液相色谱柱的分类和维护

液相色谱柱的分类和维护

一、色谱柱基本知识

色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10um等，柱效理论值可达5～16万／米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，也要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

1.柱的构造

色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70Kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2-20um(5-10 um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出，柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

2.柱的发展方向

因强调分析速度而发展出短柱，柱长3～10cm，填料粒径2～3um。为提高分析灵敏度，与质谱（MS）联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱（MICROBORE）。细管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；

③样品量少；④能使用长柱达到高分离度；⑤容易控制柱温；⑥易于实现LC－MS联用。

但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1～100ul/min的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因进样量小，要求高灵敏度检测器，电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。

3.柱的填充

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度>20um 时，干法填充制备柱较为合适；颗粒<20um时，湿法填充较为理想。填充方法一般有四种：①高压匀浆法，多有用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters 专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法，柱填充的技术性强，大多数实验室使用己填充好的商品柱。

必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。

二、液相色谱柱规格

色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类

①常规分析柱（常量柱），内径2~5mm,柱长10~30cm；

②窄径柱（narrow bore），内径1~2mm，柱长10~20cm；

③毛细管柱（又称微柱microcolumn），内径0.2~0.5mm；

④半制备柱，内径＞5mm；

⑤实验室制备柱，内径20~40mm，柱长10~30cm；

⑥生产制备柱内径可达几十厘米。

色谱柱了解

1）平均颗粒度，颗粒度分布颗粒度(dp)越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小)柱压越高(渗透性差)

颗粒分布颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)

颗粒形状球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀

无定型：柱床结构不均匀流动相线性速度不均匀，谱带扩展

2）键合相化学

1.影响化合物的分离度：

2.不同键合相对不同种类的化合物分离不同a

3.可能导致色谱的分离机理不同3.如：C18、C8、CN

3）含碳量

1.含碳量越高，k‘值越大（固定相传质效应增加）

2.高含碳量有利于不易保留的化合物的分离水解稳定性好，重现性好有利于极性化合物的拖尾改善

3.低含碳量有利于分析中性及碱性化合物降低溶剂损耗填料的端基封口封口残余硅羟基

减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% - 1%）

不同色谱柱的含碳量如下所示：

4）填料的端基封口封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% - 1%）

5）硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为：k'，生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同，是选择性差异的主要来源，硅胶的杂质含量，重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小，是色谱柱质量好坏的重要标志，填料的稳定性，硅胶填料，pH：2-8，聚合物填料，pH：2-12，pH值小于2时，键合相水解，液相色谱法能否将某一样品完全分离，主要取决于色谱柱的选择性和柱效，这在很大程度上取决于固定相的选择是否适当。

6）色谱柱的规格：内径检测的灵敏度、样品的容量

长度分离度，理论塔板数速度样品的容量检测的灵敏度

7）柱性能评价：购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。

一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。

三.色谱柱的使用和维护注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效，缩短使用寿命甚至损坏.在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱．

①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动．温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时的转动不能过缓（如前所述）．

②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然．

③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱内的杂质．否则反冲会迅速降低柱效．

④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏．有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶＂饱和＂，避免分析柱中的硅胶基质被溶解．

⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱骨需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱．保护柱一般是填有固定相的短柱．保护柱可以而且应该经常更换．

⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75ｍｌ。

下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：

正相硅胶柱以正已烷（或庚烷）｀二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必

须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使 硅胶表面重新活化。

反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动 相不含缓冲液，那么可以省略最后一步用水冲洗。一氯甲烷能洗支残留的非极性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混全溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1％）梯度洗能除去蛋白质污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇 、水依次冲洗。

⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

⑧色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。

通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降。 每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS 柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC 仪上柱子如不经常使用，应每隔4~5天开机冲洗15分钟。

9.柱的保养：当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；

要注意流动相的脱气；

避免使用高粘度的溶剂作为流动相；

进样样品要提纯；

严格控制进样量；

每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；

每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；

若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；

四、正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法 反相色谱法

固定相极性 高～中 中～低

流动相极性 低～中 中～高

组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出

从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 五、1.色谱柱的使用说明

1）、色谱柱使用前注意事项：

色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。

2）、流动相：

流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm 的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。

以常规硅胶为基质的键合相填料通常的pH 值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，pH 值适用范围为2.0-10.0。当必须要在pH 值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使液相色谱柱填 料柱 管颗粒表面性质颗粒度长 度内 径材 料化学性质∶ k ， 分辨率机械因素∶N

