色谱分析法
在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制型离子色谱法.
但是如果选用低电导的流动相(如1×10-4~ 5 ×10-4M的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐),则由于背景电导较低,不干扰样品的检测,这时候不必加抑制柱,只使用分析柱,称为非抑制型离子色谱法. 例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相,钠离子的干扰非常严重,这时可在分析柱后加一根抑制柱,其中装填高容量H+型阳离子交换树脂,通过离子交换,使NaOH转化为电导值很小的H2O,从而消除了背景电导的影响.
何为化学抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理
薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属于固－液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。
薄层色谱法（TLC）是将样品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，利用不同组分迁移的速度不同，使样品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
固定相：吸附剂流动相：展开剂分离原理：吸附、解吸附
特点：设备简单、操作方便专属性强、展开剂灵活多变、
色谱图直观和容易辨认具分离和分析双重功能
“三高、一快、一广”高灵敏度、高选择性、高效能
分析速度快应用广
分类（根据作为固定相的支持物不同）：
?薄层吸附层析（吸附剂）
?薄层分配层析（纤维素）
?薄层离子交换层析（离子交换剂）
?薄层凝胶层析（分子筛凝胶）
一般实验室中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。
在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即比移值（Rf）是化合物的物理常数，其大小与化合物的极性有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。
可用于精制样品，适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐
步消失来判断反应是否完成。
正己烷环己烷四氯化碳甲苯氯仿正丁醇乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇水（极性依次增强）薄层板的制备点样展开显色计算比移值
1定性鉴别化学上经典的定性鉴别，例如经典的有机定性分析或经典的毒物分析，是利用各种化合物的溶解度不同和所含功能基的不同，用溶剂提取或用试剂处理，把它们分组或分为单一组分，然后作试管反应或点滴反应(颜色反应)，或根据它们衍生物的理化性质进行定性鉴别。这种方法的缺点是样品用量较大，分离手续麻烦,分析时间较长(几小时或几时个小时)，并可能有杂质干扰
2药品的质量控制和杂质检查薄层检查也是药品质量控制和杂质检查的一种有
效方法，有时甚至比一般方法更有效。一些国家的药典和药品规范已经采用。
方法是把一定量得样品溶液点在薄层上，用展开剂展开并显色，同时用纯品作对照,如果样品只显示出纯品值一致的一个斑点，则表示含有杂质。进一步可用薄层作杂质的限量检查。
3化学反应进程的控制反应副产物的检出以及中间体的分析，在化学反应进行到一定
时间或反应终了时，把反应液取出作薄层分析，可以知道还剩下多少原料药未起作用。
方法是把反应液或其有机溶剂提取液点在薄层上，同时点原料作参比对照，看薄层上是否出现原料药斑点。还可以用薄层检查反应副产物。如果化学反应分步进行，则每一步反应的中间体的质量和产率也都可用薄层进行定性和定量。
4 柱色谱法分离条件的探索柱色谱法的实验条件，例如选用什么吸附剂和洗脱剂较好各
个组分按什么顺序从柱中洗脱出来，每一分洗脱液中是含单一组分或就含几种没有分开的组分等，都可以在薄层上进行探索和检验。薄层上所有的展开剂虽不完全照搬柱色谱法上，但仍有参考价值。
萃取色谱的概念
萃取色谱法是液相色谱的一种特殊形式。是一种将溶剂萃取的高选择性和色谱分离的高效性相结合而成的分离技术。
萃取色谱是将萃取剂浸渍或键合在支持体上作为固定相，以无机酸、碱或盐的水溶液作为流动相，使待分离物质经过在两相中连续多次分配而分离。
选择适宜的萃取剂是实现富集分离的关键。选择萃取剂时一般应考虑:
?1萃取剂对待提取(或浓集)的痕量组分有足够大的萃取能力,分配系数要大,而对
共存的基体或杂质成分的萃取能力应尽可能小。
? 2 萃取剂对支持体的浸润性能好,可以牢固地吸附在支持体上,不易流失。
? 3 萃取剂应难溶于水,它与待分离组分形成的萃取配合物
必须易于被固定相吸附而不溶于流动相,以保持色谱柱有较长的使用寿命。
? 4 萃取剂应具有良好的化学稳定性,若用于核化学体系,还要考虑辐射性能。
萃取色谱中常用的支持体主要分为无机吸附剂、经硅烷化的憎水性吸附剂和有
机高分子聚合物三类。常用的是有机高分子聚合物—萃淋树脂，通常是将萃取剂与苯乙烯、二乙烯苯单体混合共聚而成。在合成萃淋树脂的过程中，可根据萃取剂性质的差异，通过改变引发剂、分散剂等改变共聚物的表面积、孔隙度，以得到性能良好的萃淋树脂。
萃取色谱法中应用的萃淋树脂是将萃取剂担载在固体树脂类物质上而制得的一类分离剂。按其制法可分为两类: 一种是浸渍型,即将萃取剂以Van der waals引力吸附的形式,通过浸渍的方法包藏荷载在多孔树脂内部孔隙中。
另一种则是将萃取剂与聚合物单体混合,经聚合物固化后使萃取剂包埋于聚合物的网格中。
原理：萃取色谱的保留机制可分为离子交换机制和分配机制两种。
（1）涂渍固定相支持体的性质如同离子交换树脂，支持体上活性基团的多少因固定相的负载量不同而已
（2）支持体上只是涂了一薄层有机萃取剂，服从于简单的表面分配定理，K=[M]O / [M]W 特点（1）萃取色谱保留了许多溶剂萃取法的性质和优点（2）将萃取剂固定在惰性支持体上，其用量比溶剂萃取少，一般不会乳化，而且色谱柱可反复使用（3）萃取色谱相当于级数很高的多次萃取，同时分离效率高（4）操作简单，易于实现自动化
灌注色谱: 当膜的孔径达到0.5μm时，只要两边有微小的压力差，便可引发孔内的对流传质。如果在色谱填料颗粒上有这种横穿粒子的特大的对流传质孔，被分离溶质便会随流动相一道迅速接近介质的内孔表面，而不是靠浓度梯度进行扩散传质，因而能加快传质过程。基于这一原理，Afeyan等人于1989年申请了8-10μm的苯乙烯-二乙烯基苯共聚树脂介质的美国专利，并把用这种物质分离生物大分子的过程称为灌注色谱(Perfusion Chromatography)。
传统的液相色谱介质(载体) , 流动相仅流经介质颗粒间隙, 介质颗粒内部则籍扩散作用(diffusion) 进行；扩散作用限制了样品流径固定相(介质颗粒) 的反应速度
灌注色谱的基本特征其颗粒内部分布着两种结构的孔隙，一种是贯穿整个颗粒的特大孔，孔径为600-800nm，被称为穿透孔或对流孔；另一种是连接这些特大孔的较小一些的大孔，孔径为50-150nm，孔深一般不超过1μm，被称为连接孔或扩散孔
这种介质的一个突出特点是孔内“停滞流动相的传质阻力”大大减小。这是因为颗粒内的传质过程主要靠穿透孔内的对流传递，生物大分子溶质能随流动相的液流迅速达到孔内的活性表面。虽然在穿透孔之间还存在若干扩散孔，它们不能形成快速对流传质，但这种孔的深度一般不超过1μm，扩散程很短，不会造成明显的传质阻力，而且扩散孔的存在恰恰提供了较大的表面积和柱容量
解决了传统色谱方法中流速、分辨率和柱容量的三角关系。就是说在流速增加的情况下，柱容量和分辨率都不会降低，而且压力也不会升高，使生物大分子的快速分离提纯具有可行性
优点：1.分离速度比传统层析快10-100倍，但分辨率和容量不变；
2.贯穿孔和扩散孔的极短的扩散路线的迅速传质使得分辨率和容量不依赖于流速；
3.分离时间的减少，减少了分子在柱子中的停留时间，无论是分析色谱还是制备色谱，运行时得到的蛋白质质量、产量和产率都有所提高；
4.由于分离时间减少和灌注层析的高容量，降低了大规模工艺过程的成本；
5.灌注层析的原理只是增强了传质过程的动力学，没有改变分离原理，所以可以在其他层析技术中运用到。
灌注色谱的应用范围：
离子对色谱法是用正相或反相色谱柱分离离子型化合物和可解化合物的方法（counterion）与离子化的样品组分形成离子对，这种离子对同中性或非极性分子一样，可采用分配色谱的方法进行分离。分为正相离子对色谱和反相离子对色谱。
