(一)立项依据与研究内容

（一）立项依据与研究内容

1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）

杆状病毒是一类基因组大小在80～180kb之间的双链超螺旋杆状DNA病毒，因其病毒粒子的外形呈棒状而得名[1]。杆状病毒的研究原来侧重于作为重要的生物防治微生物控制森林害虫的虫口密度和作为重要绢丝昆虫的病源微生物减轻在蚕丝业上的危害性[2]。自发现杆状病毒的多角体蛋白启动子为真核生物中具有最强转录活性的启动子之一这一特性后，构建成高效的真核生物表达系统——杆状病毒表达系统以来，随着杆状病毒分子生物学研究的进展，目前已有超过20个的杆状病毒基因组全序列完成[3]，为进一步开展功能基因研究提供了基础。目前其研究和应用领域已拓展到真核生物表面展示系统，蛋白质－—蛋白质互作研究系统，杆状病毒介导的哺乳动物外源基因转导和疫苗开发及基因治疗等新领域[4]。杆状病毒基因表达调控的基本模式为级联表达模式：亦即后一时相的基因表达有赖于前一时相基因的有效表达，目前一般仍认为杆状病毒基因表达可分为4个阶段：Ⅰ：极早期基因：以IE-1为代表的全程反式调控因子；Ⅱ：早期基因：参与病毒DNA复制的一些基因，如DNA聚合酶、解旋酶等，这些基因的启动子可被宿主的RNA聚合酶所识别和转录，但转录活性很低，大量转录仍有赖于极早期基因的参与（注：亦有将Ⅰ、Ⅱ统称为早期基因，但从一些基因启动子功能分析和Northern杂交结果来看，可能还是分开更为合理）；Ⅲ：晚期基因：多为一些病毒核衣壳的结构蛋白及参与病毒复制形成的一些辅助蛋白，如egt、gp64、ubiquitin等；Ⅳ：晚晚期基因，只在病毒感染的末期进行超高量表达，与病毒包含体的形成有关，目前直接参与影响晚晚期基因多角体蛋白和p10蛋白表达的已鉴定的只有VLF-1蛋白（Very Late Factor-1）[5]。虽然目前已有至少23个杆状病毒的全基因组序列得到了分析，所包含的DNA序列长度在80～180kb之间，所预测的ORF数目在90～181之间，但其中仍有不少ORF的功能未得到明确鉴定[6]。在90年代中期，Miller实验室建立了一套方法鉴定晚期基因表达因子（Late gene Expression factor, lef）的方法：具体过程通过构建一个含12个长片段且互相重叠，包含整个病毒基因组文库，以晚期基因vp39和晚晚期基因多角体蛋白基因的启动子为靶启动子，通过缺减其中任一个长片段的方法来鉴定晚期基因表达因子[7]。至目前已经鉴定出12个晚期基因表达因子

[8][9][10][11]，但这一方法仍有一些可待改进之处：①如有些晚期基因表达因子，作用于晚期基因的表达，但它的缺少并不影响晚期基因的表达，即其作用可被替代的晚期基因表达因子就很难鉴定出来；②很难对作用于早期基因启动子的反式因子进行分析; ③很难分析清楚影响晚期基因表达的转录调控途径；④一次参与转染的DNA片断数太多，对操作技术的要求很高，同时片断长度太长，后续操作分析鉴定工作量大。所以从1998年迄今，未有新的晚期基因表达因子鉴定出来[12]。鉴于此，我们从另一个相反的角度出发，建立了一个杆状病毒反式作用因子的全基因组扫描技术体系：即首先建立一个覆盖度至少为杆状病毒全基因组大小6倍以上的随机文库（300～500个质粒）, 同时克隆包含所有杆状病毒极早期基因片断的质粒; 然后将早期或晚期靶基因启动子的报告质粒DNA进行与每个文库质粒DNA或每个文库质粒与极早期基因质粒DNA进行共转染，通过分析启动子的转录活性强度以鉴定反式作用因子。我们选定的杆状病毒为目前研究最为透彻的两个代表种：苜蓿尺蠖核型多角体病毒（Autographa californica Nucleopolyhedrovirus, AcNPV）和家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus, BmNPV）初步选定的靶基因启动子为：解旋酶和DNA聚合酶（DNA polymerase）基因启动子, 是病毒DNA复制的关键酶[13]，亦是早期基因启动子类的代表；gp64基因为出芽病毒（BV）特有的结构蛋白[14][15]、egt基因为杆状病毒基因组中唯一影响宿主昆虫正常生理状态的基因，新近鉴定亦为晚期基因[16],、ubiquitin基因在所有的多角体病毒中均存在，同为晚期基因，它参与病毒的形成, 上述3个基因作为晚期基因启动子的代表进行分析；我们的初步实验证明作用于helicase基因启动子的极早期基因只有IE-1，以晚期基因ubiquitin启动子为目标的反式因子全基因组扫描，鉴定了至少两个新的ORF为晚期基因表达因子，通过对顺式元件增强子的全基因组扫描，发现了新的反式因子――增强子桥式作用模式，因此除用于晚期基因表达因子的功能鉴定外，这一技术体系在理论上适用于所有的顺式元件——反式作用因子的(DNA-Protein)互作研究，亦可应用于具有一定基因组大小的双链DNA植物、动物、人类病毒的相关分子生物学机理研究。

主要参考文献：

1．吕鸿声昆虫病毒分子生物学1998 中国农业科技出版社, 北京

2．吕鸿声昆虫病毒与昆虫病毒病1982 科学出版社，

3．Okano. K, Vanarsdall. AL, Mikhailov. VS, Rohrmann. GF Conserved molecular systems of the Baculoviridae. 2006, Virology. 344:77-87

4. Kost. TA, Condreay J, Jarvis DL. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. 2005, Nature Biotechnology 23:567-575

5. Mikhailov. VS, Rohrmann. GF. Binding of the baculovirus very late expression (VLF-1) to different DNA structures. 2002, BMC Mol. Biol. 3, 14

6.Jakubowska AK, Peters SA, Ziemnicka J, Vlak JM, van Oers MM Genome sequence of an enhancin gene-rich nucleopolyhedrovirus (NPV) from Agrotis segetum: collinearity with Spodoptera exigua multiple NPV. J Gen Virol 2006, 87:537-51.

7. Passarelli AL, Miller LK Identification and characterization of lef-1, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. 1993, J Virol. 67:3481-8.

8.Li Y, Passarelli AL, Miller LK. Identification, sequence, and transcriptional mapping of lef-3, a baculovirus gene involved in late and very late gene expression. 1993, J Virol. 67:5260-8.

9. Morris TD, Todd JW, Fisher B, Miller LK Identification of lef-7: a baculovirus gene affecting late gene expression. 1994, Virology. 200:360-9.