寿命，柱效，速度，溶剂消耗

用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。

3）、样品：

样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。

2、色谱柱的保存

1）、反相色谱柱每天实验后的保养：

使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。

2）、长期保存色谱柱：

如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。

3、色谱柱的再生

因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。

1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。

2）正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：

1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

2）色谱柱头的填料被样品污染；

3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解；

解决办法如下

1）、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

3）如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

4）如果因pH值使用不当，很难恢复。

色谱法分类

一、胶囊色谱(Micellar Chromatography,MC) 又称拟相液相色谱或假相液相色谱(Pseudophase LC)，是一种新型的液相色谱技术。特点是应用含有高于临界胶囊浓度的表面活性剂溶液作为流动相。所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(Critical MicelleConcentration,CMC)时形成的分子聚合体。通常每只胶囊由n个（一般为25～160个）表面活性剂单体分子组成，其形状为球形或椭圆球形。在CMC值以上的一个较大浓度范围内，胶囊溶液的某些物理性质（如表面张力、电导等等）以及胶囊本身的大小是不变的。构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。通常有正相与反相两种胶囊溶液。前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊；后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同，并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析，是一种安全、无毒、经济的优越技术。 （一）原理：胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenous system)。在胶囊色谱中，分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用；同时定量地指出分离组分的容量因子k’的倒数值与胶囊浓度成正比，一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。 （二）方法特点：与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系，而常规流动相是一种均相体系。特点：1、高度的选择性：因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用，只要通过流动相中胶囊浓度的改变，就可使分离选择性获得改善和提高。此外，通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。 2、便于梯度洗脱：由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时，溶液中仅胶囊的浓度发生改变，而表面活性剂单体分子的浓度不变，不影响流动相与固定相的平衡过程，因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间，并减少了流动相的消耗，适用于常规。 3、提高检测灵敏度：胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度，从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。 4、因分离组分不易分出，故缺点是柱效低且不适于制备分离。 （三）常用表面活性剂：常用的阳离子表面活性剂主要有：溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyltrimethylammoniumbromideor chloride,CTMAD或CTMAC)；阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS)；非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。 二、手性分离色谱(ChiralSeparationChromatography,CSC) 是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异，有必要对某些手性药物进行对映体的纯度检查。 （一）原理和方法：对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外，其理化性质是完全相同的，因而难以分离。传统方法（分步结晶法、酶消化法等）有很大局限性，特别是难以进行微量分离和测定。60年代前后，TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分不多的化合物，且需要较复杂的样品处理步骤，制备分离也难以进行。80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。 HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。

4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省

怎样选择色谱柱

怎样选择色谱柱 现代高效液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择。但 是色谱填料的选择范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团 (NH2,APS)和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性较强，因此，分离的次序是依据样品 中的各组份的极性大小，即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯仿（Chloroform）,二氯甲烷（Methylene Chloride）等。 2、反相色谱 反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。 反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有 更强的保留。 常用的反相填料有C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（Phenyl）等。 二、聚合物填料

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要优点是在PH值为1～ 14均可使用。 相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白 质等样品的分离非常有效。 现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。 三、其他无机填料 其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的 用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基 键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基 键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由 于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC， 氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。 但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用， 新型氧化锆填料也可用于HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应 用PH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究，加之面临的实验难 度，其重要用途与优势尚在进行中。

日立Chromaster液相色谱仪操作、清洁、维护、保养规程资料

文件目录 一、目的 (2) 二、范围 (2) 三、责任者 (2) 四、内容 (2) 五、修订历史 (2) 六、相关记录 (12)

一、目的 1、建立一个日立Chromaster液相色谱仪操作、清洁、维护、保养规程。 二、范围 1、日立Chromaster液相色谱仪。 三、责任者 1、中心化验室主任，操作者。 四、内容 1、仪器型号及组成： 2、工作环境 3、操作规程 3.1使用前准备 a）每次开机前先检查电源连接情况,确保电源正确的连接。 b）每次开机前检验流动相,以保证足够量的流动相。 3.2 开机确认电源连接正确后，打开各使用模块电源。 3.3打开与设备连接的电脑，在电脑桌面双击图标，使操作系统与设备联机，进入登录窗口。 3.4 第一次使用仪器时应对仪器进行配置。选择配置，进入仪器配置界面 3.4.1 点击“增加”，选择连接的仪器