反相离子对色谱法原理把离子对试剂添加到极性流动相中，被分析的样品离子在流动相中与离子对试剂（反离子）生成不带电的中性离子对，从而增加了样品离子在非极性固定相中的溶解度，是分离系数增加，改善分离效果
在阐述离子对色谱的保留机制时，有多种模型理论，主要理论有离子对模型和动态离子交换模型，本书介绍离子对模型。离子对模型认为，在反相离子对色谱中，固定相为疏水性的键合相（如ODS），被分离的离子和反离子同时存在于强机型的流动相中两者生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，可采用分配色谱的方法进行分离。
当中性离子对在固定相和流动相之间分配平衡之后，分配系数与离子对试剂碳链长度及被分离组分极性等因素有关。离子对试剂碳链长度越长，分配系数越大，保留时间越长。
对于碱性化合物（B），一般用各种烷基磺酸盐（R—SO3Na）作离子对试剂，流动相和固定相之间的反应如图11—1 所示。
对于酸性化合物（RCOOH），一般用各种季铵盐，如四丁基铵类（TBA+X）,作离子对试剂，流动相和固定相之间的反应如图11-2所示。
反相离子对色谱的固定相可分为四类（见表6-2-23），即：
①C8或C18反相键合相；
②ODS反相键合相，以十二烷基磺酸钠作对离子，俗称“皂色谱”；
③硅胶机械涂渍正戊醇反相液液色谱固定相；
④硅胶机械涂渍液体离子交换剂，其自身也兼作对离子。
流动相皆为以水作主体的缓冲溶液，或水-甲醇（乙腈、二氯甲烷等）混合溶剂，可分析羧酸、磺酸、胺类、酚类、药物、染料等。常用的对离子为四丁基铵正离子(C4H9）4N+、十六烷基三甲基铵正离子（C16H33）N+（CH3）3及高氯酸根负离子ClO4-和十二烷基磺酸负离子
（C12H33）SO3-" 等。
影响离子对色谱分离选择性的因素
1. 溶剂极性的影响
在正相离子对色谱中，丁醇或戊醇与CH2Cl2、CH3Cl、正己烷构成的混合溶剂是常用的流动相。混合溶剂的极性愈高，溶剂的洗脱强度就愈大，会使溶质的k'减小。
在反相离子对色谱中，常使用水- 甲醇、水- 乙腈混合溶剂作流动相。当增加甲醇、乙腈含量，降低水的体积比时，会使流动相的洗脱强度增大，使溶质的k'减小。
在离子对色谱中，溶剂的极性并不严格遵循极性参数P'的数值，这是因为溶剂洗脱强度是溶剂溶解离子和离子对的能力的函数，而溶剂极性参数P'是溶解极性非离子型化合物能力的函数。因此可以认为，在离子对色谱中，流动相的洗脱强度是极性参数P'和溶剂的介电常数e 的函数，可用P'+0.25e 表示每种溶剂在离子对色谱中的洗脱强度。
2. 离子强度的影响
在反相离子对色谱中，增加含水流动相的离子强度，会使溶质的k'值降低；而在正相离子对色谱中，增加离子强度，会使溶质的k'值增大，离子强度每增加一倍，k'值增大2-3 倍。
3.pH 值的影响
在离子对色谱中，改变流动相的pH值是改善分离选择性的很有效的方法。在反相离子对色谱中，当pH值接近7时，溶质的k'值最大，此时样品分子完全电离，最容易形成离子对。当流动相的pH值降低时，样品阴离子X-开始形成不离解的酸HX，从而导致固定相中样品离子对的减少。因此对阴离子样品来讲，其k'值随体系的pH值降低而减小。在正相离子对色谱中，k'值随体系pH值的减小而增大。在以硅胶为载体的离子对色谱中，使用的最适宜pH值为2-7,4，pH 值超过& 会使硅胶溶解。
对不同类型的样品，在离子对色谱测定中适用的pH值，见表6-2-24
4. 温度的影响
对机械涂渍型固定相，使用时色谱柱应恒温，以保证柱的稳定性。
在离子对色谱中使用的流动相粘度都较大，提高柱温利于降低流动相的粘度，提高柱效。此外，在离子对色谱中，柱温的变化，对分离选择性的调节比其他类型色谱要大，它是控制分离选择性的一个重要变量。
5. 离子对试剂的性质和浓度的影响
分析有机碱的常用离子对试剂为高氯酸盐和烷基磺酸盐。分析有机酸的常用离子对试剂为叔胺盐和季铵盐。
在离子对色谱法中，测定无紫外吸收的样品时，可采用间接光度法，即使用具有紫外
吸收的离子对试剂作为检测的探针，常用的为含有苯环和吡啶环的胺盐或磺酸盐。
离子色谱法（IC）是以离子型化合物为分析对象的液相色谱法。与普通液相色谱法的不同之处是它通常使用离子交换剂固定相和电导检测器
离子交换剂是离子色谱中应用最广泛的固定相，它们是一种具有可交换离子的聚合电解质，能参与溶液中离子的交换作用而不改变本身一般物理特性。
有机聚合物离子交换剂硅胶基质键合型离子交换剂
硅胶基质键合型离子交换剂螯合树脂和包覆型离子交换剂
交联度（所谓交联度，即指聚合物中交联剂二乙烯基苯的质量百分比）是苯乙烯树脂的一个重要参数，交联度的大小决定树脂的孔结构。增加交联度，树脂的孔隙度会降低，树脂的耐压强度会随之增加，溶胀效应相应减小，但同时也会降低树脂颗粒的渗透性。通常使用的离子交换树脂的交联度在4%~12％。
衡量离子交换树脂性能的另一个参数是交换容量，它是指1g干树脂所能交换的离子的毫摩尔数。离子交换树脂按交换容量的不同可分为高容量交换树脂和低容量交换树脂两大类。所谓交换容量是指单位质量或单位体积离子交换剂所交换某类离子的毫克当量数，由离子交换剂内含有的离子交换功能基的浓度来确定。高容量阳离子交换剂的容量大约为每克干树脂5mmol。
HPIC 的分离机理主要是离子交换，是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换，依据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离。
影响离子保留的因素流动相流速分离柱长度柱温固定相性质流动相pH 流动相种类与浓度
离子色谱中用分配系数（分配系数K0表示在固定相和流动相中的浓度比）来描述离子的色谱保留行为。不同离子分配系数的差异是色谱分离的基础。
离子排斥色谱法离子排斥色谱法主要用于无机弱酸和有机酸的分离，也可用于醇类、醛类、氨基酸和糖类的分析。典型的离子排斥色谱柱是全磺化高交换容量的H + 型阳离子交换剂，其功能基为磺酸根阴离子。树脂表面的这一负电荷层对负离子具有排斥作用，即所谓的Donnan 排斥。
相同色谱条件下，有机酸在排斥柱上的保留主要由酸的强弱决定，实验中总结出如下洗脱规律：同类羧酸，保留时间随碳链增长而增加；
被取代的羧酸，若取代基使酸的酸性增强，则保留时间较相应的非取代酸短，取代基越多，保留时间越短；
一般二元酸在一元酸前洗脱；
双链有机酸较其对应的单链有机酸保留时间长；
芳香羧酸在树脂上的保留一般较强，但HPIEC却对它们不灵敏。
离子抑制色谱法和离子对色谱法
在这种情况下，可以采用下列两种方法来解决这个问题：
第一种方法：由酸碱平衡理论可知，如果降低（或增加）流动相的pH 值，可以使酸（或碱）性离子化合物尽量保持离子状态，然后可以利用离子色谱的一般体系来进行分析测定。这种方法便是离子抑制色谱法（ISC）。
第二种方法：如果被分析的离子是较强的电解质，单靠改变流动相的酸碱性不能抑制离子性
化合物的解离，这时可以在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即离子对试剂，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留，从而达到被分离的目的。这种方法便是离子对色谱法（IPC ）。
在离子色谱中，分析对象和所使用的流动相都是离子型物质。不同的离子，其溶液的导电性是不同的。在非抑制型电导检测中，直接测定柱流出物的电导。流动相中的离子主要是淋洗离子和与之平衡的反离子，其电导值称为背景电导。
抑制型电导检测离子色谱法使用的是强电解质流动相如分析阴离子用的Na 2CO 3、NaOH 和分析阳离子用的稀硝酸，稀硫酸等。这类流动相的背景电导高，而且被测离子以盐的形式存在于溶液中，检测灵敏度很低。为了提高灵敏度，就需要用抑制器来降低流动相背景电导和增加被测物的电导。
吸附色谱法常叫做液－固色谱法（Liquid-SolidChromatography ，简称LSC ），它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用。可以将吸附剂装填于柱中、覆盖于板上、或浸渍于多孔滤纸中。
也就是说利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。 吸附色谱利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程 吸附色谱的分配系数表达式如下：
其中[X a ]表示被吸附于固定相活性中心的组分分子含量，[X m ]表示游离于流动相中的组分分子含量。分配系数对于计算待分离物质组分的保留时间有很重要的意义。
吸附方式：1．物理吸附又称表面吸附，是因构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间里的相互作用所引起的。
a)基本规律：“相似者易于吸附”，固液吸附时，吸附剂、溶质、溶剂三者统称为吸附过程的三要素。