10. Passarelli AL, Miller LK. Identification and transcriptional regulation of the baculovirus lef-6 gene. 1994, J Virol. 68:4458-67.

11. Todd JW, Passarelli AL, Miller LK. Eighteen baculovirus genes, including lef-11, p35, 39K, and p47, support late gene expression. 1995, J Virol. 69:968-74.

12. Rapp JC, Wilson JA, Miller LK. Nineteen baculovirus open reading frames, including LEF-12, support late gene expression. J Virol. 1998, 72(12):10197-206.

13. Xiao QL, Zhang ZF. Identification of functional region of helicase gene promoter in Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus. ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA(生物化学与生物物理学报), 2002, 34:560-564

14. Zhou Ya-Jing, Yongzhu Yi, Zhang Zhi-Fang. Promoter activity in the

baculovirus envelope glycoprotein gp64 gene. ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA(生物化学与生物物理学报), 2003, 35: 18-26

15. Yajing Zhou, Zhifang Zhang. Cetyltriethylammonium bromide stimulating transcription of Bombyx mori nucleopolyhedro- virus gp64 gene promoter mediated by viral factors. Cytotechnology, 2003, 41 :37-44

16. Xing-jia Shen, Yong-zhu Yi, Shun-ming Tang, Zhi-fang Zhang , Yi-ren Li, Jia-lu He. The Ecdysteroid UDP-Glucosyltransferase Gene Promoter from Autographa californica Multicapsid Nucleopolyhedrovirus. Zeitschrift fur Naturforschung C , 2004, 59:749-754

2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

2.1 研究内容

1.高质量杆状病毒基因组DNA随机质粒文库构建技术的完善

在分析病毒基因组大小，基因组结构特性的基础上，通过杆状病毒基因组DNA制备技术的改进、部分酶切技术的可控性提高，高效转化技术的改进，获得高质量的随机DNA质粒文库。针对杆状病毒的两个代表种AcNPV 和BmNPV而言、由于最大的基因pl43（解旋酶）的长度为4kb左右，因此，插入片断的长度在3～5kb之间为宜，覆盖度至少在6倍以上，文库中的独立质粒数目以300～350个为宜，以减少共转染的工作量。

2.DNA高效高通量转染技术及瞬时表达体系的建立和完善

建立和完善高通量、高稳定性的DNA转染技术，在此基础上进行昆虫细胞中的内参质粒的改良，使之更进一步适于在昆虫细胞中的应用，提高荧光素酶报告基因在昆虫细胞中及其后续处理中的稳定性，以提高实验的灵敏度和稳定性。

3.针对早期基因的反式作用因子的杆状病毒全基因组扫描

在已经对作用于早期基因helicase基因启动子的反式作用因子进行了全基因组扫描的基础上，继续对作用于DNA聚合酶基因为代表的早期基因启动子进行反式作用因子的全基因组扫描，以期发现新的反式作用因子。

4.对作用于egt，gp64，ubiquitin为代表的晚期基因启动子进行杆状

病毒全基因组扫描

通过对ubiquitin启动子的病素基因组的全程扫描，初步发现ubiquitin基因的启动子的转录活性在需要极早期基因IE-1存在的基础上，还有赖于其它基因的存在，其中至少有两个ORF可能为新的晚期基因表达因子。在此基础上继续对egt、gp64等晚期基因的启动子进行全基因组扫描，以期发现新的晚期基因表达因子和对上述代表性的晚期基因的“级联”调控途径进行分析，确证它们所依赖的极早期基因和晚期基因表达因子。

5.杆状病毒新的反式作用因子或晚期基因表达因子的功能鉴定和分

析

在前述鉴定的病毒反式作用因子或晚期基因表达因子的基础上，应用定点突变技术、Northern杂交、启动子功能分析、EMSA等技术研究确证其功能，及转录、表达特性及和相应启动子的顺式元件的互作方式等。

6.其它“非启动子”的顺式元件——蛋白质互作方式的研究

在以增强子hr3为代表的顺式元件所进行的杆状病毒基因组的全程扫描发现极早期基因IE-1可以连接桥的方式将位于不同质粒的hr序列作用于相应的启动子上，以此为基础对两个模式种的特征序列进行同样的全基因组扫描，以发现新的顺式元件和反式作用因子。进一步尝试将同样的技术体系应用于其它杆状病毒的分子生物学研究，并为拓展至其它人类、动物、植物的双链DNA基因组病毒的分子生物学研究打下基础。

2.2 研究目标

在已有的对作用于helicase、ubiquitin基因启动子进行全病毒基因组扫描基础上：

①进一步建立和完善杆状病毒反式作用因子的全基因组扫描技术体系，提高鉴定和发现新反式作用因子的效率和发现已知功能基因所具有的新功能的能力；

②对所选定的几个目标靶基因启动子的转录调控途径及所依赖的反式作用因子有一个较为全面的了解；

③鉴定新的影响早期基因和晚期基因表达调控的反式作用因子，研究新发现

的反式作用因子自身的基因表达调控模式及其与靶基因启动子的互作方式的阐明；

④研究“非启动子”顺式调控元件与反式作用因子的互作方式，以期对杆状病毒基因组的表达调控网络有一个更深的认识；

⑤在杆状病毒模式代表种研究方法体系基本成熟的基础上，适当拓展研究领域至其它在生防或经济上有重大价值的害虫杆状病毒功能基因组的研究上，探索应用该体系于其它人类、动物、植物双链DNA基因组病毒的研究。

更进一步探索杆状病毒基因表达调控规律，为杆状病毒表达系统的改进及在基因治疗中的应用提供理论支持。

2.3 拟解决的关键问题

①高效、稳定的共转染技术体系的完善及大通量瞬时报告基因检测体系的完善；

②在晚期基因启动子的全基因组扫描时，防止实验工作量的“指数式”扩增，应充分利用已有的基因表达调控知识，有效地删去基因调控网络中的非重要节点，以有效控制实验规模；

③考虑新建立的实验体系与Miller等建立的实验体系的互补性，以提高鉴定发现新的反式作用因子的概率。

3、拟采取的研究方案及可行性分析。

3.1拟采取的研究方案

本研究拟采用的研究方法包括：杆状病毒基因组随机文库的建立、应用生物信息学的病毒基因组的顺式元件预测及特征序列分析、高效的DNA转染技术、昆虫细胞和虫体的高通量报告基因的瞬时表达系统研究体系、高稳定性及广适性的内参报告基因标定技术、定点突变技术、EMSA技术及Northern杂交技术等病毒功能基因组的研究方法。

