氨基酸的纸层析
氨基酸的纸层析
一、实验目的
1、了解纸层析法的使用原理。
2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。
二、实验原理
1、纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团，
滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。
2、所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2），
唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用脯氨酸、甘氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。
分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度
3、Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件
下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。
4、显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最
后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。
三、试剂
1.酸性层析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：2
2.显色储备液：0.4mol/L茚三酮—异丙醇：甲酸：水=20：1：5
3.标准氨基酸溶液（6mg/ml，苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯氨酸Pro、组氨酸His）
4.未知样品液：上述四种氨基酸中的一种或几种混合液（每组任选一样品）
四、实验仪器
样品管毛细吸管
层析缸100ml量筒
50ml烧杯胶头滴管
移液管滤纸：15cm*15cm *1
铅笔直尺
保鲜膜细玻璃棒
电吹风薄膜手套
五、操作步骤
（一）展层剂和平衡溶剂的配制
1．在100ml烧杯中按照体积比正丁醇：88%甲酸：蒸馏水=15：3：2的比例配制展层
剂，建议为45ml：9ml：6ml。
2．取1ml显色贮备液混于展层剂中
3．将混合好的液体放于层析缸中，混匀密闭，静置（展层缸洗净后应除去多余的水，
否则会影响展层溶剂的比例而影响展层。
（二）点样（点样操作应戴上手套，防止样品和滤纸受污染）
1．实验台上铺好保鲜膜，保鲜膜下面可以蘸少量水，使得保鲜膜能与实验台面紧密贴
合，此后所有操作都在保鲜膜上进行，不再赘述。
2．在距平行于15cm长的边2cm处用铅笔轻轻描出一条直线，此为展层起点线，在直线中间每隔2.5~3cm用铅笔轻轻点一个点，共点6个点。
3．将毛细管的一端在酒精灯外焰上灼烧3~6s，毛细管管口变细即可。
4．用毛细管分别蘸取四个氨基酸标准液和待测液，点样于展层起点线的六个点上。点完一次后，用电吹风冷风吹干，再点第二次样。每次点样均要求斑点半径（一般直径不超过5mm）。
5．在标准样下面用铅笔做好标记，记录该点的氨基酸名称。
（三）平衡及展层
1．将点好样的滤纸两侧边缘对齐但不接触，卷成筒形，并用订书机订3~4次，将圆筒固定。
2．将圆筒竖直放入层析缸中，滤纸勿与缸壁接触，盖上盖子（点样点的一端在下，展层剂液面需低于点样线1cm左右）
3．待溶剂前沿线距滤纸末端1~2cm（展层长度10cm，约2小时）时取出滤纸（需戴上手套）用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹干（通风橱进行），
即可见层析斑点。
（四）显色及R f值计算
1．取出烘完的滤纸，估计出斑点的重心，并用铅笔轻轻点出。
2．用直尺测量出斑点中心到展层起点线的距离以及展层液跑出的距离，计算R fx=
（x=1，2…6）
3．将混合样分离出的斑点的R f值与标准样的进行对比，从而认清各斑点的氨基酸种
类，并在滤纸上标明。
六、注意事项
1.实验全程戴一次性薄膜手套，全套实验在铺在实验台上的薄膜上进行。原因：人的皮肤上
含有含氮化合物，而实验台上可能未洗干净残留其他氨基酸，会沾染到滤纸上，对实验产生影响；保鲜膜可以与钟罩边缘进行更紧密的结合，是平衡效果更好。
2.用毛细吸管进行点样时，为保证点样半径足够小，应使毛细管内的液体高度低于1cm，迅
速的点在滤纸上。若管内液体过高，可以先将毛细管的液体点一部分于干净的卫生纸上，降低管内液体高度。
3.在通过移液管添加展层剂时，液体应缓慢放出，避免溅射到滤纸上，移液管拿出时也应该
注意不要碰触滤纸。
4.展层开始时不要使样品浸入展层剂中。
5.吹风机吹干时切记用冷风吹干，以免温度过高使氨基酸变性。
七．实验结果
样品号：A06
Rf（Pro）=4.1/9.9≈0.414
Rf（Phe）=6.45/10=0.645 Rf（Gly）=2.40/10.1≈0.237 Rf（His）=1.60/10.4≈0.154 Rf（6上）=7.20/10.6≈0.679
Rf（6中）=4.70/10.6≈0.443
氨基酸的纸层析法
氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有甘氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画两个圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在上面两个点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。 4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。 7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基
氨基酸纸上层析实验报告
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原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml 无水丙酮，贮于棕色瓶中
纸层析法分离氨基酸实验报告
纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。
在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用 （2）在医药工业的应用
实验四-氨基酸的纸层析法