b)基本特点：无选择性、可逆吸附、快速。
c)基本原理：吸附与解吸附的往复循环。
物理吸附过程：吸附——解吸附——再吸附——再解析——直至分离
2．化学吸附
a)基本特点：有选择性、不可逆吸附。
b)基本原理：产生化学反应。
酸性物质与Al 2O 3发生化学反应；碱性物质与硅胶发生化学反应；Al 2O 3容易发生结构的异构化，应尽量避免。
3．半化学吸附
][][m a a X X K
a）基本特点：介于物理吸附和化学吸附之间。
b）基本原理：以氢键的形式产生吸附。
如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间的氢键吸附，力量较弱，介于前两者之间，也有一定的应用。
吸附能力与分子结构的关系
1形成氢键数目多，吸附能力强。
2形成分子内氢键，吸附力减弱。
3芳香化合物中，共轭双键多，吸附牢
吸附色谱三要素：被分离物质、洗脱剂和吸附剂
溶剂！溶剂相似相容原理2极性吸附，溶剂的介电常数越大，洗脱能力越强；非极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈弱。
洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸>水>甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>醚>氯仿>苯>四氯化碳和己烷。为了能得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得最佳分离效果。
吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，例如硅胶、氧化铝和活性炭等。活性点位例如硅胶的表面硅烷醇，一般与待分离化合物的极性官能团相互作用。分子的非极性部分（例如烃）对分离只有较小影响，所以液－固色谱法十分适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。
吸附剂的一般要求：较大的表面积与一定的吸附能力。不与展开剂起化学变化，不与待分离的物质产生反应或催化、分解或缔合，颗粒均匀。
1．极性吸附剂
硅胶，氧化铝均为极性吸附剂，特点为：
a)对极性物质具有较强的亲和能力，极性强的溶质将被优先吸附。
b)溶剂极性较弱，则吸附剂对溶质将表现出较强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力随之减弱。
c)溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时，又可被后者臵换洗脱下来。极性强弱的判断(与功能基的种类、数目多少和排列方式有关)：亲水性基团与极性成正比，亲脂性基团与极性成反比；游离型化合物极性弱、具亲脂性，解离型化合物极性强、具亲水性；溶剂的极性—依据介电常数来决定。
2．聚酰胺
聚酰胺吸附剂可分包括锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺），为氢键吸附，半化学吸附。聚酰胺分子中有许多酰胺基，聚酰胺上的C=O与酚基，黄酮类、酸类中的-OH 或-COOH形成氢键。酰胺基中的氨基与醌类或硝基类化合物中的醌基或硝基形成氢键。由于被分离物质的结构不同，或同一类结构化合物中的活性基团的数目及位臵的不同而是之于聚酰胺形成氢键的能力不同而得到分离。
3．活性炭
活性炭为非极性吸附剂，故与硅胶、氧化铝相反，对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也随之降低。吸附剂的吸附力一定时，溶质极性越强，洗脱剂的极性越弱。
亲和色谱生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分
子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。
静电作用、氢键等多种作用力对亲和作用具有影响。
生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。
?找与底物专一可逆结合的配基；
?将配基通过共价键偶联到基质；
?配基与底物吸附；
?洗脱目标物。
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完全破坏。
2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。
3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强
5、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
?专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度
?相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
常见的亲和色谱
1核苷酸及辅酶亲和色谱
2固定化金属离子亲和色谱
3染料亲和色谱
4免疫亲和色谱
1指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分离纯化目的
2 蛋白质上的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，有利于蛋白质与固定化金属离子结合，从而达到分离的目的。
金属离子如锌和铜。
将活化的介质与金属螯合剂偶联，再用金属离子溶液处理制成金属螯合亲和层析柱。
金属螯合剂：亚氨二醋酸、氨基水杨酸、8-羟基喹啉、羧甲基氨基酸等
3有机染料具有类似于NAD+的结构。
需核苷酸类物质为辅酶的酶，对染料具有一定亲和力。
染料共价偶联到琼脂糖载体上，能制得亲和层析柱。
染料亲和层析已成功的分离纯化了多种酶。
4抗原和抗体的作用具有高度的专一性, 并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到吸附剂上, 便可有效地分离和纯化免疫物质。
特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。
色谱分析法基本原理
色谱分析法基本原理 色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子 交换色谱与排阻色谱等方法。 吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。 分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。 离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而 使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。 排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小 的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。 色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。 分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸 色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。柱色谱法 所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤 维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果，除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应予注意。 吸附剂的填装干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，
色谱分析法概论习题答案
