鼠李糖脂

一、研究的立项依据
1 生物表面活性剂的分类与应用
生物表面活性剂可以追溯到1968年，当时Arima等人报道了在用Bac
J“btilis菌株培养时，在发酵液中发现了一个具有生物活性的新化合物，当这类物质
具有表面活性剂的性质，并有可能用于医药或生物工程上时，还未被充分重视。
直到1980年这类物质才引起重视，因为它们有可能是当时用来解决生态环境问
题的化学合成的表面活性剂的代替品时才受到重视。而且假如生态问题能够得到
解决的话，那么生物表面活性剂将在农业和石油工业中又能找到新用途了。
因为许多细菌能够在已知的简单、便宜的培养基中生长并生产表面活性剂，另外许多培养基的配比都有报道，这可以查得到。另外，许多农业副产物、食品
工业上的也可以作为培养基中某些营养物质的替代品。所以生物表面活性剂的原
料来源不受限制。另外生物合成的表面活性剂具在良好的生物生物降解性，和较
少的毒性，而且它们的生产也比较简单，容易实现。菌种来源也比较丰富，比如脂
肽表面活性剂的生产菌就有20种之多．生物表面活性剂必将得到越来越大的重
视，得到越来越广的应用。目前生物表面活性剂可被用作粘合剂、絮凝剂、润湿
剂与发泡剂、海星卵母细胞成熟抑制剂、抗肿馏活性剂、去乳化剂以及渗透剂、
解毒剂和其它的用途包括活性污泥处理。生物表面活性剂的分类，从结构方面出发，基本上可分为六大类，如表1．1
所示。
表
而鼠李糖脂的研究则在1949年才开始的。1949年Jarvis和Jo
色假单胞菌P．aeruginosa的培养液中分离出一种结晶的酸性糖脂，分析其
为它是由两摩尔的L-鼠李糖和两摩尔的羟基葵酸构成的。
国内外研究概况、水平和发展趋势及存在问题
鼠李糖脂是 目前研究较多的一种生物表面活性剂 ， 它不仅具有可与化学表面活性剂相媲美的增溶、乳化、润湿、发泡等性能，而且具有低毒、易于生物降解、 对环境友好等特性 ， 因而在石油开采、 医药、 食品、 日化、 环保等领域具有很大的 应用潜力。目前大多数的研究大多是流加发酵，规模还局限于摇瓶培养，但偶尔会有小规模或大规模的时候。在1990年时候有人在基于溶解氧浓度反馈控制生产鼠李糖脂，其产率很低，只有0．19／L。而当时使用的是以NH4N03(0．05M)作为而把葡萄糖(4％)作为碳源发酵的，还发现，在连续培养时，只要保持氮：铁：锰
=920：7．7：1．0，那么细胞可以连续培养至少36代以上。在后面的研究中有人用谷胺酸(59／L)作为有机氮源，葡萄糖(2％)作为碳源，聚糖和果糖也可作为有效的碳源使用过，而把不同氨基酸作为不同