3.1.2技术路线

拟采用的具体技术路线如图一所示：

注：1.在经过一轮筛选后，可以从随机文库中筛出有代表性的覆盖全基因组的有代表性的质粒40～50个左右，可极大地节省后续基因启动子地筛选工作量。

2.对于未知全基因组序列性状的病毒基因组，结合全序列测定，亦可有目的

地减少大部分工作量，提高新的反式作用因子的鉴定效率。

图一，杆状病毒反式作用因子的全基因组扫描鉴定技术体系示意

图

3.2可行性分析：

本研究所研究的对象为杆状病毒的两个模式代表种，对它们的全序列测定亦是最早完成的，其分子生物学研究是最为透彻的，积累了丰富的研究基础。Miller

实验室等建立的筛选作用于病毒晚期基因启动子的晚期基因表达因子的技术体

系，为我们进一步改进这一体系提供了很好的实验设计借鉴模式，并为我们建立

这一新体系提供了很好的改进方向和实验过程的完善参照体系。通过前两个相关

国家自然科学基金的资助，在杆状病毒分子生物学研究领域已积累了坚实的研究

基础，所选用的靶基因启动子均已有很好的研究成果积累，主要研究目标的启动

子与病毒因子进行作用的重要顺式元件所在的DNA序列片段均已标定（见申请

者发表文章目录: 7,8,12,16,17）。初步的实验结果亦已证明了这一体系的可行性。

本体系所应用的分子生物学技术均是本实验室已熟练掌握了的，新的技术体系只

是这些已成熟技术的有机集成而已，不存在不可逾越的实验技术难点。

4、本项目的特色与创新之处。

⑴本实验所建立的杆状病毒全基因组反式作用因子扫描鉴定体系是已有的

Miller实验室所创立的体系的有机补充，他们是用扣减病毒全基因组的某个长片

段的方法去鉴定晚期作用表达因子，而我们是在前人工作基础上，通过添加某个

基因组片断的方法去鉴定病毒基因的功能。

⑵本实验的研究体系同时适用于鉴定作用于早期基因启动子和晚期基因启

动子的反式作用因子。

⑶本实验研究体系还可适用于筛选与“非启动子”顺式元件有互作的病毒反

式作用因子的研究。

⑷本实验研究体系潜在的应用面广，应能适用于具有一定基因组大小的人

类、动物、植物的双链DNA基因组病毒的分子生物学研究。

5、年度研究计划及预期研究结果。

5.1年度研究计划：

第一年：筛选覆盖病毒基因组且有一定Over-lapping的DNA质粒文库，

完善高通量的DNA转染技术及报告基因定量检测技术；对已经鉴定的作用于ubiquitin基因启动子的反式基因进行功能鉴定，研究其与ubiquitin启动子的主要顺式元件的互作，进一步完善此一技术体系，着手egt、gp64、DNA聚合酶基因的全基因组扫描。

第二年：将第一年筛选到的反式因子进行功能分析；着手进行非启动子元件的DNA－蛋白质互作分析，着手构建新的杆状病毒DNA全基因组扫描工作。

第三年：全面完成在两个模式杆状病毒中的反式作用因子功能鉴定研究任务，着手研究成果的整理发表，开展新的杆状病毒DNA全基因组扫描所得的研究结果的功能分析、鉴定工作。并进一步开展对其它相宜的人类、动物、植物双链DNA病毒功能基因组研究中，这一方法的可行性研究，为进一步的研究工作打下基础。

5.2预期研究结果：

（1）建立新的杆状病毒全基因组扫描研究新体系，用于鉴定新的作用于病毒启动子的反式作用因子。

（2）在代表性的昆虫杆状病毒基因组中鉴定出至少三个新的反式作用因子，并进行功能鉴定。

（3）通过不同转录时相的关键DNA启动子的反式作用因子鉴定及其以来的转录调控途径的阐明有助于加深了解杆状病毒转录表达调控的分子机理，为新型杆状病毒表达体系的构建及杆状病毒表达体系应用领域的拓展提供理论依据。

（4）在现有的“非启动子”DNA增强子序列和全病毒基因组反式因子扫描的基础上，有望从病毒基因组中鉴定出新的顺式元件调控因子。

（5）发表6～8篇较高水平的研究论文，其中SCI收录4～5篇，争取在本领域有较高影响因子的知名杂志发表论文1～2篇，申请发明专利一项。培养博、硕士研究生4～6名。

（二）研究基础与工作条件

1、研究基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）

研究基础：申请人已经承担过国家自然科学基金两项，分别是关于“杆状病

毒DNA复制机理的研究”及“蜕皮激素调控家蚕核型多角体病毒基因表达的机理研究”，均取得了很好的研究结果，由这两个项目资助已发表的SCI收录论文达13篇，相关的研究成果已获得两项国家发明专利的授权，这一研究课题是以上两个研究项目的研究领域的自然深化和拓展，相关研究技术本实验室已完全掌握，有些技术还是本实验室所能应用并进行改进完善的，杆状病毒反式因子的全基因组扫描这一体系是以前研究结果的集成和综合，技术上已完全可行。两个代表种的高质量杆状病毒DNA基因组文库已构建完成，目标靶基因启动子——报告基因质粒表达均已构建完成，所有的代表性启动子与病毒反式作用因子发生互作的顺式元件所在的启动子DNA序列片段均已标定在一很小的范围，先期应用helicase基因启动子为目标的杆状病毒全基因组扫描研究结果发现并证明只有ie-1基因才是该启动子的主要反式作用因子（研究结果见表一）；针对晚期基因ubiquitin基因启动子的病毒全基因组启动子的扫描结果进行初步分析所得的结果表明：至少有三个ORF是以前未被鉴定的新反式作用因子（晚期基因表达因子），其中两个ORF已通过突变实验验证其功能，通过对顺式元件增强子的全基因组扫描，发现了新的反式因子――增强子桥式作用模式，综上所述，本项目申请已经具备了很好的前期工作基础，通过努力应能得到一系列有新意的研究结论。