第十六章色谱分析法概论 思考题和习题 1．在一液液色谱柱上，组分A和B的K分别为10和15，柱的固定相体积为，流动相体积为，流速为min。求A、B的保留时间和保留体积。 2．在一根3m长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min，组分1的保留时间为14min，组分2的保留时间为17min，峰宽为1min。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n及塔板高度H；(2) 求调整 保留时间 ' R1 t 及 ' R2 t ；(3) 用组分2 求n ef及H ef；(4) 求容量因子k1及k2；(5) 求相对保留值1,2 r 和分离度 R。 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为min；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s=。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间：苯、甲苯、乙苯，异丙苯，死时间为。求：(1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比?。 （1） V0=t0×u=×min=10.5cm3 （2） ' R t(苯) =－= , ' R t(甲苯) =－= , ' R t(乙苯) =－= , ' R t(异丙苯) =－= 4．在一根甲基硅橡胶 (OV-1) 色谱柱上，柱温120℃。测得一些纯物质的保留时间：甲烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、苯、3-正己酮、正丁酸乙酯、正己醇及某正构饱和烷烃。(1) 求出后5个化合物的保留指数。未知正构饱和烷烃是何物质？ (2) 解释上述五个六碳化合物的保留指数为何不同。 (3) 说明应如何正确选择正构烷烃物质对，以减小计算误差。 ①根据保留指数的公式和意义，5个化合物的保留指数为： 设某正构烷烃的碳数为x，则 解此方程得x=5, 所以该正构烷烃为正戊烷。 （2）上述五个化合物极性由大到小分别为：正己醇＞正丁酸乙酯＞3-正己酮＞苯＞正戊烷，根据气液色谱固定液的作用原理，在弱极性的OV-1柱上保留能力由强到弱，即保留指数由大至小。 （3）选择正构饱和烷烃物质对的t R值最好与被测物质的t R值相近，以减小测定误差。 5．某色谱柱长100cm，流动相流速为0.1cm/s，已知组分A的洗脱时间为40 min，求组分A在流动相中的时间和保留比R?=t0/t R为多少。， 流动相流过色谱柱所需的时间即死时间t0，即为组分A在流动相中的停留时间： t0=L/u=100/×60)= 组分A的洗脱时间即其保留时间t R 保留比R?=t0/t R=40= 6．某YWG-C18H37 4.6mm×25cm柱，以甲醇－水（80:20）为流动相，测得苯和萘的t R和W1/2分别为和 min, 和 min。求柱效和分离度。
色谱分析法概论习题答案
色谱分析法概论习题答 案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
第十六章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为，流动相体积为，流速为min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 ml F t V V V K t t ml F t V V V K t t F V t c RB RB m s B RB c RA RA m s A RA c 0.95.018 min 18)5 .15.0151(3)1(5.65.013 min 13)5 .15 .0101(3)1(min 35.0/5.1/0000=?=?==?+?=+==?=?==?+?=+==== 2．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间 'R 1 t 及 'R 2 t ；(3) 用组分2 求n ef 及H ef ；(4) 求容量因子k 1及 k 2；(5) 求相对保留值 1 ,2r 和分离度R 。 (mm) 0.65 (m) 1065.010 4.63 n L H 104.6) 1 17 (16) t 16( n )1(33 223 22R 22 =?=?==?=?==-W (mm) 0.73 (m) 1073.010 4.13 n H 101.4) 116 (16) 16(n (3)(min) 16117 (min) 13114 (2)33 ef(2)ef(2)3 22 'ef(2)' '2 2 1=?=?==?=?===-==-=-L W t t t R R R 31) 1(3)1 61(2) W () t 2(R 2.1 13 16r )5( 16116k 13113k (4)21''2,10'20'112122 1 =+-?=+-==========W t t t t t t t R R R R R R 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为min ；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s =。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间：苯、甲苯、乙苯，异丙苯，死时间为。求：(1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比?。 （1） V 0=t 0×u=×min=10.5cm 3 （2） 'R t (苯) =－= , 'R t (甲苯) =－= , 'R t (乙苯) =－= , 'R t (异丙苯) =－=
第十二章 色谱分析法基础
第十二章色谱分析法基础 教师：李国清 一.教学目的： 1. 熟练掌握色谱分离方法的原理； 2. 掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表的各种技术参数的准确含义； 3. 能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验 因素； 4. 学会各种定性和定量的分析方法。 二.教学重难点： 1. 塔板理论，包括理论塔板数（n）、有效塔板数（n eff）和塔板高 度（H）及有效塔板高度（H eff）的计算。 2. 速率理论方程 3. 分离度和基本分离方程 三．教具： 多媒体计算机、板书。 四．教学方法： 讲授、演示、提问、讨论。 五．教学过程 §12-1、色谱法的特点、分类和作用 一.概述 色谱法是混合物最有效的分离、分析方法。
俄国植物学家茨维特在1906年使用右图的装置分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响： （1）一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来 （2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动。 各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。 色谱法是一种分离技术： 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。 与适当的柱后检测方法结合，可实现混合物中各组分的分离与检测。 二．色谱法分类
色谱分析法概论
第17章 色谱分析法概论 思考题 9．试推导有效塔板数与分离度的关系式： 2 2116?? ? ??-??ααR n ＝有效 证明：∵ 2 ' 2216R t n W ?? ? ??? 有效＝ (1) 2 2 W W +R2R112(t -t ) R ＝ 设W 1=W 2 2 2'' 2010212222[()()]2()22R R R R t t t t t t W W W W ----==+R2R112(t -t )R ＝ ''1R t R -R22t W ＝ (2) 将（2）代入（1）式，得： '22 ' '2222221 '''221'1 1616()16()11R R R R R R R t t t n R R R t t t t αα???==?? ?--??-有效＝ 10. 试推导最小板高的计算式：BC A H 2+＝最小 证明：∵B H A Cu u =++ (1) 微分，得 2dH B C du u =-+ 令 0dH du =，则 2 0B C u - += opt u = 将（2）代入（1），得： H A =+最小