3.4.2 打开仪器，自动检测配置的仪器模块

3.4.3 确认自动检测所有模块，确认泵的信息、自动进样器的信息、柱温箱信息（选择control off at shutdown）、检测器信息（选择lamp off at shutdown） 3.4.4 配置仪器，点击向右箭头，命名仪器名称。 3.5 输入用户名、密码，选择创建新工程登录。 3.6 仪器准备 3.6.1 排空打开设备监视器，打开排空阀，设流速为5，流量100%，点击“清洗”，分别将四条管路排气泡，结束之后关闭排空阀。 3.6.2 自动进样器清洗点击“清洗”，依次对柱塞、注射器进行清洗 3.7方法设置 点击“新建方法”，在“方法”下选择“事件表”按照检测需要对自动进样器、LC梯度、液相色谱控制、测量、采集、恒温器、积分、计算进行设置，设置完成后点击“发送方法” 3.8 基线方法发送仪器运行稳定之后，点击“数据采集”查看基线 3.9 序列设置及运行点击“序列”，分别对样品起始位置“SV”、结束位置“EV”、样品

液相色谱柱的选择

液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合 -CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸

常见液相色谱柱性能比较

常见液相色谱柱性能比较 一、高性能色谱柱特点：柱效高，价格高，通用性好，使用寿命长，pH范围宽 1、Waters公司Xbridge 2005年waters公司推出，杂化颗粒柱。 优点：pH 1-12,在高pH状态下，没有能与此色谱柱匹敌的，目前市场的宽pH色谱柱在高pH的状态下（9-12）普遍寿命很短，如Gemini，资生堂公司Capcell，YMCPro-C18，包括waters 的第一代杂化柱Xterra都是寿命不长，Zorbax Extend更是不堪。柱效与一流的硅胶柱相当，甚至有过之无不及，杂化颗粒柱和聚合物色谱柱的问题在于柱效，Xterra和常见的PSDVB的色谱柱都有不错的pH范围，但是柱效低的问题无法解决，这是聚合物填料一般比较软且不耐压的原因造成。在如此宽的pH范围，最大的好处是可以在化合物的保留平台区去开发方法 （pH1-3,pH9-12），这样能得到更稳定更容易重现的方法，对酸性，中性，尤其是碱性化合物都能得到理想的峰形。 注：Waters UPLC色谱柱与Xbridge采用同类型填料，只是颗粒度是1.7um，所以不再重复。缺点：价格高，平均每支￥7000多的，不是大多数中国客户可以接受的。 2、MerckChromolith整体化色谱柱 Merck公司2001年推出。 优点：高流速、低压力，可以快速分析样品，因为压力低，所以可以串联色谱柱以获得更高的柱效而不用担心色谱柱耐压问题，低压力是因为硅胶棒的大量中孔的存在，中孔的存在也让这支色谱柱不怕堵，在处理比较脏的样品的时候会优势很大（如中药），实际的寿命也因此延长。这个色谱柱最大的特点是柱效高出峰时间快，特别适合之前分析时间超长的实验条件，目前很好的例子就是人参的指纹图谱，因为成分复杂，之前出峰要2个小时，现在用整体化色谱柱30min 就可以分析完了（已有报导），且不影响柱效，类似于UPLC，但不像UPLC那么容易堵。 缺点：规格单一，单价比较高，单价￥7000左右，所以通过串联获得更高柱效的方式显得比较奢侈。 3、Phenomenex公司Gemini ，采用硅胶球聚合物包被技术。pH范围1-12。 优点：因为聚合物涂层抑制了碱性溶液水解硅胶，所以可以承受一定的碱性条件，由于是硅胶球颗粒，所以柱效不错，比Xterra或者PSDVB这类色谱柱柱效好。单价比较低，￥3000以内。 缺点：聚合物涂层稳定性比较差，所以当涂层损失时，色谱柱会很坏被碱性溶液溶解，这也是其寿命远不及Xbridge的原因。另外涂层损失也会影响结果重现性。 4、资生堂Capcell ，采用硅胶球聚合物包被技术。pH范围1-10。 类似于Gemini同样的技术，只是参数指标比phenomenex低调。 单价偏高，￥5000以内。 5、Agilent ZorbaxExtend，采用双配位键和相技术。pH2-10 优点：不详 缺点：在使用高pH时，基本上都会介绍Extend，但是实测数据说明该款色谱柱的耐高pH 能力较差。 二、高纯硅胶柱特点：柱效高，峰形好，适用广泛，价格合适，为各色谱柱公司目前主流色谱柱 1、Merck的Purosphere STAR ，为Merck公司1999年推出，pH 1.5-10.5，通用性好，柱效高；缺点：市场推广较差，知名度比较低， 2、Phenomenex的Luna ，Phenomenex公司的主打色谱柱，pH1.5-10，通用性好，在进口色谱柱市场上占有一定份额；缺点：装填相对松散，柱头填料容易塌陷

