离子交换柱交换层析法分离氨基酸
离子交换柱层析法分离氨基酸
一、实验原理
离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子具有不同的亲和力（静电引力）而达到分离目的的分离技术。离子交换层析的固定相是离子交换剂，流动相是具有一定pH和离子强度的电解质溶液。
树脂（惰性支持物）上结合了阳离子或阴离子后，可与阴离子或阳离子结合，改变溶液的离子强度则这种离子结合又解离。由于不同的氨基酸在不同的pH值和离子强度溶液中的所带电荷各不相同，故对离子交换树脂的亲和力也各不相同。从而可以在洗脱过程中按先后次序洗出，达到分离的目的。带电荷量少，与交换剂亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量大，与交换剂亲和力大的后被洗脱下来。
本次实验采用的是Amberlite IR-120阳离子交换树脂作为离子交换剂，分离的样品为Asp和Lys两种氨基酸的混合液。在一定的pH下，Asp和Lys的带电情况不同，与磺酸集团的亲和力不同，因此被洗脱下来的次序不一样。将各收集管分别用茚三酮显色后，测定吸光度，从而得到洗脱曲线。
二、实验器材
实验仪器：层析柱、恒流泵、试管*30、吸管、移液枪、烧杯、紫外分光光度计实验试剂：Amberlite IR-120阳离子交换树脂、柠檬酸缓冲液（pH5.3）、0.5%茚三酮、0.1%CuSO4、氨基酸样品（0.005mol/L的Asp和Lys，用0.02mol/L的HCl配制）
三、实验操作记录
1、树脂的处理
干树脂经蒸馏水膨胀，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCl及2mol/L NaOH依次浸洗，每次浸2h，并分别用蒸馏水洗至中性。再用1mol/L NaOH 浸半小时（转型），用蒸馏水洗至中性。
2、装柱前的准备
选择直径1cm，长度15~20cm的层析柱，观察柱底端滤膜是否完好，分别用流水和蒸馏水冲洗干净。
将层析柱垂直装在铁架台上，柱进水口和出水口装上橡皮管，关闭柱底端出口，在柱内注入少许（约1cm高）的洗脱液，打开出水口，排净管内空气后关闭出水口。
3、装柱
向盛有已处理好的树脂的烧杯中加适量洗脱液，用玻棒轻轻将树脂搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心地加至适当高度。倒入速度不要太快，以免产生泡沫和气泡。
待树脂在柱底部有明显沉积（约1cm高）后，缓慢打开出口（或用滴管吸出柱内上层过多的洗脱液），继续加入树脂直至树脂沉积达5cm高。装柱要求连续，
均匀，无文格、无气泡，表面平整，液面不得低于树脂表面，否则要重新装柱。
4、平衡
层析柱装好后，接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以0.4mL/min的流速进行平衡，直到流出液的pH与洗脱液pH相同（约需2~3倍柱床体积）。
5、加样
关闭恒流泵，关闭层析柱底端出口，移去层析柱上端出口塞，缓慢打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时，立即关闭出口。
用移液枪吸取0.5mL样品液沿柱内壁缓慢加入柱中，以免冲坏树脂表面。加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面降至与树脂表面相平处关闭。吸取少量缓冲液冲洗柱内壁数次，加缓冲液至液层3~4cm左右，接上恒流泵。加样时应注意避免冲破树脂表面，避免将样品全部加在某一局限部位。
6、洗脱
以柠檬酸缓冲液洗脱，洗脱流速24mL/h，每管4mL，10min一管（试管收集前提前编号）。
7、测定
分别取各管洗脱液1mL，各加入茚三酮显色剂1mL，混合后沸水浴5min，冷却，各加0.1%CuSO4溶液3mL,混匀，测定。以吸光度值为纵坐标，洗脱液累计体积（每管4mL，故4mL为一个单位）为横坐标绘制洗脱曲线。
四、实验结果
1、吸光度测定结果
0 1 2 3 4 5 6
试剂
/mL
样液—— 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
缓冲液 1.0 ————————————
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.5%茚
三酮
0.1%Cu
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
SO4
0.000 0.015 0.439 0.885 0.041 0.089 0.090
试剂
7 8 9 10 11 12 13
/mL
样液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
缓冲液——————————————
0.5%茚
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
三酮
0.1%Cu 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
SO4
0.101 0.104 0.084 0.138 0.111 0.122 0.094
2、洗脱曲线
按要求绘制洗脱曲线得：
五、分析与讨论
1、由洗脱曲线可大致看出由两个洗脱峰：
第一个峰出现在约12mL时，这个峰形状较明显，峰窄而高，上升和降落都较为陡峭,判断应为Asp的洗脱峰。因为Asp的pI为2.97，pH5.3时Asp带负电荷受阳离子交换树脂的磺酸基团排斥下，优先洗脱出来。由于受到静电排斥力的作用，Asp的洗脱较快且较为集中，故峰形状窄而高。
第二个峰出现在约40mL时，这个峰较为平坦，难以区分。从洗脱曲线可以看出，从20到52mL，吸光度的变化不大，且在48mL处还出现了小起伏，很难判断峰出现在何处。第二个峰应为Lys的洗脱峰，Lys的pI为9.74，pH为5.3时Lys带正电荷，与树脂的磺酸基团亲和力较高，故在通过树脂时，会被树脂吸附。之后在洗脱液的冲洗下逐渐与树脂脱离从而洗脱出来。推测：因为促使Lys 洗脱的只有重力和洗脱液的冲击，而不像Asp那样有静电斥力，所以洗脱较为缓慢，所以峰平坦而不明显，且持续较长时间。
2、本次实验中出峰较晚，第一个峰出现在第三管（其他同学大多出在第二管），且一直收集到第13管都没有观察到吸光度明显下降。说明这次装柱时柱层过长，影响了实验进度。
3、实验改进：在第一个峰基本消失后，可以改用高盐缓冲液洗脱，使吸附在树
脂上的Lys尽快洗脱下来，也许第二个峰会更明显。