习题 1.在一根 2.00m 的硅油柱上分析一个混合物得下列数据：苯、甲苯及乙苯的保留时间分别为80s 、122s 、181s ；半峰宽为0.211cm 、0.291cm 及0.409cm(用读数显微镜测得)，已知记录纸速为1200mm/h ，求此色谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板高度。 解：∵2 2 /1)( 54.5W t n R = 注意：分子分母单位应保持一致 mm n L H W t n R 3.28852000,8853600 /120011.28054.554.52 2 2/1＝＝＝）（ ＝）（＝苯苯苯 苯苯= mm n L H W t n R 8.110822000,10823600 /120091.212254.554.52 2 2/1＝＝＝）（ ＝）（＝甲苯甲苯甲苯 甲苯甲苯= mm n L H W t n R 7.112062000,12063600 /120009.418154.554.52 2 2/1＝＝＝）（ ＝）（＝乙苯乙苯乙苯 乙苯乙苯= 2.在一根 3.0m 长的色谱柱上分离样品的结果如图17－14所示。 图17－14 一个样品的色谱图 （1）用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H; (2)求调整保留时间t R1’及t R2`;(3)求有效塔板数n 有效及有效塔板高度H 有效；（4）求容量因子k 1及k 2；（5）求使二组分R s 为1.5时的柱长。 解：（1）3222106.4)0 .117 (16)( 162 ?=?==w t n R mm n L H 65.0106.430003=?= = （2）t R1′= t R1-t 0 =14-1.0=13.0min t R2′=t R2-t 0=17-1.0=16.0min (3) 32 22'101.4)0.10.16(16)( 162 ?=?==w t n R 有效 mm n L H 73.0101.430003 =?==有效 有效 (4)130.10.130' 11 ===t t k R 160 .10 .160' 22===t t k R (5)假设两组分峰宽相等。 30 .10.1) 1417(2)(21 2112=+-= +-= W W t t R R R
17色谱分析法概论
第十七章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．色谱法作为分析方法的最大特点是什么? 2．一个组分的色谱峰可用哪些参数描述？ 这些参数各有何意义？ 3．说明容量因子的物理含义及与分配系数的关系。为什么容量因子 (或分配系数) 不等是分离的前提？ 4．各类基本类型色谱的分离原理有何异同？ 5．说明式（17?18）中K 与V s 在各类色谱法中的含义有何不同？ 6．衡量色谱柱效的指标是什么？衡量色谱系统选择性的指标是什么？ 7．用塔板理论讨论流出曲线，为什么不论在 t ＞t R 或t ＜t R 时，总是C ＜C max ? 塔板理论有哪些优缺点？ 8．简述谱带展宽的原因。 9．下列那些参数可使塔板高度减小? (1) 流动相速度，(2) 固定相颗粒， (3) 组分在固定相中的扩散系数D s ，(4) 柱长， (5) 柱温。 10．什么是分离度？要提高分离度应从哪两方面考虑？ 11．组分在固定相和流动相中的质量为m A 、m B (g)，浓度为C A 、 C B (g/ml)，摩尔数为n A 、n B (mol)，固定相和流动相的体积为V A 、V B (ml)，此组分的容量因子是 ( ) 。 A. m A /m B ； B. (C A V A )/(C B V B ) ； C. n A /n B ； D. C A /C B 。 （A 、B 、C ） 12．在柱色谱法中，可以用分配系数为零的物质来测定色谱柱中 ( ) 。 A. 流动相的体积； B. 填料的体积； C. 填料孔隙的体积； D. 总体积。 （A 、C ） 13．在以硅胶为固定相的吸附色谱中下列叙述中正确的是 ( ) 。 A. 组分的极性越强，吸附作用越强； B. 组分的分子量越大，越有利于吸附； C. 流动相的极性越强，溶质越容易被固定相所吸附； D. 二元混合溶剂中正己烷的含量越大，其洗脱能力越强。 （A ） 14．在离子交换色谱法中，下列措施中能改变保留体积的是( )。 A. 选择交联度大的交换剂； B. 以二价金属盐溶液代替一价金属盐溶液作流动相； C. 降低流动相中盐的浓度； D. 改变流速。 （A 、B 、C ） 15．在空间排阻色谱法中，下列叙述中完全正确的是( )。 A. V R 与K p 成正比； B. 调整流动相的组成能改变V R ； C. 某一凝胶只适于分离一定分子量范围的高分子物质； D. 凝胶孔径越大，其分子量排斥极限越大。 （C 、D ） 16．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为0.5ml ，流动相体积为1.5ml ，流速为0.5ml/min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 （A R t =13min A R V =6.5ml, B R t =18min B R V =9ml ） 17．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。 (1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间
色谱分析法概论
色谱分析法概论 1色谱分析法是根据混合物中各组分在两相分配系数的不同进行分离，而后逐个分析。 2色谱过程：组分的分子在流动相和固定相间多次分配的过程。若两个组分的分配系数存在微小的差异，经过反复多次的分配平衡，使微小的差异积累起来，其结果就使分配系数小的组分被先洗脱，从而使两组分得到分离。色谱分离的前提是分配系数或保留因子不等。 3色谱流出曲线是由检测器输出的电信号对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。 4按色谱过程的分离机制分类：分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法。①分配色谱法机制：利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别，即分配系数的差别而实现分离。②吸附色谱法机制：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别，即吸附系数的差别而实现分离。常见化合物的吸附能力顺序：烷烃＜烯烃＜卤代烃＜醚＜硝基化合物＜叔胺＜酯＜酮＜醛＜酰胺＜醇＜酚＜伯胺＜羧酸③离子交换色谱法机制：利用分离组分离子交换能力的差别即选择性系数的差别而实现分离。④分子排阻色谱法：根据被分离组分分子的线团尺寸，即渗透系数的差别而进行分离。 5流动相线速对塔板高度的影响：在较低线速度时，纵向扩散起主要作用，线速度升高，塔板高度降低，柱效升高；在较高线速度时，传质阻抗起主要作用，线速度升高，塔板高度增高，柱效降低。 6说明保留因子的物理含意及与分配系数的关系。为什么保留因子（或分配系数）不等是分离的前提？ 答：保留因子k是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比，故又称为质量分配系数。而分配系数K是组分在固定相和流动相中的浓度之比。二者的关系是k=KV s／／V m，可见保留因子除与固定相、流动相、组分三者的性质有关外，还与固定相和流动相的体积之比有关。保留因子越大的组分在色谱柱中的保留越强，t R =t0 （1+k）或t＇R =kt0 ，由于在一定色谱条件下t0为定值，如果两组分的k相等，则他们的t＇R一定相等，t R相等，即不能分离。要使两组分分离，即t R或t＇R不等，则它们的k（或K）必须不等，即保留因子（或分配系数）不等是分离的前提。 7根据分离度的定义，哪些色谱参数与分离度有关？可从哪两方面改善色谱分离度？如何在色谱图上测定这些参数？ 答：分离度的定义式为R=2（t R2 -t R1）／（W1 +W2 ),由此可见色谱峰的区域宽度和保留时间与分离度有关。为改善色谱分离度，一方面应增加两组分保留时间之差，即保留因子或分配系数之差，另一方面减小峰宽，即提高柱效使色谱峰变锐。保留时间是从进样到色谱峰峰顶的时间间隔；峰宽是在色谱峰两侧拐点作切线到基线上所截得的距离。 8什么是最佳流速？实际操作中是否一定要选择最佳流速？为什么？ 答：柱效最高时（n最大或H最小）的流动相流速叫最佳流速。实验中要根据具体情况选择流速，如果分离不好，尽量选最佳流速，如果速度太慢而分离很好，则可选远于最佳值的流速。 9色谱定性是根据保留值，定量的依据是峰面积和峰高。 气相色谱法 1气相色谱法的特点：分离效能高、高灵敏度、高选择性、简单快速、应用广泛。 2气相色谱仪的组成：①气路系统②进样系统③色谱柱系统④检测和记录系统⑤控制系统3对固定液的要求：①在操作温度下蒸气压低于10Pa，否则固定液易流失。每一固定液有一
第十二章 色谱分析法