姓名：郭沈杰年级专业：2012级生物科学同组者：蔡萍萍 学号：12050011012 实验四氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为固定相，它与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（R f值） R f=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。
本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 8、铅笔 9、直尺 四、实验试剂 1、精氨酸、苯丙氨酸、混合氨基酸（精氨酸、苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，在上面相同间隔画3圆点（原圈直径约5mm）。 2、取毛细管3支，分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许，在原圈处点样，样点
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸 目的和要求 掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术(包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量)。学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。 原理 层析法亦称色层分离法、色谱分析法或色谱法。1903年俄国化学家茨维特(M. Tswett)发现用挥发油冲洗菊粉柱时，各种颜色的色素在吸附柱上从上到下排列成色谱，故称“色层分离法”。1931年有人用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高度分辩力，从此引起了人们的广泛注意。自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来，层析技术的发展越来越快，五十年代开始，相继出现了气相色谱和高压液相层析，其它如薄层层析、亲合层析、凝胶层析等也迅猛发展。层析分离技术操作简便，样品用量可大可小，既可用于实验室分离分析，又适用于工业生产中产品的分析制备。现已成为生物化学、分子生物学、生物工程等学科广泛应用而又必不可少的分析工具之一。 根据所用的支持物及其理化性质不同可将层析法分成三类：1. 用固体吸附剂做支持物的称吸附层析；2. 用吸附了某种溶剂的固体物质(如滤纸)做支持物的称为分配层析；3. 用其表面所含离子能与溶液中的离子进行交换的固体物质做支持物的称为离子交换层析。 纸层析所依据的原理是分配层析，故属于分配层析的范畴。 ㈠分配层析 分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而使之得到分离的方法。将分配层析法中的一种溶剂设法固定在一个柱内，再用另外一种溶剂来冲洗这个固定柱，同样可达到将不同物质分离的目的。我们把固定在柱内的液体称为固定相，把用作冲洗的液体叫做流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体物质把它吸牢，这种固体物质本身对分离无作用，对溶质也几乎没有吸附能力，称为支持物。进行分离时由于被分离物质的各组分在两相中的分布不同，因此当流动相移动时，不同组分移动的速度也不相同。易溶于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动就慢，结果得以分离。 显然，分配层析法中不同溶质的分离取决于其在两相(固定相和流动相)间分配系数的不同，分配系数(α)的定义是：α =溶质在固定相的浓度(C S)/溶质在流动相的浓度(C L) 滤纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。滤纸的成份是纤维素，其–OH基为亲水性基团，可吸附一层水或其它溶剂作为固定相(S)。通常把有机溶剂作为流动相(L)。当将溶质样品(被分离物)点在滤纸的一端后，该物质溶解在吸附于支持物上的水分子或其它溶剂分子的固定相中，有机溶剂作为流动相自上而
氨基酸纸层析
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氨基酸纸层析法（验证性） 相关知识 1. 层析法（色谱法）：是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达分离。 2．几种常用的层析法 ①吸附层析 ②离子交换层析 ③薄层层析 ④凝胶层析（凝胶过滤） ⑤亲和层析 ⑥分配层析（适于在水，有机溶剂中都可溶的混合物） 当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，即分配系数。 如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。 3．氨基酸的极性大小及各氨基酸结构 一、实验目的 １．通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法 ２．掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定） 二、实验原理 纸层析法是分配层析的一种，以滤纸作为惰性支持物。层析溶剂（扩展剂）由有机溶剂和水组成。 在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf 值（比移）来表示的。 在一定的条件下某种物质的R f 值是常数。R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、P H 层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。氨基酸、糖、核甘酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。 三、仪器、材料和试剂 仪器：每组学生准备尺子、小剪子或小刀 1．层析缸、培养皿、量筒、小烧杯、长颈漏斗、毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱、层析滤纸、手套 、透明胶带。 实验材料和试剂 1．标准氨基酸溶液 分别配制0.5%的Lys 、Ala 、Ile 、Met 溶液 2．待分离测定的混合氨基酸溶液 ３．显色剂 0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 ４．扩展剂（展层剂）：本实验使用酸溶剂系统 α＝ 物质在溶剂II 中的浓度 物质在溶剂I 中的浓度 R f ＝ 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离
氨基酸的纸层析
