高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤：

1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。

液相色谱法简介【我要发表论文】

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作者： dujinx 正文

气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。

在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论与技术，在70年代初建立了高效液相色谱分析法（以HPLC表示）。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着载液（流

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动相）流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（<10μm）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的载液流速，使用了高压；输液泵，使流速达到1~10mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏

度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以业逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。

高效液相色谱法的分类与经典液相色谱法一致。按固定相的聚集状态不同分为液固色谱法和液液色谱法。按分离原理不同分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶色谱法四类。

高效液相色谱所用基本概念：保留值等色谱分析有关术语，以及分配系数、分配比、塔板高度、分离度、选择性等方面均与气相色谱相一致；高效液相色谱所用基本理论：塔板理论与速率理论也与气相色谱一致。因液相色谱以液体代替气相色谱中的气体作流动相，则速率议程H=A+B/μ+Cμ。式中：纵向扩散项（分子扩散项）B/μ对板高的影响与气相色谱不同，由于液相色谱中组分分子在流动相中的扩散系数Dm仅为气相色谱中的万分之一，因此纵向扩散项对板高的影响可以忽略不计。于是影响液相色谱的主要因素是传质项Cu。由图14—可知，气相色谱（GC）的流动相流速u增大时，板高H显着增大（即柱效显着降低），而液相色谱（LC）的流速增大时，板高增大不显着（即柱效降低不显着）。这说明高效液相色谱也有很高的分离效能，此外，气相色谱的载气权数种，其性质差别也不大，对分离效果影响也不大。而液相色谱的载液种类多，性质差别也大，对分离效果影响显着。因此流动相的选择很重要，并且在选择流动相对应注意以下几点：流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。

高效液相色谱不但具有高效、高速、高灵敏度的特点，还由于它的流动相（载液）种类比气相色谱的流动相（载气）多，因此可选用两种或多种不同比例的液体作流动相，从机时可提高选择性。此外，液相色谱的馏分比气相色谱易于收集。便于为红外、核磁等方法确定化合物结构提供纯样品。

由于高效液相色谱法具有以上特点，它适于分离、分析沸点高、热稳定性差、分子量大（大于400）的气相色谱法不能或不易分析的许多有机物和一些无机物，而这些物质占化合物总数的75~80%。因此它已广泛用于核酸、蛋白质、氨基酸、维生素、糖类、脂类、甾类

化合物、激素、生物碱、稠环芳烃、高聚物、金属螯合物、金属有机化合物以及多种无机盐类的分离和分析。

但是，高效液相色谱的固定相的分离效率、检测器的检测范围以及灵敏度等方面，目前还不如气相色谱法。此外对于气体和易挥发物质的分析方面也远不如气相色谱法，因此高效液相色谱法和气相色谱法配合使用可互相取长补短，相辅相成。

1．分离原理

凝胶色谱，又称空间排阻色谱。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作

用也不同而进行分离、分析的方法。

凝胶色谱的分离要理和其它色谱法不同，它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。色谱柱内填充具有一定大小孔穴的凝胶。当样品进入色谱柱后，不同大小的样品分子（图14—2中以黑点表示）随流动相沿凝胶颗粒（图14—2中以空心圈表示）外部间隙和凝胶孔穴旁流过，体积在的分子因不能渗透到凝胶孔穴里而得到排阻，因此较为顺利地通过凝胶柱而较早地被流动相冲洗出来。中等体积的分子产生部分渗透作用，小分子可渗透到凝胶孔穴里去而受阻滞，因有一个平衡过程而较晚地被流动相冲洗出来。这样，试样组分基本上按分子大小受到不同阻滞而先后流出色谱柱，从而实现分离

目的。

光凝胶色谱采用水溶液作流动相进，称为过滤凝胶色谱（HFC），而用有机溶剂为流动相时，称为凝胶渗透色谱（GPC）。

2．固定相

凝胶色谱的固定相凝胶，是含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，是一种经过交联而具有立柱网状结构的多聚体。

根据凝胶的交联程度和含水量的不同，分了软质、半硬质和硬质三种。软质凝胶（如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等）交联度低，膨胀度大，容量大，可压宿，不能用于高压（使用压力低于3.5kg/㎝2或更低），主要用于含水体系的常压凝胶色谱，半硬质凝胶（如苯乙烯一二乙烯基苯交联共聚凝胶），容量中等，渗透性较高，压力可用到70kg/㎝2。适用于非水溶剂流动相；硬质凝胶（如多孔硅胶、多也玻球等），膨胀度小，不可压缩，渗透性好，可耐高压，适于高流速下操作。