第十二章色谱分析法 1、简要说明气相色谱法的分离原理 答：气相色谱法的分离原理是利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数。当两相作相对移动时，混合物中各组分在两相中反复多次分配，原来微波的分配差异产生了很明显的分离效果，从而依先后顺序流出色谱柱。 2、气相色谱仪有哪些主要部件？各有什么作用？ 答：气相色谱仪的主要部件有：高压气瓶、气化室、恒温箱、色谱柱、检测器。 高压气瓶：储存载气； 气化室：将液体或固体试样瞬间气化，以保证色谱峰有较小的宽度； 恒温箱：严格控制色谱柱的温度； 色谱柱：分离试样； 检测器：将组分及其浓度变化以不同方式转换成易于测量的电信号。 或答：气路系统：是一个载气连续运行的密闭管路系统，通过该系统，可获得纯净、流速稳定的载气。 进样系统：包括进样器和气化室。其作用是让液体试样在进入色谱柱前瞬间气，快速而定量地加到色谱柱上端。 分离系统：色谱柱是色谱仪的分离系统，试样各组分的分离在色谱柱中进行。 温控系统：主要指对色谱柱、气化室、检测器三处的温度控制。 检测系统：是把载气里被分离的各组分的浓度或质量转换成电信号的装置。 3、试述热导池检测器及氢火焰电离检测器的工作原理。 答：热电池检测器是基于被分离组分与载气的导热系数不同进行检测的。当通过热导池他体的气体组成及浓度发生变化时，引起热敏元件温度的改变，由此产生的电阻值变化通过惠斯登电桥检测，其检测信号大小和组分浓度成正比。 氢火焰电离检测器是根据含碳有机物在氢火焰中发生电离的原理检测的。 4、根据速率理论方程式，讨论气相色谱操作条件的选择。 答：H = A + B/u + Cu 操作条件选择： ①使用适当细粒度和颗粒均匀的填充物，并尽量填充均匀，紧密，减小涡流扩散； ②载气流速u，当u较小时，分析扩散项B/u成为影响H的主要因素，此时应采用相对分子质量较大的载气（N2、Ar）以使组分在气相中有较小的扩散系数，减小组分在气相中停留的时间；当u较大时，传质阻力项Cu成为影响H的主要因素，此时宜用相对分子质量低的载气（H2、He）使组分在气相中有较大的扩散系数，减小气相传质阻力。可由H-u曲线求得U opt. ③适当降低固定液的液膜厚度，增大组分在液相中的扩散系数。 5、试述速率理论方程式中A、B/u、Cu三项的物理意义。 答：A：涡流扩散项，在填充色谱中，当组分随载气向柱出口迁移时，碰到的填充物颗粒阻碍会不断改变流动方向，使组分在气相中形成紊乱的类似“涡流”的流动，引起色谱峰变宽。 B/u：分子扩散项，是由于色谱柱内沿轴向存在浓度梯度，使组分分子随霸气迁移时自发地产生由高浓度向低浓度的扩散，从而使色谱峰变宽。
色谱分析法概论习题答案完整版
色谱分析法概论习题答 案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
第十六章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为，流动相体积为，流速为min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 2．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间 'R 1t 及'R 2t ；(3) 用组分2 求n ef 及H ef ；(4) 求容量因子k 1及k 2；(5) 求相对保留值1,2r 和分离度R 。 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为min ；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s =。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间： 苯、甲苯、乙苯，异丙苯，死时间为。求：(1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比?。 （1） V 0=t 0×u=×min=10.5cm 3 （2） 'R t (苯) =－= , ' R t (甲苯) =－= , 'R t (乙苯) =－= , ' R t (异丙苯) =－= 4．在一根甲基硅橡胶 (OV-1) 色谱柱上，柱温120℃。测得一些纯物质的保留时间：甲烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、苯、3-正己酮、正丁酸乙酯、正己醇及某正构饱和烷烃。(1) 求出后5个化合物的保留指数。未知正构饱和烷烃是何物质？ (2) 解释上述五个六碳化合物的保留指数为何不同。(3) 说明应如何正确选择正构烷烃物 ① 根据保留指数的公式和意义，5个化合物的保留指数为： 设某正构烷烃的碳数为x ，则 解此方程得x=5, 所以该正构烷烃为正戊烷。 （2）上述五个化合物极性由大到小分别为：正己醇＞正丁酸乙酯＞3-正己酮＞苯＞正戊烷，根据气液色谱固定液的作用原理，在弱极性的OV-1柱上保留能力由强到弱，即保留指数由大至小。 （3）选择正构饱和烷烃物质对的t R 值最好与被测物质的t R 值相近，以减小测定误差。
第一章色谱分析法概论
第一章色谱分析法概论 第一节概述 色谱分析法简称色谱法或层析法(chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法。从本世纪初起，特别是在近50年中，由于气相色谱法、高效液相色谱法及薄层扫描法的飞速发展，而形成一门专门的科学——色谱学。色谱法已广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分析方法，在各学科中起着重要作用。历史上曾有两次诺贝尔化学奖是授予色谱研究工作者的：1948年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研究而获奖，1952年英国的Martin和Synge因发展了分配色谱而获奖；此外在1937～l972年期间有12次诺贝尔奖的研究中，色谱法都起了关键的作用。 色谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相(stationary phase)，冲洗剂称为流动相(mobile phase)。随着其不断发展，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。虽然“色”已失去原有意义，但色谱法名称仍沿用至今。 30与40年代相继出现了薄层色谱法与纸色谱法。50年代气相色谱法兴起，把色谱法提高到分离与“在线”分析的新水平，奠定了现代色谱法的基础，l957年诞生了毛细管色谱分析法。60年代推出了气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)，有效地弥补了色谱法定性特征差的弱点。70年代高效液相色谱法(HPLC)的崛起，为难挥发、热不稳定及高分子样品的分析提供了有力手段。扩大了色谱法的应用范围，把色谱法又推进到一个新的里程碑。80年代初出现了超临界流体色谱法(SFC)，兼有GC与HPLC的某些优点。80年代末飞速发展起来的高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis，HPCE)更令人瞩目，其柱效高，理论塔板数可达l07m-1。该法对于生物大分子的分离具有独特优点。 色谱法的分离原理主要是利用物质在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离。色谱法与光谱法的主要区别在于色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法不具备分离功能。色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此是分析混合物最有力的手段。这种方法还具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。 色谱法可从不同的角度进行分类：
气相色谱法
气相色谱法测定丁醇中少量甲醇含量 一、实验目的 1. 掌握用外标法进行色谱定量分析的原理和方法。 2. 了解气相色谱仪氢火焰离子检测器FID的性能和操作方法。 3. 了解气相色谱法在产品质量控制中的应用。 4. 学习气相色谱法测定甲醇含量的分析方法。 二、实验原理 在丁醇生产的过程中，不可避免地有甲醇产生。甲醇是无色透明的具有高度挥发性的液体，是一种对人体有害的物质。甲醇在人体内氧化为甲醛、甲酸，具有很强的毒性，对神经系统尤其是视神经损害严重，人食入 5 g 就会出现严重中毒，超过 12. 5 g 就可能导致死亡，在白酒的发酵过程中，难以将甲醇和乙醇完全分离，因此国家对白酒中甲醇含量做出严格规定。根据国家标准（GB10343-89），食用酒精中甲醇含量应低于0.1g?L-1(优级)或0.6 g?L-1（普通级）。 气相色谱法是一种高效、快速而灵敏的分离分析技术，具有极强的分离效能。一个混合物样品定量引入合适的色谱系统后，样品被气化后，在流动相携带下进入色谱柱，样品中各组分由于各自的性质不同，在柱内与固定相的作用力大小不同，导致在柱内的迁移速度不同，使混合物中的各组分先后离开色谱柱得到分离。分离后的组分进入检测器，检测器将物质的浓度或质量信号转换为电信号输给记录仪或显示器，得到色谱图。利用保留值可定性，利用峰高或峰面积可定量。 外标法是在一定的操作条件下，用纯组分或已知浓度的标准溶液配制一系列不同含量的标准溶液，准确进样，根据色谱图中组分的峰面积（或峰高）对组分含量作标准曲线。在相同操作条件下，依据样品的峰面积（或峰高），从标准曲线上查出其相应含量。利用气相色谱可分离、检测丁醇中的甲醇含量，在相同的操作条件下，