表一.针对作用于家蚕杆状病毒helicase基因启动子的反式作用因子的全基因组扫描结果

注：(p) 表示该基因序列为不完全。

2、工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。）

与本项目相关的研究设备我们拥有Millipore公司Milli-Q超纯水装置、超滤器及加压不锈钢灭菌器各一台，Beckman超速离心机，日立低温高速离心机，Beckman液体闪烁计数仪，双光束紫外分光光度计，倒置显微镜，显微操作显微镜，无菌操作台，大型低温操作室，Bio-Rad的快速色谱蛋白分离体系，DNA测序仪，DNA扩增仪（PCR），电泳凝胶干燥系统，小型蛋白电泳、斑点转移系统，多功能电泳图谱数据处理系统，Kodak数码成象分析系统，高性能服务器及大型分子生物学软件，Christ冷冻真空干燥仪，Bio-Rad基因枪，杂交炉等，并拥有家蚕人工饲料的成套饲养设备。实验室现依托于国家投资1.4亿元人民币、新近成立的国家农作物基因资源和基因改良重大科学工程，其中9000万元人民币用于购置大型的生命科学研究设备，拥有成系列的基因组学和蛋白质组学的研究仪器，包括岛津LCMS 2010A 液质联用仪，LC-Packing （黛安）高效毛细管微流液相色谱，安玛西亚AKTA 快速蛋白纯化系统，岛津PPSQ-21A 蛋白多肽测序仪，Beckman P/ACE MDQ 毛细管电泳仪，Bruker Daltonics BioTOF-Q 串联质谱仪，Bruker Daltonics Autoflex 飞行时间质谱仪，Bruker Optics minispec 核磁共振油份分析仪，ABI Prism 7000/Bio-Rad i-cycler 实时荧光定量PCR仪，机器人系统，美国Beckman超速离心机Optima L-XP ，美国Genteon基因型检测仪，SNP遗传多态性分析仪3730，Beckman自动化工作站Biomek，蛋白多肽测序仪PPSQ-21A等大型仪器。进行本研究所需要的各项条件均已具备。

4、承担科研项目情况（申请者和项目组主要成员正在承担的科研项目情况，包括自然科学基金的项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、负责的内容等。）

1．家蚕小分子mRNA、小肽功能以及病原体与宿主相互作用机理研究, 课题编号：2005CB121006(973项目)，科技部，2006-2010，家蚕功能基因鉴定。2．猪瘟基因工程疫苗的研究和高效表达元件的引进，课题编号2003Z88，农业部，2004－2007，负责

5、完成自然科学基金项目情况（对申请者负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录。）

由申请者负责的前一个项目“蜕皮激素调控家蚕核型多角体病毒基因表达的机理研究”（30271007， 2003-2005），已经顺利完成。研究期间，总计发表论文14篇，其中SCI收录论文9篇（8篇由本研究直接资助），累积影响因子在10.0以上、研究成果并被国际顶级杂志自然生物技术引用。获得国家发明专利授权两项；构建新型家蚕杆状病毒表达系统一个，正在申请获得国家发明专利授权；第八届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛二等奖一项；培养毕业博士、硕士各2名，在读博士生3名。在完成该项目基础上，为本研究课题的申请做了大量的预备性研究，本申请项目是前一基金项目的延续。

研究工作总结摘要：蜕皮激素MH对杆状病毒基因表达的作用机理可归结为以下几方面的综合影响：1，MH通过egt基因的调控起作用，从而降低了由于其表达所引起的MH失活所致的影响；2，MH通过提高了病毒全程反式转录因子ie-1的表达和出芽病毒BV的主要结构蛋白GP64的表达从而增加了病毒的复制效率，从而影响了相关基因的表达；3，由于杆状病毒的增殖场所主要在幼虫血细胞内，而昆虫激素可提高血细胞的分裂能力，而对病毒基因和外源基因的表达产生影响；4，MH可能提高宿主的主要发育和生长相关基因的基础转录水平而对病毒复制和基因表达起作用；适量使用外源MH或与保幼激素联合使用可提高外源基因的表达量50－70％。在此基础上我们进一步将领域拓展到了主要激素对宿主发育、变态、滞育密切相关基因的表达调控规律研究上，并取得了很好的进展。研究期间，总计发表论文14篇，其中SCI收录论文9篇（8篇由本研究直接资助），累积影响因子在10.0以上，研究成果并被国际顶级杂志自然生物技术引用。获得国家发明专利授权两项；构建新型家蚕杆状病毒表达系统一项，正在申请获得国家发明专利授权；培养的毕业博士、硕士各2名，在读博士生3名。

在本研究项目资助下2003－2005年发表的杂志论文：

1. Chen, Yin, Zhongze Zhu, Xu’ai Lin, Yongzhu Yi, Zhifang zhang*, Guifang Shen

Overexpression and characterization of appA phytase expressed by recombinant

baculovirus infected silkworm。 Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005 15(3):466-471 SCI 影响因子(2004) 1.663

2. TANG Shunming, ZHAO Qiaoling, YI Yongzhu, ZHANG Zhifang*, and LI Yiren.

Homologous region 3 from Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus enhancing the transcriptional activity of heat shock cognate 70-4 promoter from Bombyx mori and Bombyx mandarina in vitro and in vivo. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2005, 69(5):1014-7. SCI 影响因子(2004) 0.95

3. Ailin LI, Qiaoling Zhao, Shunming Tang, ZhifangZhang*, Shenyuan Pan, Guifang Shen. Molecular phylogeny of the domesticated silkworm, Bombyx mori based on the sequences of mitochondrial cytochrome b genes。Journal of Genetics, 2005, 84(2):101-106. SCI 影响因子(2004) 1.10

4. Xing-jia Shen, Yong-zhu Yi, Shun-ming Tang, Zhi-fang Zhang* , Yi-ren Li, Jia-lu He. Ecdysteroid UDP-Glucosyltransferase Gene Promoter from Autographa californica Multicapsid Nucleopolyhedrovirus. Zeitschrift fur Naturforschung C, 59,749-754,2004, SCI 影响因子(2004)0.715

5. Yin Chen, Bin Yao, Yongzhu YI, Xu’ai Lin, Zhifang Zhang* Guifang Shen.

A constitutive super-enhancer: homologous region 3 of bombyx mori nucleopolyhedrovirus. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004 318: 1039-1044SCI 影响因子(2004)2.90

6. Qingxiang Zhou, Shunming Tang, Yin Chen, Yongzhu Yi, Zhfang Zhang*, Gufang Shen A scaleless wings mutant associated with tracheal system development deficiency in wing discs in the silkworm,Bombyx mori Int. J. Dev. Biol. 48: 1113-1117, 2004 SCI收录SCI 影响因子(2004)1.90

7. Shunming Tang, Yongzhu Yi, Xingjia Shen, Zhifang Zhang*. Yiren Li, Jialu He. Functional analysis of the larval serum protein gene promoter from silkworm, Bombyx mori. Chinese Science Bulletin, 2003 (SCI收录), 48(23): 2611-2615

8. Yajing Zhou, Yongzhu Yi, Zhifang Zhang* Jialu He, Yuanxing Zhang.

Cetyltriethylammonium bromide stimulating transcription of Bombyx mori nucleopolyhedro- virus gp64 gene promoter mediated by viral factors. Cytotechnology, 2003 (SCI收录), 41 (1):37-44 9.Promoter activity in the baculovirus envelope glycoprotein gp64 gene. Zhou Ya-Jing, Yongzhu Yi, Zhifang Zhang* Jialu He, Yuanxing, Xiangfu Wu ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA(生物化学与生物物理学报), 2003(SCI收录),35(1): 18-26 （标注为上一个自然基金资助号）

