产生颜色反应,颜色深浅与抗原量正相关。该方法已被用于各种植物病毒检测。 后来发展的用酶标A蛋白取代酶标抗抗体的EL ISA被称为A蛋白酶联吸附法(SPA-EL ISA)。几种植物病毒的SPA-EL ISA诊断试剂盒已被研制成功[1]。 EL ISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测。 112 斑点免疫吸附法 20世纪80年代发展的以硝酸纤维素膜(NCM)为固相载体的酶联免疫吸附试验—斑点免疫吸附法,检测原理类似于EL ISA,但酶与底物反应产生不溶性产物,在NCM 上形成有色斑点,斑点颜色深浅与抗原的量成正比。也已用于各种病毒检测。 斑点法简便,反应时间短,反应结果可长期保存,不需任何特殊设备,也适合于大量样品的测定。 113 直接组织斑免疫测定法(IDD TB)与EL ISA相比,斑点法更为简便,但仍然需要提取病毒的粗提液或提纯制剂,试验过程较繁琐。改进后的直接组织斑免疫测定是直接把植物组织切块固定于膜上,然后利用抗原抗体特异反应来检测植物病毒。 鞠振林等[2]以IDD TB检测病组织中的马铃薯X病毒Potato virus X等多种病毒获得较好结果。徐明全等[3]采用IDD TB法从兰花叶片中检测到建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus。把石斛兰叶片从叶尖至叶尾每0.5cm切割1次并压印在膜上,检测结果可直接显示出感染病毒的具体部位。 组织印迹法明显比EL ISA和DIBA的试验程序简单、快速。但病毒在植物的不同部位分布不均匀,同一样品要重复多次,以提高检测的准确性。 114 电印迹免疫分析(EBLA) 电印迹免疫分析方法首先用SDS2PA GE 分离病毒CP,把蛋白带转移到膜上,再进行抗原杭体反应,根据CP分子量和吸附特异性抗血清的特殊带来判断该病毒的存在与否。 EBLA和EL ISA、DIBA相比具有明显的优点,通过电泳将植物病毒的CP和植物组织中的其它蛋白分离开来,排除了杂蛋白的干扰,可检测低浓度的植物病毒。此方法 — 7 7 3 —
植物病毒病检测方法
植物病毒病检测方法 植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。 1.4.1侵染力测定法 侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。 局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。 淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。 侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验
黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生症状及防控措施
龙源期刊网 https://www.docsj.com/doc/8b17464780.html, 黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生症状及防控措施 作者：周红珍张志勇彭辉 来源：《现代农业科技》2013年第18期 摘要介绍黄瓜绿斑驳花叶病毒病的发生症状，并据此提出相应的防控措施，以为黄瓜绿 斑驳花叶病毒病的防治提供参考。 关键词黄瓜绿斑驳花叶病毒病；发生症状；防控措施 中图分类号 S436.421 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2013）18-0138-01 近年来，随着国家和省市对高效农业发展的高度重视和政府投入的增加，睢宁县设施规模农业迅猛发展，尤其是设施蔬菜发展最快。