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离子交换柱交换层析法分离氨基酸知识讲解

离子交换柱交换层析法分离氨基酸

离子交换柱层析法分离氨基酸

一、实验原理

离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力(静电引力)而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂,流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。

树脂(惰性支持物)上结合了阳离子或阴离子后,可与阴离子或阳离子结合,改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同,故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出,达到分离的目的。带电荷量少,与交换剂亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量大,与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。

本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂,分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下,Asp和Lys的带电情况不同,与磺酸集团的亲和力不同,因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后,测定吸光度,从而得到洗脱曲线。

二、实验器材

实验仪器:层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂:Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液(pH5.3)、

0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品(0.005mol/L的Asp和Lys,用

0.02mol/L的HCl配制)

三、实验操作记录

1、树脂的处理

干树脂经蒸馏水膨胀,倾去细小颗粒,然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗,每次浸2h,并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH浸半小时(转型),用蒸馏水洗至中性。

2、装柱前的准备

选择直径1cm,长度15~20cm的层析柱,观察柱底端滤膜是否完好,分别用流水和蒸馏水冲洗干净。

将层析柱垂直装在铁架台上,柱进水口和出水口装上橡皮管,关闭柱底端出口,在柱内注入少许(约1cm高)的洗脱液,打开出水口,排净管内空气后关闭出水口。

3、装柱

向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液,用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状,然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快,以免产生泡沫和气泡。

待树脂在柱底部有明显沉积(约1cm高)后,缓慢打开出口(或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液),继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续,均匀,无文格、无气泡,表面平整,液面不得低于树脂表面,否则要重新装柱。

4、平衡

层析柱装好后,接上已调好流速的恒流泵,用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡,直到流出液的pH与洗脱液pH相同(约需2~3倍柱床体积)。5、加样