10．Xing-jia Shen, Yong-zhu Yi, Shun-ming Tang, Zhi-fang Zhang* , Yi-ren Li, Jia-lu He. Characterization of ecdysteroid UDP-glucosyltransferase gene promoter from Bombyx mori nucleopolyhedrovirus. X International Journal of Industrial Entomology, 2004, 8(2): 169-174

11．唐顺明, 易咏竹, 沈兴家,张志芳*. 李奕仁, 何家禄家蚕（苏•菊×明•虎）幼虫血清蛋白基因（BmLSP）启动子特性分析. 科学通报, 2003, 48(21): 2261-2265

12．沈兴家唐顺明易咏竹赵巧玲张志芳* 李奕仁何家禄家蚕、野桑蚕海藻糖酶基因启动子的特性及其滞育激素的转录调节蚕业科学, 2004; 30 (2):147- 150

13．夏爱华张志芳李季生李卫国 * 牟志美柞蚕核型多角体病毒odv-e56基因的克隆与分析蚕业科学, 2005, 31(3) 300-305

14．王霞李轶女赵巧玲杜占军沈中元* 张志芳ApNPV编码的DNA单链结合蛋白基因lef-3的克隆与分析蚕业科学, 2005, 31(2) 145-150

会议论文:

1.TANG Shunming, Zhao Qiaoling, Xu Weihua, Yi Yongzhu, ZHANG Zhifang, LI Yiren & HE Jialu Functional analysis on the promoter activity of the heat-shock-cognate 70-4 gene from Bombyx mori国内/口头报告，《华东六省一市生物化学与分子生物学会-2003年学术交流会》，上海，2003.8.21-22

2.SHEN Xingjia, YI Yongzhu, TANG Shunming, ZHANG Zhifang, LI Yiren, HE Jialu & Wu Xiangfu Functional analysis of promoter activity of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus ecdysteroid UDP-glucosyltransferase gene，国内/口头报告《华东六省一市生物化学与分子生物学会-2003年学术交流会》，上海，200

3.8.21-22 已毕业博、硕士研究生学位论文目录：

沈兴家（博士） BmNPV和AcNPVegt基因启动子特性及家蚕海藻糖酶基因启动子活性的滞育激素调节研究

唐顺明（博士）家蚕、野桑蚕LSP与HSC70-4基因启动子功能特性分析

陈寅（硕士）appA植酸酶基因与纳豆激酶基因的克隆与表达研究

林旭瑷（硕士）半胱氨酸蛋白酶基因的克隆及在家蚕生物反应器中的表达

发明专利：

1、张志芳, 何家禄, 姚斌, 周亚竟, 陈寅, 易咏竹，2004利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法国家发明专利授权号：ZL01 1 27288.0

2、张志芳;何家禄;王厚伟;肖庆利;李卫国， 2005 应用昆虫激素提高昆虫杆状病毒系统外源基因的表达量国家发明专利授权号：ZL 01 1 27289.9

获奖证书：

《利用家蚕生物反应器生产appA植酸酶》获第八届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛二等奖

(一)立项依据与研究内容(4000-8000字)：

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析， 需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和 社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。 附主要参考文献目录） 肝癌是高度恶性的肿瘤之一，患者死亡率高，我国每年死于肝癌的患者占全世界肝癌死亡人数的一半左右。广西是全国肝癌高发区之一，其肝癌死亡率是全国同类肿瘤发病死亡平均值的2倍左右。耐药性是肝癌难以治愈和患者死亡率高的关键原因之一。因此，肝癌耐药性的研究对我区乃至我国肝癌的治疗具有重要意义。 迄今为止，对肝癌等癌症耐药性的研究主要集中在癌细胞自身，其耐药机制主要包括：癌细胞对药物的降解、癌细胞特殊膜蛋白对药物的排除、药物作用靶点质和量的改变、DNA的自我修复，以及癌细胞分泌物对组织液中耐药蛋白的保护等[1-4]。最近的研究还表明，癌症产生耐药性的一个重要原因很可能是存在于肿瘤微环境中的健康细胞尤其淋巴细胞给癌细胞提供了相应的条件，使它能抵抗药物并存活下来[5, 6]。研究人员发现，那些对独立培养的癌细胞有效的药物却对与健康细胞共同培养的癌细胞无明显效果，这说明癌细胞会利用周围环境中的健康细胞来抵抗药物。他们还发现，相邻健康细胞分泌的一种叫做肝细胞生长因子的蛋白与黑色素瘤(一种恶性肿瘤)的耐药性相关，该蛋白目前正被作为药物作用靶点用于黑色素瘤治疗药物的开发研究。 环境变化会引起DNA上5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyl- cytosine，5hmC）

位点的改变，从而引起细胞功能的异常。癌症发生使相邻细胞的生活环境发生明显的改变，这种改变也可能使相邻细胞DNA上5hmC位点发生改变，并进而影响这些修饰位点所在基因的活性和细胞的某些功能[7, 8]。DNA羟甲基化是最近三年来表观遗传学领域研究的新热点，是一种复制后表观遗传修饰，是Tet （Ten-eleven-translocation，10-11易位)蛋白催化5-甲基胞嘧啶（5-methyl- cytosine，5mC）形成5hmC的结果[9, 10]。5hmC的研究由于2009年Tet蛋白这一催化功能的发现而倍受关注[7-11]。5hmC被称为DNA的第6种碱基，它不仅参与DNA去甲基化过程，还具有激活和维持基因表达的作用，在原始生殖细胞、受精卵和干细胞重编程及干细胞多能性的维持等方面也起着重要的作用[7-9, 11-14]。在基因组水平上，5hmC在不同细胞具有不同的稳定表达图谱，在癌组织中5hmC则大量丢失[8, 15]。因此，5hmC在DNA上的分布可提供基因表达调控方面的功能信息，检测5hmC水平和分布，可望成为有价值的癌症诊断和预测手段。 虽然国内外DNA羟甲基化的研究已经倍受关注并取得了一定的进展，但这些研究还主要集中在人和哺乳动物的干细胞、原始生殖细胞、受精卵、神经组织、胚胎组织及癌细胞等病理组织细胞，肝癌等癌症耐药机制方面的研究则多从癌细胞本身的角度进行[8, 9, 12]，本课题组之前也从蛋白、基因和mRNA的角度对肝癌等癌症进行了大量研究[16-27]，但从肝内淋巴细胞分泌蛋白及其基因羟甲基化角度对肝癌耐药机制的研究还未见报道。因此，本立项拟以此作为研究的科学问题，通过研究肝内淋巴细胞分泌的肝细胞癌（最主要的肝癌类型）耐药相关蛋白、该蛋白基因5hmC位点的变化及后者对前者表达的影响和进一步对肝细胞癌耐药性的影响来探讨肝细胞癌的耐药机制。由于肝内淋巴细胞提高癌细胞耐药性的能力既可能是肝内淋巴细胞固有的，也可能是癌细胞诱导获得的，或二者兼而有之，