截至目前，睢宁县设施蔬菜面积已发展逾1.33万hm2，其中黄瓜种植面积占设施蔬菜面积30%以上，西瓜约占10%。但有多种病害影响黄瓜、西瓜产量和品质，其中黄瓜绿斑驳花叶病毒病是危害黄瓜的重要病害之一。 黄瓜绿斑驳花叶病毒病是一种危害葫芦科植物（黄瓜、西瓜、甜瓜、葫芦、笋瓜、西葫芦、棱角丝瓜、无花果、叶瓜）的重要植物检疫性病毒病[1-2]。2012年6月，该病首次在江 苏省发现，在睢宁县部分黄瓜田上有发生，导致部分瓜农种植效益受损。做好黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防治，对提高其产量与质量都有重要意义。 1 发生症状 黄瓜绿斑驳花叶病毒病主要通过带毒种子远距离传播或通过接触性传染，在田间主要通过病株汁液、嫁接、土壤中的病残体等方式进行传播，病毒在种子或土壤中可存活1年以上。植株受害后，叶片出现黄斑、花叶或产生绿色突起或凹凸，植株生长缓慢或矮化，严重的可导致不孕；果实外部症状不明显，内部果肉常出现油渍状深色病变，中心纤维质呈深色，向果肉内部条状聚集；种子周围形成暗紫红色油泽状空洞。在不同作物上有以下具体体现。 1.1 黄瓜 黄瓜受害后，有黄色小斑点着生于新叶上，后逐渐变成花叶并带有浓绿色突起，有色斑、水泡及变形情况发生，叶脉间褪色呈绿带状。大部分果实黄化或变白并产生墨绿色水疱状的坏死斑。植株矮化，结果延时，导致产量受损，甚至因不孕而绝产。 1.2 西瓜
详细分析大棚蔬菜病毒病的来源传播途径及防控措施
详细分析大棚蔬菜病毒病的来源传播途径及防控措施 病毒来源 1、种子 种子带毒容易被忽视，虽然通过种子直接传播的病毒不多，但种子表面携带的病毒往往成为设施内蔬菜病毒病发生的重要源头。这类病毒在种子萌发过程中侵入幼苗，造成苗子发病，且这类病毒通常通过接触传播，一棵发病的幼苗成为全田病毒病发生的源头，经过打杈等农事操作逐渐传播到全田。 常见的辣椒花叶病毒病、番茄花叶病毒病、黄瓜绿斑驳病毒病、番茄黄化曲叶病毒病能够由种子传带病毒引起。 带毒种子的源头是制种田发生的病毒病，制种公司往往不重视繁种过程中发生的病毒病。 对种子进行清洗、热处理可以去除种子表面和钝化种子内存在的病毒。
简单清洗方法：盆中加入热水，用凉水和温度计调温度到55℃，加入种子，维持水温在55℃，浸泡15分钟，用于降低和钝化种子表面携带的病毒和其他病原菌。如果病毒病严重或怀疑有病毒，则用10%磷酸三钠溶液浸泡20分钟，捞出用清水洗净。包衣的种子无需用此方法处理。 ? 2、带毒苗子 购买苗子和从外地调运苗子已成为常态，育苗过程中发生的病毒病症状不明显，不容易被发现。番茄黄化曲叶病毒病经番茄苗子调运扩散到我国多个省份，教训深刻。 对于一些无性繁殖材料，特别是根茎、块茎、枝条等，如果最初的材料携带病毒，会导致病毒病在快繁过程中普遍发生，如紫背天葵等叶菜。 ? 3、设施、棚室内外杂草、花卉、绿植等，特别是多年生的杂草，是病毒保存库，使得病毒能够长期存活，通过蚜虫、粉虱等小型害虫传播到设施内的蔬菜上。病毒在杂草上通常不显症，但对茄科等种类蔬菜危害大。 ? 4、小型害虫，如蚜虫、粉虱、蓟马、叶蝉等，群体大，繁殖快，寄主范围广，其传播病毒造成的危害更大。例如蚜虫能传播的黄瓜花叶病毒、瓜类蚜传黄化病毒，粉虱能传播番茄黄化曲叶病毒、番茄褪绿病毒，蓟马能传播番茄斑萎病毒……这些在我国多地都有发生，严重影响番茄、辣椒等蔬菜的品质和产量。 ? 还有两个方面能造成病毒病严重发生，但是在实际生产种却容易被忽视。? 1、土壤 一些种类的病毒在土壤中能存活几年到十几年，如引起茄科、葫芦科蔬菜花叶病毒病的烟草花叶病毒、辣椒轻绿斑驳病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒等。目前常用的土壤消毒不能杀死病毒。 2、吸烟 烟叶中大多含有烟草花叶病毒、马铃薯Y病毒等对番茄、辣椒造成严重危害的病毒，这些病毒经烤制后仍具有侵染力，工人吸烟时手会沾染到烟丝