液相色谱仪操作规程

1 目的 规Waters e2695液相色谱仪的操作规程，正确使用本仪器，保证检测工作顺利进行以及操作人员、设备、周围环境的安全。 2 适用围 本指导书适用于Waters e2695液相色谱仪、2489紫外检测器及随机工作站。 3 职责 3.1操作人员按本规程操作仪器，对仪器进行日常维护，作使用登记。 3.2保管人员负责监督仪器操作是否符合规程，对仪器进行定期维护，保养。 3.3科室负责人负责对仪器综合管理。 4 仪器性能指标 4.1.Alliance e2695系统 4.1.1 泵/溶剂管理系统：相互独立控制的线性双柱塞驱动装置,双压力传感器反馈回路, 无脉动, 无需混合器和阻尼器。 4.1.1.1溶剂数：4 4.1.1.2流速围：0.001--10.000ml/min, 以0.001ml为增量 4.1.1.3流速精度：±0.075%RSD 4.1.1.4流速准确度：±1.0%RSD 4.1.1.5操作压力：0-6000psi(0-410bar) ，可设上,下限 4.1.1.6混合围：0.0~100.0%，以1% 增量 4.1.1.7梯度准确度：±0.5%，不随反压变化 4.1.1.8梯度精度：±0.15%，不随反压变化 4.1.1.9压缩补偿：自动，连续 4.1.1.10梯度曲线：多种梯度曲线: 线性, 凸线和凹线等11种 4.1.1.11系统体积：< 650μL, 不随反压变化

4.1.2 自动进样器/样品管理系统： 4.1.2.1样品盘数：120位,分5个样品盘,每个样品盘可放置24个2ml样品瓶 4.1.2.2进样次数：每个样品可进样1到99次 4.1.2.3进样精度：<0.5%RSD 4.1.2.4样品污染度：<0.1% 4.1.2.5进样准确度：±1 uL 4.1.2.6进样体积：0.1 to 100 uL 4.1.2.7进样线性度：> 0.999 coefficient of deviation 4.1.3 在线柱塞清洗装置： 可在线清洗柱塞杆，可防止因缓冲盐溶液结晶而造成的堵塞，延长密封圈的使用寿命。 4.1.4 在线脱气装置： 4.1.5柱温箱： 4.1. 5.1温度设定围：室温至65℃ 4.1. 5.2温度稳定性：±0.15℃ 4.1. 5.3柱容量：4根7.8X300柱 4.2检测器： 4.2.1 2489双波长紫外检测器 双通道紫外检测器，可进行双波长同时测定；最新专利梯形狭缝池设计，确保低噪音，高灵敏度，宽线性围；Maxplot,Ratioplot优化灵敏度，检测共流出物杂质，可作简单峰纯度鉴定。 4.2.1.1波长围：190-700nm 4.2.1.2 灯：氘灯，具有灯优化软件,可以延长灯的使用寿命，可编程控制灯的开关 4.2.1.3波长准确度：±1.0nm 4.2.1.4波长重现性：±0.1nm 4.2.1.5光谱带宽：5nm 4.2.1.6噪音：5 X 10-6AU 4.2.1.7漂移：≤1 X 10-4AU/hr

Agilent-1260LC液相色谱仪使用、维护保养规程

Agilent 1260-LC液相色谱仪使用、维护 操作规程 目录 一、目的 (2) 二、适用范围 (2) 三、内容 (2) 四、附件 (18) 五、变更历史 (18)