氨基酸的纸层析 一、实验目的 1、了解纸层析法的使用原理。 2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。 二、实验原理 1、纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团， 滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。 2、所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH）与氨基（—NH2）， 唯一的不同则在于R基团。因此R基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。本实验采用脯氨酸、甘氨酸，苯丙氨酸，组氨酸，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。 分配系数K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度 3、Rf值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。在一定条件 下，Rf值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。
4、显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最 后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。 三、试剂 1.酸性层析液：正丁醇：88% 甲酸：水=15：3：2
2.显色储备液：0.4mol/L茚三酮—异丙醇：甲酸：水=20：1：5
实验七 氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、?原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1.配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展??用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
实验六 氨基酸的纸层析法
氨基酸的纸层析法 一．目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。
三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。
氨基酸纸层析法
生物医药工程系《生物化学实验》预习报告 姓名刘英学号12104114 专业生物科学班级1班日期2013-9-28 实验名称 氨基酸纸层析法 实验目的1.了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 2.学习纸层析法的操作技术，分析未知样品氨基酸的成分。 实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法，它是分配层析法的一种。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的—OH 基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。纸层析法主要是依据混合组分对二相分配系数的差异进行分离，但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。氨基酸经层析在滤纸上形成距原点不等的层析点，氨基酸在滤纸上的移动速率用R f 表示。 R f = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 只要实验条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变，R f 值是常数，因此可做定性分析参考。如果溶质中氨基酸组分较多或其中某些组分的Rf 值相同或近似，用单向层析不宜将它们分开，为此可进行双向层析，在第一溶剂展开后将滤纸转动90度，以第一次展层所得的层析点为原点，再用另一种溶剂展层，即可达到分离目的。由于氨基酸无色，可利用茚三酮反应使氨基酸层析点显色，从而定性和定量。 仪器及材料（型号、规格、数量 等）层析滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、培养皿、猴头喷雾器、微量加样器或毛细管、吹风机一个、直 尺、铅笔、分光光度计 实验试剂（配制方法、数量多少、 用途）1.混合氨基酸溶液(水解后的氨基酸干粉) 甘氨酸溶液：50mg 甘氨酸溶于5mL 水中。 蛋氨酸溶液：25mg 蛋氨酸溶于5mL 水中。 亮氨酸溶液：25mg 亮氨酸溶于5mL 水中。 氨基酸混合液：甘氨酸50mg，亮氨酸25mg，蛋氨酸25mg 共溶于5mL 水中。 2.展层溶剂 碱相溶剂：正丁醇∶12%氨水∶95%乙醇= 13∶13∶13(V/V) 酸相溶剂：正丁醇∶80%甲酸∶水= 15∶3∶2(V/V)，摇匀后放置半天以上，取上清液备用。
实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。 3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1．蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6 mo叭。盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L一氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2．纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数 层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R f值，借此可以达到定性、鉴别的目的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、时间等都会影响R f值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器 （1）干燥箱 （2）水浴锅 （3）安培瓶 （4）层析缸 （5）吹风机 （6）喷雾器 2．试剂
生物化学实验 氨基酸的纸层析法