植物的病毒检测技术
植物的病毒检测技术 植物病毒病害是一类重要病害,几乎在各类作物上都有发生,严重影响农作物的产量和质量,用一般的方法难以防治,是生产上的一大难题。种植无病毒种子、苗木是一种非常有效的防治措施。因而如何对种子、苗木等无性繁殖材料以及在发病早期对植株进行快速准确地检测诊断就显得尤为重要。最初植物病毒检测主要依靠生物学性状,但生物学方法费时费力,检测周期长,而且易受环境条件的影响,反应不稳定、重复性差。目前植物病毒检测主要是血清学检测(以病毒外壳蛋白为基础)和核酸检测,前者主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等;后者主要有PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等。 1 血清学检测方法 1．1 酶联免疫吸附测定(ELISA) 酶联免疫吸附测定是一种采用固相(主要为聚苯乙烯酶联板) 吸附,将免疫反应和酶的高效催化反应有机结合的方法,其基本原理是以酶催化的颜色反应指示抗原抗体的结合。该方法首先将同源特异抗体吸附在反应器皿底部，加入欲测试的含病毒的样品，病毒与抗体结合，病毒颗粒被固定，再加入标记的特异抗体和酶的底物，酶与底物反应后会出现有颜色的溶液其强度与病毒浓度成正比，用此方法可测定出病毒的浓度。ELISA方法简单,灵敏度高,特异性强,适于大量样品的检测,目前该方法已被广泛用于植物病毒检测。在此基础上加以改进又发展了一些新的检测方法,如A 蛋白酶联吸附(SPA-ELISA)、斑点免疫吸附(DIBA)、直接组织斑免疫测定( IDDTB) 、伏安酶联免疫分析[1]、快速ELISA 等。 1．2 快速免疫滤纸测定法(Rapid immuno-filter paper assay , RIPA) 快速免疫滤纸测定类似乳胶凝集反应,其原理是把待测病毒的抗体吸附在乳胶颗粒上,通过大颗粒乳胶间接反应小颗粒病毒的存在。所不同的是RIPA使用了一种红色乳胶,从而使检测更加简单和直观。RIPA[2]目测检测提纯TMV 的灵敏度分别可达 5ng/ml～50ng/ml 。 1.3 免疫胶体金技术( Immunogold2label as2say) 免疫胶体金技术最早起源于电镜方面的研究,由于金在生物学上是惰性的,且有良好的电荷分布,可以和蛋白质(如抗体、A 蛋白等)紧密结合,因此广泛应用于生物学和微生物学的各个领域。其原理是用柠蒙酸钠将氯金酸金离子还原为胶体金。胶体金颗粒在适当的条件下,以静电、非共价键方式吸附抗体IgG(或A蛋白)分子,从而形成稳定的IgG(或A蛋白) - 胶体金复合物。通过抗原抗体特异性结合,抗体(或A蛋白)胶体金复合物就可以结合在抗原上。金颗粒吸附在病毒粒体周围,从而得到明显的鉴别性和可见度[3] 。 随着技术的发展,1971年Taylor 等报道了免疫金染色技术( Immunogold staining) ,1981年Danscher又创建了免疫金- 银染色技术( Immunogold-silver staining) 。自1983年首次成功使用胶体金标记的抗体检测植物病毒以来,该技术逐渐被应用于植物病毒的检测。20 世纪80年代发展起来的斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold fitration assay) 是一种快速免疫胶体金诊断技术,该技术以硝酸纤维素膜为载体,利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细管作用,使抗体抗原反应和洗涤在一特殊的渗滤装置中迅速完成,从而大大缩短了检测时间。在此基础上,又建立了更为简
植物病毒的免疫检测