一、目的 明确Agilent 1260 LC型液相色谱仪硬件使用、维护保养操作方法，使质量部检验人员有章可循。 二、适用范围 本规程适用于公司Agilent 1260-LC型液相色谱仪使用、维护保养操作。 三、内容 1.制定依据 《Agilent 1260 LC system Operating Manual》 《Agilent OpenLAB Control Operating Manual》 2.工作原理： 2.1.高效液相色谱法是用高压输液泵，将具有不同特性的单一溶液或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相，用泵压入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入色谱柱内，在色谱柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由色谱工作站进行记录处理。利用色谱图色谱峰面积或峰高大小可对待测样品进行定性定量分析。 Agilent 1260 LC型液相色谱仪主要由G1329B四元泵、G1329B自动控温自动进样器、G1316柱温箱、G4212B二极管阵列检测器和Open LAB色谱工作站等部件组成。 3.基本操作步骤 3.1.开机准备 3.1.1.启动计算机：打开计算机电源，登陆windows操作系统。 3.1.2.启动工作站：打开Agilent 1260LC各模块电源。待Agilent 1260LC 各模块自检完成后(各模块右上角指示 灯为黄色或者无色)，点击屏幕左下角 “开始”，选择“所有程序”，选 择”Agilent Technologies”选择“Open LAB”，选择OpenLAB Control,或单击 桌面图标则会进入到上图的界面。上面步骤如果已经配置过，则不需要

常用高效液相色谱柱SOP

常用高效液相色谱柱SOP 1 目的： 色谱柱的使用和保养：液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 建立高效液相色谱柱日常维护与保养规程，保证能正常使用。 2 适用范围： 本规程适用高效液相色谱柱的维护与保养。 3 责任人： 液相色谱柱使用者。 4 液相色谱柱的安装： 4.1 液相色谱柱的结构： 4.1.1 液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。 柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用于柱填料的装填。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。 密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。 4.1.2柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合-CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。 常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3-10 μm之间。 4.2色谱柱的安装： 4.2.1拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 4.2.2拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 4.2.3 按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57 mm、内径为0.1-0.3 mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。 5 液相色谱柱的使用： 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 5.1样品的前处理： 5.1.1最好使用流动相溶解样品。 5.1.2使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 5.1.3使用0.45 μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 5.2 流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： 5.2.1流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

色谱法的分类及其原理

色谱法的分类及其原理 （一）按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 （二）按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) ：柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法（paper chromatography）：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) ：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 （三）按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：

1、吸附色谱法：利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。 2、分配色谱法：利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法：相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，

液相色谱柱的选择和介绍

液相色谱分离速度提高及选择性优化
安捷伦液相色谱柱介绍与选择
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How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

液相色谱方法开发中如何选择色谱柱 液相色谱方法开发中如何选择色谱柱？
1.根据样品特性选择分离模式 2 色谱柱的适应性和选择性 2.色谱柱的适应性和选择性 3.色谱柱规格的选择
我要一根ODS柱
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How to fast your LC separation Agilent LC colmns 2008.10.23 Dalian

HPLC模式选择
溶于有机溶剂
硅胶的正相色谱 溶于正己烷 用不同键合相的正相色谱
溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水
用不同键合相的反相色谱 用不同键合相的反相色谱
分子量<2,000
溶于四氢呋喃
低分子凝胶渗透色谱 用不同键合相的反相色谱
溶于水
非离子化
抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相色谱
样品
离子化 硅胶基质的反相色谱 离子交换色谱 溶于有机溶剂 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱 溶于水 大孔填料的离子交换色谱 用大孔填料的反相色谱
分子量>2,000
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分离模式的选择实例-三聚氰胺分析
三聚氰胺是强极性，弱碱性化合物（pKa=8），微溶于水。
模式一：离子对键合相的反相色谱 对应国标方法GB/T 22388-2008第一法（反相离子对方法） 流动相：离子对试剂（辛烷磺酸钠）溶液：乙腈 ＝ 92:8 色谱柱：ZORBAX SB-C8 4.6x250mm,5um 模式二：硅胶基质的反相色谱（HILIC） 对应安捷伦开发的HILIC模式方法 流动相： 10mM乙酸铵：ACN=11：89 色谱柱：Zorbax Rx-Sil, Rx-Sil 2.1 2 1×150mm, 150mm 5um
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模式三：离子交换色谱 对应安捷伦开发的离子交换方法 流动相：50mM 甲酸铵(pH3.0):乙腈=15:85 色谱柱： ZORBAX 300SCX 4 4.6 6×150mm, 150mm 5um
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液相色谱仪色谱柱使用及维护