国自然基金申报书万能模板鉴赏(另外还有5 份经典中标国自然标书全文)

国自然基金申报书万能模板鉴赏(另外还有5 份经典中标国自然标书全文) 以下是国自然申报书写万能模板（来源网络） 报告正文 (一)立项依据与研究内容 1、项目的立项依据 XXX疾病及其研究进展 XXXX疾病(XXXXXX，XXX英文名称)是XXX系统(消化、呼吸、神经等等)常见的一种疾病类型，多数是由于XXXX出现功能紊乱以及XXXX功能失调等所诱发，主要表现为XXXX(临床症状或者临床特征)，致使XXX组织或者器官发生XXXX等症状，可以引起XXXX、XXXX以及XXXX等严重后果。同时，XXXX(该疾病)也是导致其他类XXXX相关疾病的主要原因之一。目前的研究表明，XXX疾病主要是由于XXXX所引起的(或者说跟XXX有关，也可以说关于该疾病的发病机制还没有研究清楚)，对于该疾病的治疗，目前尚没有有效的治疗方法或者药物(或者目前已有药物有哪些不足，存在哪些问题)。 近年来，随着xxxx的改变，我国XXX疾病的发病率呈现逐年上升且年轻化的趋势。大量的基础和临床研究表明，导致XXX疾病的危险因素主要包括：XXXXXX等。其中XXX的失调/XXX功能紊乱/XXXX异常等是引起该疾病的主要原因所在。所以，调节XXXX方面的功能是目前治疗和预防XXXX 疾病发生和发展的主要关注途径。如针对XXX疾病主要动因的药物羟XXXX、XXXX以及XXXX等已经逐渐成为该疾病的主要药物。但是该类药物目前存在XXXX方面的缺点(成本高、副作用大等等)，所以开发新的治疗该类疾病的靶向药物显得至关重要。 注：该部分主要内容是提出临床问题，可以是某一个疾病、或者某一个疾病过程中的一个问题等等，所以该段最好按照以下顺序来写： 1、临床现象 某某疾病是怎么回事(疾病简介)，或者在某疾病的治疗或者发生、发展过程中观察到的某个临床现象。 2、该临床现象的症状、危害及严重性

(一)立项依据与研究内容

（一）立项依据与研究内容 1、项目的立项依据（附主要的参考文献目录） 早在1881年Darwin[1]就曾经指出机械应力对植物的生长存在明显的作用。其实验依据是发现接触豆科植物的根系可以改变其生长方向和数量。由于CO2、O2、温度、光照、水分，以及矿质营养等是植物正常生活中不可替代的因素，缺少这些条件中任何一个，植物都不可能完成其生活史。因此当时的研究主要集中在光合生理、水分生理、营养生理、抗逆性生理等几个方面。使得应力对生长影响的存在一度受到冷落。创导性的先驱工作是由Jaob[2]的研究开始的,他们观察到树木每天受短时间的风吹其纵向生长减弱，横向生长加强。但对这一领域的深入认识是极其缓慢的，原因在于：一.紫外线辐射、光照、温度变化等因素与机械刺激同时作用，往往修饰掩盖了植物对机械刺激的响应或者很难区别植物的生理变化到底是由那个因素引起或起主导作用，二.在野外很难找到无风环境作为对照。近几十年来，人们大量的研究机械应力与植物生长的关系，这些研究不仅包括宏观上的应力影响植物的生长和发育，从组织、细胞和分子水平上为这些宏观上的变化找到了证据，而且从细胞水平上研究了植物感受应力的机理和力信号传递。 一、应力刺激从宏观上对植物生长和发育的影响 应力对植物生长和发育的影响首先表现在应力作用后，植物的生长呈现出促进或抑制现象。Darwin[3]报道用4mg的棉线摩擦植物的卷须，可使其生长和发育发生变化。Pfeffer[4]报道在攀缘植物卷须挂25μg重的东西也可影响其生长。对potted marigold plants 每天进行一次短时间的摇晃，其花期比对照推迟一周，如果每天摇晃两次其花期比对照推迟两周[5]。对豆科植物摇晃3-5天后，尽管其花期明显延迟，但其结实率却没有明显的变化[6]。本实验室也在个体层次上研究了植物幼苗对声波刺激的响应：研究发现应力刺激可以促进苗的生长和分化，采用强度为100dB、频率为1000Hz的声波刺激菊花幼苗15天后，结果刺激组比对照组的鲜重增加12.5%，干重增加9.8%，株高增加5.6%。在人工气候室内对西红柿进行周期性的震荡处理，尽管延迟了花期，但却促进了结实率[7]。王伯初首先提出了应力刺激对植物的生长具有双重效应，本室通过研究也发现声波、机械振

【课题申报】小学综合实践教育的科技与创新课题

小学综合实践教育的科技与创新课题 小学综合实践教育的科技与创新课题 申报课题名称：小学综合实践教育的科技与创新 一、立项依据与研究目的 在信息时代的背景下，科技与创新已经成为推动社会发展的主要动力和核心竞争力。在传统的小学教育中，注重学生的语数外等学科知识教学，但往往忽视了学生科技与创新能力的培养。本课题旨在探索小学综合实践教育中科技与创新的有机结合，通过实践活动提高学生的科技创新意识和能力，培养他们的实践动手能力和创新思维，为其未来终身学习和自主创造的发展打下基础。 二、研究内容与实施步骤 1. 研究内容 本课题将基于小学综合实践教育的教学理念，将科技与创新融入到实践活动中，实施创新教育，培养学生的动手能力、创新能力和团队合作精神。研究内容主要包括以下几个方面： (1) 科技创新教育的理念与方法：通过了解学生的科技创新现 状和需求，研究制定适应小学生的科技创新教育理念和方法。 (2) 科技创新实践活动的设计与实施：结合小学综合实践教育