色谱分析法概论习题答案
第十六章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为，流动相体积为，流速为min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 ml F t V V V K t t ml F t V V V K t t F V t c RB RB m s B RB c RA RA m s A RA c 0.95.018 min 18)5.15.0151(3)1(5.65.013 min 13)5 .15.0101(3)1(min 35.0/5.1/0000=?=?==?+?=+==?=?==?+?=+==== 2．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间'R 1t 及'R 2t ；(3) 用组分2 求n ef 及H ef ；(4) 求容量因子k 1及k 2；(5) 求相对保留值1,2r 和分离度R 。 (mm) 0.65 (m) 1065.0104.63n L H 104.6) 1 17(16) t 16(n )1(3322322R 22 =?=?==?=?==-W (mm) 0.73 (m) 1073.010 4.13n H 101.4) 1 16(16) 16(n (3)(min) 16117 (min) 13114 (2)33ef(2)ef(2)3 22'ef(2)''22 1=?=?==?=?===-==-=-L W t t t R R R 31) 1(3)1 61(2) W () t 2(R 2.1 13 16r )5( 16116k 13113k (4)21''2,10'20'1121221=+-?=+-==========W t t t t t t t R R R R R R 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为min ；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s =。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间：苯、甲苯、乙苯，异丙苯，死时间为。求： (1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比?。 （1） V 0=t 0×u=×min=10.5cm 3 （2） 'R t (苯) =－= , ' R t (甲苯) =－= , 'R t (乙苯) =－= , ' R t (异丙苯) =－= 3.194.310.5 6.143.294.3 1.217.143.20.161 .145.1025.21K 25.21 24.0 .1050.121 .145.104.16K 4.16 24.0 .9435.71.145.101.10K 1.01 24.0 .4326.31 .145.109.4K 4.9 24.0 17.1/////////0/0/0/0/==========?======?======?======?=====乙苯异丙苯乙苯异丙苯甲苯乙苯甲苯乙苯苯甲苯苯 甲苯异丙苯异丙苯异丙苯异丙苯乙苯乙苯乙苯乙苯甲苯甲苯甲苯甲苯 苯苯苯苯R R R R R R s m R s m R s m R s m R t t t t t t V V k t t k V V k t t k V V k t t k V V k t t k ααα
第十二章色谱分析法
色谱分析法 1．色谱法有哪些类型？其分离的基本原理是什么？ 答：气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC），根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）．液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）。同理，液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）．超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。 2．试述热导池及氢焰离子化检测器的原理？ 答：热导池检测器是利用组分蒸气与载气导热系数不同来测定各组分的． 氢焰离子化检测器是利用有机物在氢气――空气火焰中产生离子化反应而生成许多离子对，在加有电压的两极间形成离子流． 3．如何选择气液色谱的固定液？ 答：对固定液的选择并没有规律性可循。一般可按“相似相溶”原则来选择。在应用时，应按实际情况而定。 （i）分离非极性物质：一般选用非极性固定液，这时试样中各组分按沸点次序流出，沸点低的先流出，沸点高的后流出。 （ii）分离极性物质：选用极性固定液，试样中各组分按极性次序分离，极性小的先流出，极性大的后流出。 （iii）分离非极性和极性混合物：一般选用极性固定液，这时非极性组分先流出，极性组分后流出。 （vi）分离能形成氢键的试样：一般选用极性或氢键型固定液。试样中各组分按与固定液分子间形成氢键能力大小先后流出，不易形成氢键的先流出，最易形成氢键的最后流出。（v）复杂的难分离物质：可选用两种或两种以上混合固定液。 对于样品极性情况未知的，一般用最常用的几种固定液做试验。 对固定液的要求： 首先是选择性好．另外还要求固定液有良好的热稳定性和化学稳定性；对试样各组分有适当的溶解能力；在操作温度下有较低蒸气压，以免流失太快。 （a．在操作温度下呈液态，并有足够的稳定性，能溶解被分离混合物中的各组分，且不与组分发生化学反应。b．在操作温度下粘度要低，以保证固定液能均匀分布在担体上形成均匀的液膜。c．对被分离的各组分有足够的分离能力。）
色谱分析法
在离子色谱中检测器为电导检测器,以电解质溶液作为流动相,为了消除强电解质背景对电导检测器的干扰,通常除了分析柱外,还增加一根抑制柱,这种双柱型离子色谱法称为化学抑制型离子色谱法. 但是如果选用低电导的流动相(如1×10-4~ 5 ×10-4M的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐),则由于背景电导较低,不干扰样品的检测,这时候不必加抑制柱,只使用分析柱,称为非抑制型离子色谱法. 例如为了分离阴离子,常使用NaOH溶液为流动相,钠离子的干扰非常严重,这时可在分析柱后加一根抑制柱,其中装填高容量H+型阳离子交换树脂,通过离子交换,使NaOH转化为电导值很小的H2O,从而消除了背景电导的影响. 何为化学抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，是色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属于固－液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。 薄层色谱法（TLC）是将样品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，利用不同组分迁移的速度不同，使样品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。 固定相：吸附剂流动相：展开剂分离原理：吸附、解吸附 特点：设备简单、操作方便专属性强、展开剂灵活多变、 色谱图直观和容易辨认具分离和分析双重功能 “三高、一快、一广”高灵敏度、高选择性、高效能 分析速度快应用广 分类（根据作为固定相的支持物不同）： ?薄层吸附层析（吸附剂） ?薄层分配层析（纤维素） ?薄层离子交换层析（离子交换剂） ?薄层凝胶层析（分子筛凝胶） 一般实验室中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。 在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即比移值（Rf）是化合物的物理常数，其大小与化合物的极性有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。 色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。 可用于精制样品，适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐
色谱分析法练习题
买了没色谱分析法练习题 班级姓名学号 一、选择题 1. 在气相色谱中，调整保留值实际上反映了哪些部分分子间的相互作用( )。 A.组分与固定相； B.组分与载气； C.组分与组分； D.载气与固定相。 2. 在气-固色谱分析中, 色谱柱内装入的固定相为（）。 A.一般固体物质 B.载体 C.载体+固定液 D.固体吸附剂 3. 塔板理论不能用于（）。 A.塔板数计算； B.塔板高度计算； C.解释同一色柱在不同的载气流速下柱效不同的原因； D.解释色谱流出曲线的形状。 4. 当载气线速越小，范氏方程中，分子扩散项起控制作用时，采用下列哪种气 体作载气对提高柱效最有利（）。 A.H 2 B.He C.N 2 D.CO 2 5. 根据范第姆特方程式，指出下面哪种说法是正确的（）。 A.最佳流速时理论塔板高度最大； B.最佳流速时理论塔板数最大； C.最佳理论塔板高度时流速最大； D.最大理论塔板数时理论塔板高度最大。 6. 若在一根2m长的色谱柱上测得两组分的分离度为0.87，要使它们完全分离，则柱长至少应为（以m为单位）（）。 A.0.6 B.0.3 C.3 D.6 7. 常用于评价色谱分离条件是否适宜的参数是（）。
A.理论塔板数 B.塔板高度 C.分离度 D.死时间 8. 色谱分析中，可以用来进行定性的色谱参数是（）。 A.峰面积 B.峰高 C.半峰宽 D.保留值 9. 用气液色谱法分离A.B和C三组分的混合样品，已知它们的分配系数K A ＞K B ＞K C ，则其保留时间的大小顺序为（）。 A. A ＞ B ＞ C B. B ＞ A ＞ C C. C ＞ B ＞ A D. B ＞ C ＞ A 10. 试指出下述说法中, 哪一种是错误的（）。 A.根据色谱峰的保留时间可以进行定性分析； B.根据色谱峰的面积可以进行定量分析； C.色谱图上峰的个数一定等于试样中的组分数； D.色谱峰的区域宽度体现了组分在柱中的运动情况。 11.色谱定量分析中适用归一化法的情况是：（） A.大批量试样的快速分析； B.试样各组分只有少数出峰； C.对进样要求不严； D.试样中所有组分都出峰。 12.若在一根1m长的色谱柱上测得两组分的分离度为0.67，要使它们完全分离， 则柱长至少应为（以m为单位）（）。 A.5 B.1 C.9 D.0.5 13.反映色谱柱分离特性的参数为：（） A．分离度 B．保留时间 C. 色谱峰宽度 D．分配系数 14.反映色谱柱柱型特性的参数为：（） A．保留值B．相比 C．分配系数 D．色谱峰宽度 15.反映色谱分离过程热力学因素的参数是：（） A．色谱峰的半宽度 B．色谱峰的保留值 C．难分离物质对的分离度 D．色谱峰的峰面积 16.反映色谱分离过程动力学因素的参数是：( )
色谱分析概论习题
淮 阴 师 范 学 院 仪器分析 课程 色谱分析概论 习题
得
分
一、选择题（每题 2 分，共 20 题，40 分） 1、反映色谱柱柱型特征的参数是： （ ）
密
封
线
A．分配系数 B．分配比 C．相比 D．保留值 2、对某一组分来说，在一定的柱长下，色谱峰的宽或窄主要决定于组 分在色谱柱中的（） Ａ．保留值 Ｂ．扩散速度 Ｃ．分配比 Ｄ．理论塔板数 3、指出下列哪些参数改变会引起相对保留值的增加（ ） Ａ．柱长增加； Ｂ．相比率增加；Ｃ．降低温度； Ｄ．流动相速度降低 4、色谱分析中，相对保留值可由下列那种物理量确定（ ） A 两组分 K B 两组分 tR C 两组分 VR D 柱子的 Vs 和 Vm 5、色谱分析采用归一化法，下列那种说法正确（ ） A 不要求全部组分出峰 B 进样量要求准确 C 只能用作微量组分的精确定量 D 一次分析过程中条件需稳定 6、试指出下述说法中, 哪一种是错误的? （ ） A 根据色谱峰的保留时间可以进行定性分析 B 根据色谱峰的面积可以进行定量分析 C 色谱图上峰的个数一定等于试样中的组分数 D 色谱峰的区域宽度体现了组分在柱中的运动情况 7、在色谱分析中，柱长从 1 m 增加到 4 m ，其它条件不变，则分离度增加 (A) 4 倍 (B) 1 倍 (C) 2 倍 (D) 10 倍 8、使用热导池检测器时, 应选用下列哪种气体作载气, 其效果最好 ( ) (A) H2 (B) He (C) Ar (D) N2 9、在液相色谱中，范第姆特方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略 （ ） （A）.涡流扩散项 （B）.分子扩散项 （C）流动区域的流动相传质阻力 （D）.停滞区域的流动相传质阻力 10、热导池检测器是一种 ( ) (A)浓度型检测器 (B)质量型检测器 (C)只对含碳、氢的有机化合物有响应的检测器 (D)只对含硫、磷化合物有响应的检测器 11、当样品各组分全部出峰最好选用（ ）方法定量分析。 A 归一法 B 外标法 C 内标法 D 都行 12、载体填充的均匀程度主要影响（）
系别
班级
学号
姓名
《色谱分析法》复习题答案
《色谱分析法》复习题 1.色谱法作为分析方法的最大特点是什么? 1）色谱法的突出特点是具有很强的分离能力。所以，色谱法成 为许多分析工作的先决条件和必需的步骤。2） 近二十年来， 随着与色谱法相关的一系列技术，如填料与柱制备技术、仪器 一体化技术、检测器技术、数据处理技术的发展与创新，色谱 法已具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、灵敏度高、 分离和测定一次完成、易于自动化等优点。 2.一个组分的色谱峰可用哪些参数描述?这些参数各有何意义? 色谱峰的特征 一个组分色谱峰特征的描述: 峰高或峰面积（用于定量） 峰位（用保留值表示，用于定性） 峰宽（用于衡量柱效） 3.衡量色谱柱效的指标是什么?请作简要的说明. 色谱峰的柱效参数(区域宽度) 标准差(σ):正态分布曲线上两拐点间距离之半. σ的大小说明组分在流经色谱柱的过程中的分散程度。σ小，分散程度小，极点浓度高，峰形“瘦”，柱效高。反之，σ大，峰形“胖”，柱效低。 峰宽（W ）:在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离. W = 4σ 半峰宽（W1/2）:通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两间的距离. W1/2= 2.355σW = 1.699W1/2 4.简述谱带展宽的原因. 5.什么是分离度?要提高分离度应从哪两方面考虑? 分离度是相邻两组分色谱峰保留时间之差与两峰峰宽均值之比。分离度是总分离效能指标。R=tR2－tR1/（W1+W2）/ 2= 6.下列参数发生何种变化可使理论塔板高度减小?
(1) 流动相速度;(2)固定相颗粒;(3)组分在固定相中的扩散速度;(4)柱长. Ven Deemter 方程式H＝A + B/u + Cu H：理论塔板高度A：涡流扩散系数B：纵向扩散系数影响塔板高度的C：传质阻抗系数u：流动相线速度在填充色谱柱中，由于填料粒径大小不等，填充不均匀，使同一组分的分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱，使色谱峰展宽。涡流扩散的程度由下式决定：A＝2λdp 7.名词解释: (1)噪声和飘移;(2)灵敏度和检测限;(3)线性和线性范围.(4)梯度洗 脱. 8.写出分离度(R)与柱效(n)、分配系数比(α)及容量因子(k)间的关系式.指出各 项的含义.当分别增加n、α、k时,R有什么样的改变? 9.色谱分析法进行定量分析的依据是什么? 10.简述Van Deemter方程在气相色谱和高效液相色谱中表达形式的异同. 11.某色谱柱的理论塔板数很大,是否任何两种难分离的组分一定能在该柱上进 行分离?为什么? 12.什么是正相色谱?什么是反相色谱?讨论正、反相色谱中流动相强度与极性的 关系. 13.在RP-HPLC中使用的甲醇-水流动相体系中加入磷酸盐时,流动相的洗脱能 力是增大还是减小?为什么? 14. HPLC的光二极管阵列检测器可以得到那些信息? 15.用方程式说明反相离子对色谱法分离强酸、强碱的机制. 16.何谓化学键合相?常用的化学键合相有哪几种类型? 17.常用的HPLC定量分析方法是什么?内标法的特点是什么? 18.以液相柱色谱方法分离纯化蛋白质的分离模式有几种,各自的基本特点是什 么? 19.用HPLC建立一种测定生物材料中某种活性成分的含量的方法时,进行课题 设计需要从哪几个基本方面来考虑?