液相色谱仪色谱柱使用及 维护 Prepared on 22 November 2020

液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将"子弹头"预柱放入卡套片内

5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会

(完整word版)高效液相色谱试题

高效液相色谱试题 部门姓名得分 一、选择题 1.在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（） A.分配色谱法B排阻色谱法 C.离子交换色谱法 D.吸附色谱法 2.在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。 A. 检测器 B. 记录器 C.色谱柱 D. 进样器 3.液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？（） A.0.5μm B.0.45μm C.0.6μm D.0.55μm 4. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用( ) A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱 5. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（）检测器不能使用梯度洗脱。 A. 紫外检测器 B. 荧光检测器 C. 蒸发光散射检测器 D. 示差折光检测器 7. 在高效液相色谱中, 色谱柱的长度一般在( )范围内。 A.10-30cm B.20-50cm C.1-2cm D.2-5cm 8. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.Ｕ形柱 D.螺旋形柱 9. 纸色谱的分离原理, 与下列哪种方法相似？( ) A.毛细管扩散作用 B.萃取分离 C.液-液离子交换 D.液-固吸附 10.高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（） A.恒温箱 B.进样装置 C.程序升温 D.梯度淋洗装置 二、填空题

1. 高效液相色谱仪一般由、、、 、五部分组成。 2. 流动相使用前必须先。 3. 系统适用性试验包括、、、四个指标。 4.梯度洗脱有两种实现方式：、。 三、名词解释 1. 分离度： 2. 保留时间： 四、简答题 1.在液相色谱中，色谱柱能在室温下工作，不需恒温的原因是什么？ 2.简述提高分离度的几种途径？

高效液相色谱习题及参考答案.

高效液相色谱习题及参考答案 一、单项选择题 1.在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（）。 A、分配色谱法 B、排阻色谱法 C、离子交换色谱法 D、吸附色谱法2.在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。 A、检测器 B、记录器 C、色谱柱 D、进样器 3.液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？ A、0.5μm B、0.45μm C、0.6μm D、0.55μm 4.在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？ A、改变流动相的种类或柱子 B、改变固定相的种类或柱长 C、改变固定相的种类和流动相的种类 D、改变填料的粒度和柱长 5.一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为（） A、甲醇/水（83/17） B、甲醇/水（57/43） C、正庚烷/异丙醇（93/7） D、乙腈/水（1.5/98.5） 6.下列用于高效液相色谱的检测器，（）检测器不能使用梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器 7.在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（）范围内。 A、10～30cm B、20～50m C、1～2m D、2～5m 8.在液相色谱中,某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（） A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相和固定相 D、组分与组分

9.在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行（）的操作 A、改变柱长 B、改变填料粒度 C、改变流动相或固定相种类 D、改变流动相的流速 10.液相色谱中通用型检测器是（） A、紫外吸收检测器 B、示差折光检测器 C、热导池检测器 D、氢焰检测器 11.在环保分析中，常常要监测水中多环芳烃，如用高效液相色谱分析，应选用下述哪种检波器 A、荧光检测器 B、示差折光检测器 C、电导检测器 D、紫外吸收检测器 12.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（） A、提高柱温 B、降低板高 C、降低流动相流速 D、减小填料粒度 13.在液相色谱中，不会显著影响分离效果的是（） A、改变固定相种类 B、改变流动相流速 C、改变流动相配比 D、改变流动相种类 14.不是高液相色谱仪中的检测器是（） A、紫外吸收检测器 B、红外检测器 C、差示折光检测 D、电导检测器 15.高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（） A、恒温箱 B、进样装置 C、程序升温 D、梯度淋洗装置 16.在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件是（） A、贮液器 B、输液泵 C、检测器 D、温控装置 17.高效液相色谱、原子吸收分析用标准溶液的配制一般使用（）水

液相色谱仪色谱柱使用及维护

液相色谱仪色谱柱使用 及维护 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！------ 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1．将卡套架套入柱芯 2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4．将"子弹头"预柱放入卡套片内

5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7．连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1．将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2．将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3．一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4．用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5．将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6．照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7．柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8．压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。

高效液相色谱柱的选择

液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障的排除 液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2~8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。（下图是Acclaim极性封尾C16柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化合物谱图的比较） 二、液相色谱柱的使用 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。 1、样品的前处理 a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长期留在柱中)。 b、流动相与样品不产生化学反应 c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，