的特点，设计和实施一系列科技创新实践活动，包括科学实验、创客设计、编程教育等。 (3) 科技创新评价与反馈机制：探索一套科技创新评价机制， 通过量化和定性评价方法，评估学生的科技创新能力和学科综合素养。 (4) 科技创新教师培训与支持：对小学教师进行科技创新教育 培训，提升他们的科技创新意识和能力，支持他们在教学中的创新实践。 2. 实施步骤 (1) 前期调研与课程规划：了解学生的科技创新需求和目前存 在的问题，结合小学综合实践教育的特点，制定科技创新教育的课程规划。 (2) 教师培训与教材编写：组织教师参加科技创新教育培训， 编写相关的教材和教学资源。 (3) 实践活动的设计与实施：结合课程规划，设计一系列的科 技创新实践活动，并组织学生参与实践。 (4) 评价与总结：制定科技创新评价机制，对学生的科技创新 能力和综合素养进行评估，总结实施过程中的经验和问题。 三、预期成果与方案推广

开题报告立项依据

开题报告立项依据 开题报告立项依据 一、研究背景 在科研领域，开题报告是一个非常重要的环节，它是研究项目立项的依据。开 题报告的编写对于研究者来说具有重要的意义，它可以帮助研究者明确研究的 目标、意义和方法，为后续的研究工作提供指导。因此，编写一份完整、合理 的开题报告是每个研究者都需要掌握的技能。 二、研究意义 开题报告的第一个部分是研究意义。在这一部分，我们需要明确研究项目的背 景和意义。研究项目的背景可以包括社会、经济、科技等方面的情况，需要从 宏观角度出发，说明为什么需要进行这项研究。而研究项目的意义则是从微观 角度出发，明确研究项目对学术、实践等方面的贡献。例如，如果我们要研究 某种新型材料的应用，可以从环保、能源等方面来说明研究的意义。 三、国内外研究现状 在开题报告的第二部分，我们需要对国内外的研究现状进行梳理。这一部分的 目的是了解目前国内外在该领域的研究情况，找出已有的研究成果和不足之处。通过对研究现状的了解，我们可以确定自己的研究方向，并避免重复已有的研 究工作。同时，我们还可以借鉴前人的研究方法和经验，提高研究的效率和质量。 四、研究目标和内容 在开题报告的第三部分，我们需要明确研究的目标和内容。研究目标是指研究 者希望通过这项研究达到的预期结果，可以是解决某个具体问题、验证某个假

设或提出某种新的理论。而研究内容则是指具体的研究方向和方法。在这一部分，我们需要详细描述我们将采取的研究方法和步骤，以及预计的研究成果。 五、研究可行性和预期效果 在开题报告的最后一部分，我们需要对研究的可行性和预期效果进行评估。研究的可行性是指我们能否按照预定的研究计划和时间表完成研究工作。我们需要考虑到研究所需的资源、条件和时间等因素，评估研究的可行性。而预期效果则是指我们预计通过这项研究可以达到的效果。我们可以从学术、实践等方面来说明预期效果，并提出相应的评价指标。 六、结语 开题报告是研究项目立项的依据，它对于研究者来说具有重要的意义。通过编写开题报告，我们可以明确研究的目标、意义和方法，为后续的研究工作提供指导。同时，开题报告还可以帮助我们了解国内外的研究现状，找出已有的研究成果和不足之处。因此，编写一份完整、合理的开题报告是每个研究者都需要掌握的技能。通过不断的实践和学习，我们可以提高开题报告的质量，为自己的研究工作打下坚实的基础。

科研项目申请书内容的填写方法

科研项目申请书主要内容的撰写方法 科研人员申报科研项目，通常需要撰写项目申请书。科研项目申请书一般为固定文本格式，申请者在撰写申请书前，应仔细阅读有关的填写说明，避免出错。在工作实践中，蓝译编译通过对各类项目申请书的比较和分析，发现各类项目申报书虽然略有差异，各有所侧重，但主要内容大同小异，通常包括立项依据、研究内容、研究方案等。 一、立项依据。立项依据是指确立项目的科学依据，包括项目的研究意义、国内外发展动态以及相应的主要参考文献。一方面，要明确该问题的解决对推动相关学科有什么样的科学价值，要从学术价值和应用前景的层面上来阐述。其中，是否具有创新意义是关键，应进行充分阐述。此外要表述对科技、经济、社会发展的重要意义或应用前景。 另一方面，申请者对申请项目所涉及研究领域的国内外研究状况应有充分了解，在申请时要对国内外研究现状、学术前沿、进展程度、发展趋势、同行研究的新动向等加以阐述，并附主要的参考文献。参考文献的著录并非简单的拼凑，应是完整说明立项依据的有力辅证，应尽可能是最新的、同行业内较权威的。 二、研究目标、研究内容以及拟解决的关键问题。研究目标说明本项研究最终期望要达到什么目的，是总体的表述与概括。研究内容是研究目标的具体体现与分解，是研究题目的细化与解释，阐明了本项目到底要研究什么具体科学问题。研究内容的撰写必须层次清晰、详略得当，体现有限目标、抓住关键、重点突破、力求创新的要求。

三、研究方案、技术路线及可行性分析。主要是对理论分析、计算、实验方法及步骤的合理性论证，主要阐述实现研究目标的方法、技术、实验手段和关键技术。关键技术和创新技术要描述详细、清晰、明确、具体，必要时加以公式、流程图等直观说明；可行性分析是对研究方案、技术路线是否能顺利进行作一说明，要有理有据，使评审专家相信这个设计的方案或路线是行得通的。 四、项目的特色与创新之处。特色与创新就是不同于别人的东西，主要表现为：具有原创性的新理论、新方法；运用已有的理论方法，研究解决从未有人研究过的新问题，进行开创性研究。撰写时应用词恰如其分而不过分夸张。 五、预期研究进展和研究成果。预期研究进展应是各研究阶段的研究方案、阶段成果与时间进度的综合表述。预期研究成果应现实并突出创新性，包括成果内容、成果形式、成果数量三要素。成果内容，回答在什么问题上或哪几个问题上将取得进展并获得成果；成果形式，说明以什么样载体来反映取得的研究结果，一般包括期刊论文、论文集、学术专著、研究报告、政策性建议，以及计算机软件甚至系统设计等；成果数量，说明涉及到的成果形式的基本数量。