植物病毒的免疫检测 (重庆文理学院生命科学与技术学院，重庆永川 402160) 摘要：免疫学检测技术广泛应用于植物病毒测定，是当今主要的病毒检测方法之一。 该文针对免疫学方面讲述了现代主要应用的植物病毒免疫检测的方法。 关键词：植物病毒；免疫；免疫检测 Immune Detection of Plant virus Xing Yang-wu （School College of Life Science and Technology，Chongqing University of Arts and Sciences，Yongchuan，Chongqing 402160，China） Abstract: Immunological detection technology is widely used in plant virus measured， and Is one of the major virus detection today.This paper describes for the immunological aspects of the main applications of modern plant virus immune detection. Key words:plant virus; immune; immune detection 植物病毒危害日益严重，不仅对植物造成伤害，还给种植业带来重大的损失。因此植物病毒防治越来越受到广泛关注，其病毒检测方法不断提高。随着检验检疫有害生物范围的扩大，检测精确性、灵敏度、检验时间及简化操作程序要求的日益提高，传统的形态学、细胞学等方法已经远远不能满足检测的需要[1]。植物病毒的免疫学检测是最普遍广泛应用的检测方法之一，这方面的研究也在不断的深入。下文讲述近年来主要应用的植物病毒免疫检测方法。 1 酶联免疫吸附测定 酶联免疫吸附测定(ELISA)是在植物病毒病诊断上最广泛使用的一种免疫学方法。它不仅具有免疫荧光法和放射免疫法的反应灵敏、特异性强的优点，而且克服了常规血清学方法受病毒浓度、粒体形态和抗血清用量等限制的缺点[2]。其原理是把抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用相结合，通过化学方法将酶与抗体结合，形成酶标抗体。在遇到相应底物时，酶催化无色底物产生化学反应，生成有色化合物，其强度与病毒浓度成正比，用此方法也可测定出病毒的浓度，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度[3]。 ELISA反应有多种方法，如间接法、双抗体法、竞争法、双夹心法和酶一抗酶抗体法等等，但实验的基本过程都相似。E.LISA反应有很高的灵敏度，用它检测菜豆黄斑花叶病毒(BYMV) ，所使用提纯的病毒抗原浓度仅需5ng/mL。但其灵敏度与核酸杂交技术相比还稍差[4] .ELISA反应快速便利，很适合于大规模田间样本的常规病毒检测，也广泛用于脱毒
烟草花叶病毒的检测方法研究进展
烟草花叶病毒的检测方法研究进展 摘要烟草花叶病毒（TMV）的寄主范围相当广泛，给农业生产带来重大损失，加强对该病毒的检测具有重要意义。在查阅近年来国内外文献的基础上，总结了对烟草花叶病毒的检测方法如直接观测法、电子显微镜检测法、生物学测定法、血清学检测和分子生物学检测法等的研究进展。随着植物种质资源的引进和生态条件的改变，对检测TMV方法提出了更高的要求，因此在实际应用中要综合运用各种检测方法提高检测的准确性。 关键词烟草花叶病毒；检测方法；研究进展 烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是一种RNA病毒，病毒粒体为棒状，长度为300～310 nm、直径18 nm；病毒基因组为单分子线形正义ssRNA，长6 300～6 600 nt；衣壳蛋白由一种多肽组成，分子质量为17～18 kDa。