实验氨基酸的纸层析法 一、目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、新华滤纸 2、层析缸 3、细线 4、点样管 5、橡皮筋 6、电吹风 7、喷雾器 四、实验试剂 1、混合氨基酸溶液（甘氨酸，苯丙氨酸），甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、试验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不
氨基酸纸层析
实验二氨其酸的纸色谱 一、实验目的 1、学习色谱法分离的原理和类型。 2、学习用纸上层析法进行分离鉴定氨基酸的操作。 二、实验原理 色谱法是利用混合物中各组分在同一物质中的吸附、溶解或者分配性能的不同，使混合物溶液流经该物质，经反复地吸附或分配等作用将各组分分离的一种操作方法。 纸色谱法是属于分配色谱的一种通常用特制的滤纸如新华一号滤纸作固定相（水为支持剂），含有一定比例的水的有机溶剂（展开剂）作流动相，应用于多官能团或高极性化合物如糖或氨基酸的分离鉴定。 圆形纸层析是纸层析的一种。方法是用一张圆滤纸，将样品点在圆心的位置或距圆心而作的同心圆的圆周上，在滤纸中心插一纸芯，使溶剂沿滤纸芯从圆心向滤纸的四周展开，由于样品组分在固定相和流动相之间的分配不同，使得易溶于流动相中的组分，随着溶剂的展开在滤纸上移动得快一些，而在固定相中溶解度大的组分移动就慢一些，因此得到分离（图2-35（1））。 R f值： R f值是表示被分离的物质在层析图谱上的位置。 R f = 原点到层析斑点中心距离/ 原点到溶剂前沿的距离 原点：为点样点的位置 溶剂前沿：展开结束时溶剂达到的位置 层析斑点：展开后，组分所达到的位置 如图1样品中组分一的R f = OA / OC 组分二的R f = OB / OC R f值取决于被分离条件物质在两相间的分配系数和两相间的体积比。在同一实验条件下同一物质R f值是一常数。所以R f值也是判断物质的主要物理常数之一。但影响R f 的因素很多，因此在进行纸层析的操作过程中，必须严格控制条件，否则R f值不易重现。 在圆形纸层析中层析图谱显色后为弧形色带。R f值最大的样品，其弧形色带距原点最远，最小的距原点最近，其余的便按序介于这二者之间。 注：滤纸本身是纤维素，纤维素分子上有许多羟基，羟基具有吸附水分的作用，纤维素的羟基能够和6-7%的水以氢键结合，即使把滤纸烘干，也很难把水分除去，所以滤纸外观上是干的，但实际上是含有水的，把干滤纸放在饱和的湿气之中，能吸附20%左右的水分。 三、实验步骤 取圆形滤纸一张，直径要比用作层析的培养皿大2cm左右。用圆规自滤纸圆心处以1cm 为半径划一圆（划圆时不可折叠滤纸）。将此圆之圆周分成三等分，并在滤纸边缘上对应地每一等分用铅笔标上谷、酪、混字样。 将滤纸平放在干净而干燥的接着皿上。在圆周上每等分之中部，按所标字样分别用干净毛细管小心点上谷氨酸、酪氨酸和混合氨基酸样品水溶液（图2-29（2））。点样时，毛细管中液体要尽量少些，与纸面接触的时间应尽量短些，勿使滤纸上所成圆点的直径超过5mm，每一支毛细管只能沾取一种溶液。用电吹风吹干，或在空气中自然凉干。 取一长2cm，宽1cm的同质料的滤纸条，将其一端剪成条状，卷起来即得纸芯（图2-29（3））。然后在圆滤纸的圆心处穿一小孔。孔之大小恰好使纸芯从滤纸无字的一面插入，
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸 姓名：敖礼贤学号：班级：生物工程 一、前言 、研究意义与前景 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质地差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定地，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中地分布程度不同，从而使各组分以不同地速度移动而达到分离地目地.【】文档来自于网络搜索 纸层析法（）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物地常用技术，可用于蛋白质地氨基酸成分地定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质地一种分离分析工具.纸层析法是用滤纸作为惰性支持物地分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附地水是固定相，展层用地有机溶溶剂是流动相.【】文档来自于网络搜索分配层析法分配色谱系色谱法之一种，利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度地差异来实现分离.分配色谱地固定相一般为液相地溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面.分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡地过程.【】文档来自于网络搜索 、实验目地 （）掌握分配层析地原理，学习氨基酸纸层析法地操作技术（包括点样、平衡、展层、显色、鉴定及定量） （）学习未知样品地氨基酸成分（水解、层析及鉴定）分析地方法. 、实验原理 层析法也称色谱法，是年俄国植物学家发现并命名地.他将植物叶子地色素通过装填有吸附剂地柱子，各种色素以不同地速率流动后形成不同地色带而被分开，由此得名为“色谱法”（) . 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离. 年出现纸层析.以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等. 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质地差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定地，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中地分布程度不同，从而使各组分以不同地速度移动而达到分离地目地.文档来自于网络搜索 按层析过程地机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能地差异，达到分离鉴定地目地. 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间地分配系数不同，使之分离. 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力地不同. 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小地组分阻滞作用地不同 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物地分配层析法，它是利用不同地氨基酸在展层溶剂中地分配系数不同而得以分离地一种方法.惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多地羟基，与水有较强地亲和力因此把它看成是含有静止水相地惰性支持物.水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相.展层溶剂由两个互不相溶地有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了地有机相，另一相是以有机溶剂饱和了地水相.文档来自于网络搜索 分配系数(α)＝溶质在固定相地浓度()溶质在流动相地浓度() 当用滤纸进行分配层析时,流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离.分配层析地原理可用一个模式解释（英国等）：把滤纸看成是一个层析柱，可以分成若干层板，设层板地物质为、；且和地分配系数（α）分别为和；又设固定相为，流动相为，两相互相接触但不相混溶.当第一层流动相中加入一定量地、两项物质后，