立项依据与研究内容

研究方案书 1.1 研究对象的纳入和分组 1.1.1 研究对象： 1.1.2 诊断标准 以Beard 改进的病理性网络使用诊断标准[1]作为病例纳入标准： 以下1〜5项为必须存在： 〔 1 〕依赖互联网〔不断回想之前的网络活动或期望下一次的网络活动〕； 〔2〕需要增加上网时间以获得满足； 〔3〕屡次努力控制、减少或停止上网，但不能成功； 〔4〕减少或停止上网时会感到焦躁不安，喜怒无常，沮丧或易怒； 〔5〕上网的时间比原本方案的要长。 以下 3 项至少存在一项： 〔 1 〕因上网而阻碍或丧失了重要的人际关系、工作、教育或职业时机。 〔2〕向家人、好友、治疗师或其他人隐瞒陷入互联网的程度。 〔3〕使用互联网作为逃避问题或减轻烦躁情绪〔如无助、内疚、焦虑、抑郁的情绪〕的途径。前5项完全具备，且后3项至少具备其中1项者，那么诊断为PIU 患者。 1.1.3 纳入标准 a符合上述PIU诊断标准； b. 年龄小于等于40岁； c. 已往未经过任何心理和药物治疗； d. 均为右利手； e. 听力、视力均正常，无躯体疾病或其他精神疾病； f. 无fMRI检查禁忌； g. 已签署知情同意书。 注：凡不符合上述任何一条的患者，均不能纳入本项研究。 1.1.4 排除标准

a. 以往患有其它精神疾病或中枢器质性病变； b. 有药物成瘾史； c. 患有严重的心血管疾病、恶性肿瘤等不适于针刺治疗的疾病； d. 对针灸治疗过敏； e. 妊娠、哺乳期妇女； f. 左利手。 注：凡符合上述任何一条的患者，均不能纳入本项研究。 1.1.5 签署知情同意 本研究经成都中医药大学附属医院医学伦理委员会批准通过，入组前将本研究内容及相关要求以书面及口头形式告知被试，取得其同意后，签署知情同意书。 1.1.6 分组 为保证组间均衡性，分组前使用渴求程度量表，对PIU 患者的网络渴求程度进行评分后，采用分层随机化分组的方法，将PIU 患者随机分配到电针治疗组和心理治疗组，每组30 例。另选取签署知情同意的正常健康志愿者30 例，做为正常对照组。 1.2 治疗方法 1.2.1 电针治疗组 取穴：合谷、内关、太冲、三阴交、百会、四神聪，腧穴定位根据中华人民共和国经穴部位国家标准〔GB 12346~90 〕执行。 操作：①消毒：将针刺者手持针部位先用肥皂水洗净，再用75%的酒精消毒；嘱患者 取仰卧位，将针刺穴位皮肤用75%酒精常规局部消毒。②进针：百会穴用25mm〔1寸〕30号毫针平刺0.5〜0.8寸，四神聪用25mm 〔1寸〕30号毫针向百会平刺0.5~0.8寸，合谷、内关、太冲、三阴交用40mm 〔1.5寸〕30号毫针直刺0.5〜1寸，进针后采取提插、捻转，

研究背景和立项依据

（一）立项依据与研究内容 1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键问题来论述其应用前景。附主要参考文献）1.1研究意义 因为喷射混凝土在力学与工艺方面具有一系列现浇混凝土不能比拟的特点和优点，使得它广泛应用于地下工程的支护衬砌和岩土工程的护壁等。一方面，随着隧道施工技术的不断进步，隧道建设逐渐向长大深埋方向发展。深埋长隧道由于其埋深大,穿越的不同地质单元多，因而除了具有一般浅埋隧道的工程地质问题外，还有一系列特殊的比浅埋隧道更为严重的地质灾害问题，其中较为突出的就是高温地热问题。通常，当地温超过30℃时，便称为高地温，隧道工程中若发生高地温问题，一方面将恶化作业环境，降低劳动生产率，并严重威胁到施工人员的生命安全；另一方面将影响到施工材料的选取和混凝土的耐久性，而且由于产生的附加温度应力还将引起衬砌开裂，严重影响隧道的稳定性。另外，随着矿井开采深度的增加，地温随之升高，加上其他热源的放热作用，使得受到高温热害威胁的矿井日益增多。在高温矿井下作业，不但劳动生产率会下降，损害工人身体健康，而且严重威胁井下安全，并易引发灾害和事故。同样，对于其他地下工程或岩土工程也存在相似的热害问题。 喷混凝土在湿热环境条件下施工工艺参数和物理力学指标与常温状态下不同，因此，高地热及高温水（汽）作用可能导致喷射混凝土回弹量增大，后期强度大幅下降等问题。而喷射混凝土作为直接与基层（岩石、混凝土）粘接起支护的结构，其性能和效果直接反映的是本身所发挥的支护作用，而间接上还会影响到防水、隔热以及衬砌混凝土的性能和耐久性问题。所以，喷射混凝土的热害问题势待研究。为了剖析高地温对喷射混凝土的影响机理并找出有效的防治措施，需要从微观机理和宏观性能两方面进行研究。 1.2研究现状及分析

立项依据与研究内容不超过10000字

报告正文 参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。 （一）立项依据与研究内容（不超过10000字） 1、立论依据，包括研究意义、国内外研究现状及分析。需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录。 2、项目的研究内容、研究目标、拟解决的关键科学问题。 3、项目研究特色与创新之处，并说明本项目与重大研究计划中总体目标的关系。 4、拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明） 5、年度研究计划及预期研究结果。 6、国际合作与交流计划安排情况。 （二）研究基础与工作条件 1、与本项目相关的研究工作积累和已取得的初步研究结果。 2、已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括基地的利用情况，如国家实验室、国家重点实验室和大科学工程等。 3、申请人和项目组主要参与者正在承担的自然科学基金和国家其他科技计划项目情况。（需注明计划名称、项目名称和编号、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等） 4、完成自然科学基金项目情况：对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录。

（三）申请人和项目组主要参与者简介（在读研究生除外） 按以下格式填写： 姓名 所在单位及职称， 格式：机构名，院系，职称 例如：北京大学，医学院生物化学系，教授 受教育经历（从大学本科开始，按时间倒排序） 格式：开始年月-结束年月，机构名，院系，学历 例如：1991/09 – 1995/06，北京大学，医学院生物化学系，博士 研究工作经历（按时间倒排序） 格式：开始年月-结束年月，大学，院系，职称 例如：1991/09 – 1995/06，北京大学，医学院生物化学系，教授 主要论著（近5年来已发表的与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况，按以下格式填写） 1、期刊论文：所有作者（通讯作者以“*”标出），论文标题，期刊名称，卷(期), pp起始页码，发表年份 例：郑丹、中国癌症地图解析, 决策与信息，第2卷，第3期, 120-125页，2010 2、会议论文：所有作者（通讯作者以“*”标出），论文标题，会议名称，会议时间，pp起始页码，会议地址，发表年份，说明例：郑丹, 中国癌症地图析, 决策与信息国际会议论文集, 120-125页，北京，2010.04.12-15，大会报告 3、专著：所有作者，专著名称（章节标题），出版社, 总字数，出版年份 例：郑丹，中国癌症地图解析, 科技出版社. 128万字，2010 4、奖励：所有获奖人，获奖项目名称，奖励机构，奖励类别，奖励等级，颁奖年份 例：郑丹，中国癌症地图，国家科技部，国家科技进步奖，二等奖，2010