TMV 的寄主范围非常广，可侵染的植物达150多个属，主要是一些草本双子叶植物，包括蔬菜、花卉和烟草等，导致烟草和番茄等作物的严重危害[1]。烟草业在我国经济中占据着重要的地位，而烟草花叶病严重危害烟叶的产量和质量，成为优质烟叶生产的因子，是烟叶出口所面临的挑战，同时给我国造成巨大的经济损失。不同条件下同种病毒的症表现状有很大差异，而不同病毒在烟叶上表现为相似的症状，烟草花叶病毒检测对于烟叶病毒的防治提供理论依据，同时也对进一步识别病毒病害和防止病毒传播危害具有重要的实际意义。 1 直接观测法 直接检查植株叶子和茎有无可见的病毒症状。烟草花叶病毒属中大多数病毒的寄主范围较广，对外界环境的抵抗力强，自然传播不需要介体生物，靠植株间的接触（或有时种子）传播。如在烟草上自苗期至大田期可连续发生，早期发病烟株节间缩短、植株矮化、生长缓慢，幼苗被侵染后，新叶的叶脉颜色变浅，而后形成黄绿相间的花叶症；苗期侵染的植株发育缓慢。大田期植株发病，除显示明脉、花叶症状以外，病叶上会形成疱斑，厚薄不匀；叶片出现各种畸形。其缺点是寄主植物出现症状需时较长，取得鉴定结果较慢，且有的病毒并不使寄主表现症状，无法检测[2]。 2 电子显微镜检测法 显微镜长期以来是研究细胞、病毒及生物大分子的形态及结构的重要工具。烟草花叶病毒形态为直杆状，呈现为长300 nm、直径18 nm的圆柱形结构，其中心含有1个约4 nm的沟槽。该病毒蛋白外壳围绕1个约6 400个核苷酸的单股RNA形成。围绕单股RNA的蛋白亚基具有螺旋形结构，其螺距为2.3 nm。将感病材料制成超薄切片，在电子显微镜下直接观察。取5 μL溶解在20 mmoL/L 磷酸缓冲液（pH值7.0）中的烟草花叶病毒（0.2 mg/mL），将其滴加在新鲜剥离的云母表面上，然后用0.5%的磷钨酸染色。所得样品用AFM可以清楚地观察到棒状的TMV拓扑结构。
植物组织培养中脱病毒及其病毒检测技术的研究
植物组织培养中脱病毒及其病毒检测技术的研究 发表时间：2015-12-01T11:35:57.407Z 来源：《医药前沿》2015年第28期供稿作者：余伟庆毛泽玲（通讯作者）[导读] 浙江省桐庐县中医院病毒病害严重影响植物的生长发育，特别是危害通过嫁接、扦插、根繁等常规无性繁殖的植物。余伟庆毛泽玲（通讯作者） （浙江省桐庐县中医院浙江桐庐 311500） 【摘要】对组织培养中的脱病毒及其病毒检测技术进行了综述，脱病毒技术包括热处理、茎尖培养、茎尖微芽嫁接、热处理配合茎尖培养、热处理配合茎尖微芽嫁接等，病毒检测技术包括指示植物法、抗血清鉴定法、生化法和电子显微镜直接观察法等。 【关键词】组织培养；脱病毒；病毒检测 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）28-0354-02 病毒病害严重影响植物的生长发育，特别是危害通过嫁接、扦插、根繁等常规无性繁殖的植物，如桃、李、杏、杨、柳、香蕉、草莓、大蒜、康乃馨等。由于病毒是通过维管束传导的，因此利用有维管束的营养体繁殖，就会把病毒传递下去，并且逐代积累，病毒浓度越来越高，危害越来越严重[1]。常用的鉴定方法有指示植物法、抗血清鉴定法、生化法和电子显微镜直接观察法等。脱毒苗的鉴定要在相 关部门和权威机构的参与、指导和监督下进行。无病毒苗需要很好的隔离保存。通常无病毒原种材料是种植在隔离网室中，隔离网以300目网纱为好，网眼规格0.4～0.5毫米，主要是防止蚜虫进入传播病毒。栽培土壤要严格消毒，并保证材料在与病毒严格隔离的条件下栽培[2]。海岛或高岭山地，气候凉爽、虫害少，有利于无病毒材料的保持。脱毒苗在生产中应用，关键是要防止病毒的再感染。新种植区、新种植地块，较长时间后才会再度感染；曾种植过感病植株的重作区在短期内就可感染。一旦感染，影响生产质量时，应重新采用无病毒苗。 1.脱毒技术 1.1 热处理 热处理脱毒主要是利用病毒受热的不稳定性而失去其活性达到脱病毒目的。