氮源来使用时，不会引起什么不同效果，其产率只在0．6~o．Sg／L。但在改变氮源和限制氧浓度的时候，也就是把能量流重新用于产物合成方面，而不是用于细胞合成，其效果是明显的，最终导致产率为79／L，其产率为原来的10倍。1291德国专利【11最新报道新的铜绿假单胞菌DSM7107和DSM可以生产高浓度的鼠李糖脂70,-．-1209／L。
目前，限制鼠李糖脂在工业上广泛应用的主要因素是其过高的生产成本，而寻找价格低廉、来源广泛的原 料作为微生物发酵生产鼠李糖脂的培养基， 可有效降低其生产成本 。国内有研究在植物油的精炼过程中会产生大量有机废水， 这类废水的特点是有机物和油脂含量高 但不含重金属和其他有毒物质，可作为微生物发酵生产鼠李糖脂的原料。
每年食用油的生产过程中产生大量的废渣，包括残留的动植物油脂、皂角等，这些物质是鼠李糖脂生产中最常用的低成本原料。国外有研究橄榄油厂的污水，(00ME)这种污水是地中海地区国家的一种主要污染物，它是一种黑色液体，其中含有高浓度的有价值的有机化合物，如糖、氮化合物、胶质、多酚和残留油脂。研究发现P．口er昭流os JAMM利用00ME来生产鼠李糖脂，仅需在OOM
加2．5∥L的硝酸钠作为氮源，表面活性张力有明显的下降，从42 mN／m降到30 mN／m
3.本研究特色、创新性及立题依据（
近年来，人们对微生物产生的生物表面活性剂的兴趣曰益扩大，主要归因于
它们在改善微生物对有机物利用方面具有潜在的应用价值。葡萄糖对适应性酶的合成具有抑制性作用，对糖脂的合成也有类似的效果。许多微生物在以有机物为唯一碳源的培养基中生长时会产生同生长有关的生物表面活性荆，而在葡萄糖中生长时只能少量产生，甚至在有机物培养基中，葡萄糖的加入也会抑制糖脂的生成。这些生物表面活性剂均有助于培养基中烃基质的乳化，因而能够刺激微生物对烃的摄取并得以更好的生长。
鼠李糖脂作为一种表面活性剂。具有较强的表面活性和乳化性，临界胶束
浓度为0．005％。这类生物表面活性剂有助于培养基中烃基质的乳化，因而能够刺激微生物对烃的摄取并得以更好的生长。鼠李糖脂可以使营养缺陷型菌株恢复利用有机碳源的能力。当培养基中营养成分较少，而只含有大量的碳源时，加入一定量的糖脂将使细菌的生长速率加快。而且细菌本身产生的糖脂对其自身生长的刺激作用最为显著。但是目前对于细菌利用碳水化合物时起关键作用的细胞组成仍然知之甚少。
鼠李糖脂作为一种表面活性剂。具有较强的表面活性和乳化性，临界胶束
浓度为0．005％。这类生物表

面活性剂有助于培养基中烃基质的乳化，因而能够刺激微生物对烃的摄取并得以更好的生长。鼠李糖脂可以使营养缺陷型菌株恢复利用有机碳源的能力。当培养基中营养成分较少，而只含有大量的碳源时，加入一定量的糖脂将使细菌的生长速率加快。而且细菌本身产生的糖脂对其自身生长的刺激作用最为显著。但是目前对于细菌利用碳水化合物时起关键作用的细胞组成仍然知之甚少。
项目创新内容
用廉价原料生产鼠李糖脂，利用甘蔗渣、玉米糠等廉价原料通过固态培养法生产鼠李糖脂。
用固态培养法避免泡沫的形成，有利于鼠李糖的生产。
多数生物表面活性剂都是亲油性的，可用经典方法分离，如萃取、沉淀或结晶。本实验中在离心分离除去细胞后，鼠李糖脂用氯仿／甲醇等溶剂萃取细胞或上清液。旋转蒸发除去溶剂后，粗制品结晶方法提纯。
项目技术方案
1、本课题的研究目标：
鼠李糖脂是目前研究较多的一种生物表面活性剂，它不仅具有可与化学表面活性剂相媲美的增溶、乳化、润湿 、发泡等性能 ，而且具有低毒、易于生物降解、对环境友好等特性， 因而在石油开采、医药 日化、环保等领域具有很大的应用潜力。目前， 限制鼠李糖脂在工业上广泛应用的主要因素是其过高的生产成本， 而寻找价格低廉、 来源广泛的原
料作为微生物发酵生产鼠李糖脂的培养基,可有效降低其生产成本。本研究旨在用廉价的甘蔗渣、玉米茎为原料通过固态培养的方法生产鼠李糖脂。
为实现以上目标，将开展以下实验内容：
微生物和培养
固态培养（ssc）所需的肉汤需提前制备，肉汤在40％的甘油，-18℃下贮存培养，后将250ml的摇瓶在30℃，250rpm的轨道摇床中培养知道光密度达到0.6—0.8.
固态法培养鼠李糖脂
在250ml的锥形瓶中放入10g的固态基质，包括甘蔗渣，玉米糠，大米梗，向日葵种子，及其混合物。浸渍液包括KH2P4 K2HPO4 MGSO4.7H2O NH42SO4,浸渍液相当于基板液体吸收液体的能力。
（3)鼠李糖脂的提取
烧瓶中放入100ml的蒸馏水，30摄氏度下在轨道摇床上以200rpm的速度震荡1h后暂停，通过纱布过滤多余的液体手动挤出。后进行离心操作，10min后暂停用氯仿—甲醇混合液提取。
2、研究方法和技术路线
2.1研究方法：固态培养法
2.2技术路线：
2.3其可行性、可靠性论证
（1）固态培养基
固态培养基不仅供给菌体生长繁殖所需要的营养和能量，而且是形成鼠李糖
脂所必须的物质。鼠李糖脂发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等。原料的选择既要考虑到菌体生长繁殖的营养要求，更要考虑到有利于大量积累鼠李糖脂，还要注