实验一 纸层析法分离氨基酸
实验一纸层析法分离氨基酸 一、实验目的 1．掌握纸层析的基本技术 2．学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸 二、实验原理 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法：利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数、经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数： 层析溶剂(亦称展层剂或推动剂)是选用特定的有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力(葡萄糖基的-OH基能与H2O通过氢键相互作用)，能吸附很多水分(可达22%滤纸重，其中约有6%的水与纤维素结合成复合物)，这部分被吸附的水因扩散作用降低而形成固定相。反之，展层剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动 而形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸 入展层剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品 的原点处，使其的溶质依据自身的分配系数在这 两相间不断进行分配，即随着有机溶剂不断向前 移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相 间发生可逆的重新分配，结果使溶质离开原点不 断向前移动。由于溶质中各组分的分配系数不同， 导致前行中出现移动速率差异，因而通过一定时 间的层析，样品中的不同组分即可实现分离。 层析中某物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析时都有其一定的R f值，借此可达到定性、鉴别的目的。应当注意的是，溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸质地以及层析温度和时间等因素都会影响R f值。
三、实验器材 1．实验仪器 培养皿、毛细管、滤纸、喷壶、电吹风 2．试剂 （1）6mol／L HCl （2）若干种氨基酸标准液(l mg/mL)，混合样液 （3）展层剂：正丁醇：80％甲酸：水＝15：3：2 (V/V) （4）0.5％茚三酮溶液 四、实验步骤 1、每人取圆形滤纸一张，将滤纸沿直径对折两次后展开。 2、在折出的四条半径上，离圆心约0.5cm处用铅笔标记出点样点。 3、用毛细管吸取氨基酸样品，置于点样点处，待自然晾干后，重复点样三次。 4、剪一小条长方形滤纸，卷成小纸筒，用剪刀把纸筒一端剪开成细条并压平，用纸筒另一端穿过圆形滤纸的圆心。 5、把纸筒的细条端放入培养皿的层析液中，将培养皿盖好，静置约30min。 6、打开培养皿，取出圆形滤纸，立刻标出扩展剂外沿。 7、用电吹风把圆形滤纸吹干。 8、用喷壶在圆形滤纸表面均匀喷洒显色剂，完全吹干后显色。 五、实验结果 1、计算各标准氨基酸样品的R f值 2、与标准氨基酸的R f值对照，确定混合样品中含有哪些氨基酸。 六、注意事项 1、点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。 2、点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。 3、展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 七、思考题 1、为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？ 2、该实验中有哪些因素可能会影响到氨基酸的层析效果？
氨基酸的薄层层析_实验报告
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别：第四实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称氨基酸的薄层层析 实验日期2015-11-09 实验地点第四实验室 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1．掌握薄层层析法的一般原理。 2．掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术，包括制板、点样、层析、显色。 3．掌握如何根据样品的移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（本实验中即氨基酸混合液）。 二、实验原理 1．薄层层析法：本实验将硅胶作为固相支持物，羧甲基纤维素钠作为黏合剂，两者的混合物作为固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相展开溶剂在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样、不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，混合液中的氨基酸可以彼此分开。 2．硅胶吸附薄层层析的特点：层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关，故涂布操作前必须保证平板足够干燥。硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离，故混合氨基酸样品中的氨基酸组分均为中性或酸性