通常是将热处理中伸长生长出的新梢顶端部分嫩枝嫁接到无病毒砧木上，或进行进一步的茎尖培养，或茎尖微芽嫁接以增大脱去病毒的机率。 在热处理茎尖的过程中，通常温度越高、时间越长、脱毒效果就越好。但是同时植物的生存率却呈下降趋势，所以温度选择应当考虑脱毒效果和植物耐性2个方面。洪霓等在梨病毒的脱毒研究中采用2种处理：一为恒温处理，温度控制在37±1℃；二为变温处理，温度为32℃和38℃每隔8h变换1次，发现变温处理比恒温处理植株死亡率低，脱毒效率高[3]。 热处理的缺陷是不能脱除所有病毒。例如在侵染马铃薯的病毒之中，对于PLRV、PVA和PVY不进行高温预处理，脱毒率也相当高，而高温预处理却可以显著提高对PAMV、PVX和PVS的去除。一般而言，对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效，对杆状和线状病毒的作用不大。 1.2 茎尖培养和茎尖微芽嫁接 茎尖培养之所以能够除去病毒，是由于病毒主要是通过维管束传导的，所以病毒在感病植株内的分布不一致。维管束越发达的部位，病毒分布越多；而生长点内无组织分化，即尚未分化出维管束，所以通常不存在病毒，把茎尖生长点接种在适宜的培养茎上进行组织培养，就可能培养出无病毒植株。由于茎尖培养脱毒效果好，后代遗传性稳定，而且还可同时脱除类病毒、细菌和真菌，所以是植物无病毒培育应用最广泛的一个途径[4]。试管微芽嫁接法脱病毒可以说是茎尖培养脱毒的一种改良方法，主要用于茎尖培养较困难的植物。 茎尖培养可能出现揭化、玻璃化等现象，这会严重影响植物的成活率，所以必须解决这些问题。褐化是由于外植体在培养过程中分泌的酚、醌类物质妨碍自身的生长[5]。而活性炭可以吸附外植体在培养过程中的有害物质，从而达到防止褐化的目的。在香蕉茎尖培养的培养基中加入活性炭或与维生素C配合使用均能改善外植体褐变情况。 2.检测技术 2.1 指示植物法 当原始寄主的症状不明显时，就可用指示植物法，因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。具体做法是将病叶研磨，把汁液接种到寄主植物上。指示植物法简便易行，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类[6]。 2.2 抗血清鉴定法 抗血清鉴定法要进行抗原的制备，抗血清的采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在-15～-25℃的冰冻条件下，此法灵敏度高，获得检测结果迅速，是目前检测病毒的一种最好方法[7]。此外，PCR微量板杂交法、蛋白质电泳法、嫁接检测法、电子显微镜检定法、病毒症状学诊断法等也可以用来检测植物病毒。 2.3 电子显微镜直接观察法 采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术[8]。由于电子的穿透力很低，制品必须薄到10～100um，通常制成厚20um左右的薄片，置于铜载网上，才能在电子显微镜下观察到。近代发展使电镜结合血清检测病毒，称为免疫吸附电镜(ISEM) [9]。 2.4 生化法 生化法包括酶联免疫法和RT-PCR检测法，酶联免疫法方法是将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体，使待检血清与对应抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断[10]。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测病毒DNA的转录产物，分析表达的水平。该方法已用于大蒜脱毒苗检测。 3.小结 综上所述，现有的脱毒技术多种多样，各有优缺点。常用的脱毒技术是热处理法、茎尖培养法、抗病毒药剂法，目前应用的趋势是将不同的方法结合起来应用。随着脱毒苗的大量生产，脱毒苗的检测技术也越来越重要，现在广泛应用的检测技术有两种，即ELISA方法和RT-PCR方法。但是ELISA方法需要制备抗体，而且一次只能检测一种病毒，所以相比较来说，最有前途的应当是RT-PCR技术，与其他方法相比，它特异性强、灵敏度高，而且不需要制备抗血清以及放射性探针，操作简单，适于广泛应用。