意到产品提取容易、原料丰富、价格便宜、发酵周期短等。
(2)PH对培养基的影响
pH值对微生物的生长和代谢产物积累都有很大影响。pH值对微生物的生长繁殖和代谢形成的影响有以下几个方面：
(1)pH值影响酶的活性，当PH值抑制菌体中某些酶的活性时，使菌体的陈代谢受阻。
(2)pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的渗透性，响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响新陈代谢的正常进行
(3)pH值影响培养基某些组成分和中间代谢的离解，从而影响微生物对这些
质的利用；
（3）离心分离
从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的一个步骤就是对其
进行预处理和固液分离，其目的不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒(细胞
碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)，还希望除去部分可溶性杂质从而改变滤液的性
质，以利于后继各步操作。对于胞外产物，应尽可能使生化物质转移到液相中，
这常常可用调节pH到酸性或碱性的方法来达到。在预处理中应采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀释、加热等方法降低粘度，以利于过滤。在离心分离法中，较常用差速离心法分级。而这里主要是以菌体细胞的收
集或除去为目的的固液分离是分级离心操作的一种特殊情况，即为一级分级分离。
（4）鼠李糖脂的分离研究
多数生物表面活性剂都是亲油性的，所以可用经典方法分离，如萃取、沉淀或结晶。离心分离除去细胞后，许多糖脂都可以用乙酸乙酯、乙醚、戊烷、已烷、丁醇、氯仿／甲醇或二氯甲烷／甲醇等溶剂萃取细胞或上清液。旋转蒸发除去溶剂后，粗制品可用柱色谱、制备TLC和结晶方法提纯。本实验采用氯仿—甲醇3：1的比例来提取。
三、项目产品市场与竞争
1、行业及市场概述
生物表面活性剂是一种由微生物合成的、结构多样的表面活性物质，包括糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及中性类脂衍生物等。目前，市场上大部分表面活性剂都是化学合成的，然而，使用化学表面活性剂会产生严重的环境污染问题。生物表面活性剂毒性低、可生物降解，生物相容性好。因此，近年来，环境友好的生物表面活性剂的生产和使用日益受到人们的广泛关注。据估计，到2010年，生物表面活性剂将会占领市场
10％的份额，销售额达两亿美元。许多微生物都能生产生物表面活性剂。目前，国内外研究较多的是由假单胞菌产生的鼠李糖脂，它是一类非常重要的生物表面活性剂，不仅具有乳化、增溶、降低表／界面张力等功能，而且毒性小、易于生物降解，因而在石