氨基酸。硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高，故活化过程中的烘干温度控制在70℃左右。 3．氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。（氨基酸显色反应的化学方程式参见下图） 4． Rf值鉴定混合氨基酸中含的氨基酸种类：层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法 1．实验材料 1.1样品： （1）氨基酸标准溶液：0.01mol/L丙氨酸，0.01mol/L精氨酸，0.01mol/L甘氨酸（2）混合氨基酸溶液：以异丙醇作为溶剂将0.01mol/L丙氨酸，0.01mol/L精氨酸， 0.01mol/L甘氨酸按等体积制成混合溶液 1.2试剂： 硅胶、0.5%的羧甲基纤维素钠、展层-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）
氨基酸的测定--纸层析法
【实验目的】 1. 学习氨基酸纸层析法的基本原理 2. 掌握氨基酸纸层析的操作技术 【实验原理】 层析分离技术是利用被分离的混合物中各组分物理化学的性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相（流动相和固定相）中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。 纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rat e of flow, Rf）来表示。所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值： 物质的移动速率以 R f 值表示： Rf=原点至层析点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离=X/ Y 在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。 【器材与试剂】 （一）器材 1. 层析缸 2. 点样毛细管 3. 小烧杯 4. 培养皿 5. 量筒 6. 喷雾器 7. 吹风机（或烘箱）8. 层析滤纸（新华一号）9. 直尺及铅笔 (二) 试剂 1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液) 2. 氨基酸溶液 3. 显色剂:茚三酮溶液 【实验步骤】 1.准备滤纸:在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，间隔2㎝作一记号。 2.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在标记的位置上，点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在 0.3cm 之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次,重复2～3次。 3.扩展：层析缸中加入30ml扩展剂，将缝成筒状的滤纸直立其中,采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端 1 cm 时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。用铅笔描出溶剂前沿界线，吹干。 4.显色：滤纸表面均匀喷上茚三酮溶液，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤纸用热风吹干或置烘箱中（100℃）烘烤5min。 5.结果:用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 R f 值，与标准氨基酸的 R f 值对照，确定混合物中含有哪些氨基酸。 计算：各种氨基酸的Rf值。 注意事项：
纸层析法分离氨基酸
纸层析法分离氨基酸 一、目的 1．掌握纸层析的基本技术 2．学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸 二、原理 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法：利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数、经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数： 层析溶剂(亦称展层剂或推动剂)是选用特定的有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力(葡萄糖基的-OH基能与H2O通过氢键相互作用)，能吸附很多水分(可达22%滤纸重，其中约有6%的水与纤维素结合成复合物)，这部分被吸附的水因扩散作用降低而形成固定相。反之，展层剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动而形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入展层剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在这两相间不断进行分配，即随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，结果使溶质离开原点不断向前移动。由于溶质中各组分的分配系数不同，导致前行中出现移动速率差异，因而通过一定时间的层析，不同组分即可实现分离。 层析中物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析时都有其一定的R f值，借此可达到定性、鉴别的目的。 应当注意的是，溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸质地以及层析温度和时间等因素都会影响R f值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器、材料 干燥箱水浴锅层析缸培养皿毛细管镊子层析滤纸2．试剂 （1）6mol／L HCl （2）若干种氨基酸标准液(l mg/mL)，混合样液 （3）展层剂：正丁醇：80％甲酸：水＝15：3：2 (V/V) （4）0.5％茚三酮溶液 四、操作步骤 将层析滤纸平铺在桌面上，用直尺和铅笔在距滤纸底边2 cm处轻划一条平行于底边的直线作为基线，沿基线以一定的间隔做标记以指示各标准氨基酸样和混合样品的加样位点。 用毛细管吸取少量氨基酸样品分别点于标记的加样位点上(记录各标准样和混合样位置)。点样时毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在0.3~0.5 cm。用吹风机稍加