植物病毒病害抗性鉴定
实验15 植物病毒病害抗性鉴定 植物病毒是导致粮、菜、果、花卉产量下降、品质变劣的重要原因之一。自1892年俄国Iwanowsky发现烟草花叶病毒以来，己被正式命名的植物的病毒789种，并明确病毒只含有一种类型的核酸，即核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）， 70年代后发现了只含有小分子量 RNA、不含蛋白质、侵染活性很高的类病毒25种，80年代后发现了含有线状病毒基因组RNA和与类病毒相似的环状RNA的拟病毒40种。 植物病毒种类多，繁殖速率快，传播途径广，并且缺少有效防治药剂和措施。因此，植物病毒病一旦流行，危害之重，己超过真菌、细菌病害。因此，加强植物病毒研究，减轻植物病毒危害，对国民经济的发展具有重要意义。 本实验重点学习目前普遍采用的几种植物病毒病害检测及抗性鉴定的方法及步骤。 一、试材及用具 1．试材发病的植物组织及家兔等。 2．仪器及试剂高速冰冻离心机，离心管以及分子量为6000的聚乙二醇（PEG6000）、氯仿等。 二、方法步骤 （一）病毒检测 可用于植物病毒检测的方法主要有生物学测定、血清学检测、电镜检测、免疫电镜以及酶联免疫吸附反应（ELISA）、免疫PCR等分子生物学方法，其中血清学检测是快速、准确、 图5－1 病毒抗原的分离与纯化
灵敏度高、成本低的病毒检测方法，可用于实际检验检测工作中去。本实验重点介绍，其它方法可查阅有关文献资料。 利用血清学技术进行病毒检测，主要依据血清学反应（免疫学反应），即抗原与抗体之间发生的各种作用。抗原指的是能诱导产生抗体的一类物质，它可以是病毒、细菌、真菌、植物菌原体等微生物，也可以是酶类、DNA、RNA、类脂、多糖等有机化合物，甚至还可以是叶片、枝条等各类组织。抗体是指由抗原注射到动物体内诱导产生的、并能与抗原在体外进行特异性反应的一类物质，庄要是一些免疫球蛋白。含有抗体的血清通常称为抗血清。抗原能与由其诱导产生的抗体发生凝集、沉淀等反应，利用病原物中特异性强的抗原与相应的抗体反应，就能实现对病原物（病毒）的检测、鉴定。目前国际上己制备出 200余种重要植物病毒抗血清。我国农业部植检所为满足植物病毒检疫的研究和需要，先后制备出 30余种植物病毒抗血清。因此，利用血清学技术检测病毒，主要包括如下三个环节：1．病毒抗原的分离与纯化利用高速冰冻离心机等设备以及聚乙二醇（PEG）、氯仿等化学药品，从冰冻的病组织中分离、纯化病毒抗原。其操作步骤如图5－1所示。 2．病毒抗血清的制备病毒抗血清的制备主要包括试验动物选择、抗原注射、血样采集以及抗血清的收集与保存等过程，可用图5－2表示： 图5－2 病毒抗血清的制备与保存 3．血清学反应将抗血清及抗原进行一系列稀释后，采用试管沉淀、小试管环状沉淀、玻片凝集、免疫双扩散、免疫电泳及荧光抗体等反应方法进行血清学反应，从而实现对病毒的检测与鉴定。 （二）病毒病抗性鉴定 病毒检测的对象是病原物（病毒），是对病毒定性（病毒的有无及其种类）与定量的分析鉴定，而抗性鉴定的对象是寄主，即植物品种或种质对特定病毒的抵抗能力。目前植物病毒病抗性鉴定所采用的方法，大都为大田病圃法。例如，刘琴等（2002）对110个小麦引进品种在自然病圃区进行了对小麦黄花叶病的抗性鉴定。主要做法是，每个品种分别播种，设置对照与重复，于病害发生期调查发病率。所采用的病情分级标准是： 1级 抗（R）：发病率0%～9.9%；