油开采、医药、食品、日化及环境保护等许多领域具有极大的应用潜力。目前，限制鼠李糖脂在工业上广泛应用的主要因素是其过高的生产成本，而寻找价格低廉来源广泛的原料作为微生物发酵生产鼠李糖脂的培养基，可有效降低其生产成本。
2、应用推广预测
尽管鼠李糖脂的大规模生产已经实现，为了促进其广泛应用，今后仍需进一步研究以新的可替代廉价原料为底物，降低成本，生产对环境低毒性以及具有很好表面活性的产品。利用工农业废物作为底物是一种环境友好的选择，它不仅能降低治理环境污染的成本，还能增加这些废物的经济价值，具有很好的发展前途。很多廉价的碳源，如植物油生产中的废渣都已被利用，但由于废物的组成变化大，甚至存在干扰生产的物质，因此，使用这些废物为原料在生产方法和分析检。本项目中采用甘蔗渣，玉米糠。大米粳等廉价的原料作为固态培养基，不仅在价格上有较大的优势，对环境的污染也将减小。
在鼠李糖脂生产时，不可避免要出现泡沫。此时一则可以通过添加消泡剂来消除，如油、聚醚等。但这样做可能会引起底物抑制或给下游处理带来困难。二则可以通过机械消泡或改变反应器形式来消除。结果证明，在将通用式反应器改为机械搅拌自吸式后，对于泡沫的消除可以直到很好的作用。但由于液面上的压力大，导致了油不能充分搅拌，发酵液中的油浓度一直保持很低，其最终结果为鼠李糖脂产量很低。本项目采用固态培养法培养，有效的避免了出现泡沫的现象，有利于鼠李糖脂生产。
该项目产品的目标市场

鼠李糖脂这种阴离子活性剂，鼠李糖脂最突出的特性是它的表面活性，具有显著降低水的表面张力，改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。鼠李糖脂表面活性剂能使水的表面张力从72 mN/m降至30 mN/m左右，使油水界面张力从43 mN/m降低至1 mN/m左右。本产品与化学表面活性剂复配后的体系达到10-3-10-4 mN/m超低界面张力值。
鼠李糖脂的另外一个重要特性是它的抗菌性。已经报道有好几种鼠李糖脂混合物具有抗菌和抗真菌的效果。
国外，生物表面活性剂是七十年代后期发展起来的生物工程技术。近年来，生物表面活性剂应用于EOR方面，日益受到人们重视，如德国winter-shullAG公司将生物表面活性剂用于三次采油矿场试验，取得了明显效果，并已申请了多项专利。美国，先后有六大公司应用生物工程技术进行三次采油试验研究工作都见到了理想的效果。
我国，生物表面活性剂研究工作始于八十年代初。“七五”期作为国

家重点科技攻关项目实验研究做了大量的工作。“八五”期间又进行了生物表面活性剂的中试放大，随着科技手段的不断发展，研究水平不断的提高，生物表面活性剂的应用领域不断扩大，同时生物表面活性剂在石油采油的应用中取得了长足的进步。
所以 研究鼠李糖脂的制备具有广阔的市场前景。
四、项目预期成果的经济、社会、环境效益
项目预期能进一步提升鼠李糖脂产品质量及稳定性，有利于生产流程的优化，从而降低生产成本，产生良好的经济效益，而且利用较为廉价的原料甘蔗渣、玉米糠等作为培养基是一种较为环保和低碳的方法。目前国内外还未有将该技术应用于鼠李糖脂的工艺控制，预期成果将有应用及行业推广价值。
同时通过本项目可以进一步丰富和完善表面活性物质的数据库，为将来利用信息化技术控制鼠李糖脂质量与风格奠定坚实基础，促进产业的升级。
研究工作的总体安排及年度进展
总体安排，在半年内完成固态培养鼠李糖脂的工艺试验；用响应曲面的方法优化培养基。年度进展如下：
2009.10-2010.10：
工作内容：（１）微生物的培养。处理过的肉汤接种在固体培养基上培养。（2）用固态培养法生产鼠李糖脂的产量的实验（3）鼠李糖脂的提取。
年度进展：（1）分别采用五种环保原料进行比较实验，分别是甘蔗渣，玉米鲸，大米梗，向日葵种子，及其四种的混合物，（２）初步掌握固态培养法的工艺流程。
2010.10－201.12：
工作内容：（１）对实验的数据进行统计（2）鼠李糖脂的分析（3）用响应曲面的方法优化培养基
年度进展：（1）绘制用假单胞菌生产鼠李糖脂的动力学曲线（2）（2）申报1项中国发明专利。（3）撰写结题验收报告。