3．流动相

在凝胶色谱中，为提高分率效率，多采用低粘度、与样品折光指数相差大的流动相。常用的流动相有苯、甲苯、邻二氯苯、二氯甲烷、1，2一二氯乙烷、氯仿、水等。

岛津液相色谱仪注意事项【我要发表论文】

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作者：孔桂昌正文

1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。

2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。

3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。

5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。

6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。

7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。

8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。

9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。

10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。

11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。

12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。

以上是我参考了相关资料，并结合在安装使用液相色谱仪中的经验得出的，可能存在某些片面性，如有不当之处请多提宝贵建议。

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作

安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。

4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省

Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

高效液相色谱仪的使用及运行性能测试

高效液相色谱仪的使用及运行性能测试 实验目的 1.了解高效液相色谱仪的基本原理和结构。 2.掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。 3.掌握测试高效液相色谱仪运行性能的指标和方法，验证各部件及整机的性能。 实验器材 高效液相色谱仪，LC-ATvp高压泵、SCL-10Avp程序控制器、SPD-M10Avp二极管阵列检测器、CTO-10Asvp温度控制器。Shim-packVP-ODS C18 150×4.6mm分析柱、20μl进样器、AS3210型超声波发生器。无水甲醇和双蒸水各500ml（脱气处理）、萘、咖啡因（均为色谱纯或分析纯）。 实验原理 高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 仪器描述 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。LC-2010和Agilent1100型为单泵型，适于单一流动相的洗脱；LC-10Avp型为双泵型高效液相色谱仪，适于程序洗脱。单泵型高效液相色谱仪的结构示意见图9-1。 实验步骤 （一）高效液相色谱仪的基本操作步骤（以岛津LC-10A为例） 1.依照顺序开机，自检完毕后进入操作模板； 2.设定洗脱程序、检测器的条件及测定报告； 3.完成实验过程，打印试验结果，依照顺序关机。 （二）性能测试

高效液相色谱仪的性能检查分为单个部件的验证和整机验证。验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。验证目的是检查并确认高效液相色谱仪运行性能是否符合要求。 1.验证标准 按照中华人民共和国国家计量检定规程，高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准见表9-1。 表9-1 高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准 验证部件验证项目合格标准 输液泵流量设定值误差Ss 0.5ml.min-1: < 5%； 1.0ml.min-1: < 3% 2.0 ml.min-1: < 2% 流量稳定性误差SR 0.5ml.min-1: < 3%； 1.0ml.min-1: < 2% 2.0 ml.min-1: < 2% 柱温箱柱温箱设定值误差ΔTs< ±2℃柱温箱控温稳定性Tc ≤1℃ 自动进样器进样量准确度误差≤±2% 检测器基线噪声≤2×10+5AU 最小检测浓度≤1×10-7g.ml-1(萘的甲醇溶液) 基线漂移≤5×10-4AU.h-1 整机性能定性测量重复性误差RSD≤0.5% 2.验证步骤 （1）输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定 将仪器的各部分联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.0mL.min-1，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表16-2设定相应数值，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，称重。按式(1)、式(2)计算SS和SR，结果填入数据记录与处理的表9-3中。 表9-2 流量、次数、收集时间表 流量设定值（mL/min）0.5 1.0 2.0 测量次数 3 3 3 流动相收集时间（min）10 5 5

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。

三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果

高效液相色谱仪使用注意事项[1]全解

岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法

高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（ 3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；

(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查； (3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2．漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：

高效液相色谱仪操作三要点

高效液相色谱仪操作三要点 高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC 也已成为不可或缺的分析仪器。和其它分析仪器一样，你若想让HPLC 很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。但要是总结归纳一下，最重要的有三点：脱气、过滤和冲洗。本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC 分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。 一、脱气 流动相脱气对于避免HPLC 系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC 系统内是不希望有气泡存在的。HPLC 泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS 不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE 管）渗透进 流动相中。如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种： 1. 吹氦脱气法。 利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa 压力下，以约60 mL/min 流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L 氦气通过1L 流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。 2. 加热回流法。 此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。 3. 抽真空脱气法。 此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa 即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。4. 超声波脱气法。

高效液相色谱使用方法

面。 8、设Flow：5ml/min，单击OK。 9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pumpcontrol选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。 10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击PumpControl选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭 Purgevalve。 11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setuppump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。 12、单击泵下面的瓶图标，如图所示（以二元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。 （二）数据采集方法编辑： 1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项，如上图所示选中 除“Dataanalysis”外的三项，单击Ok，进入下一画面。 2、方法信息： 在“MethodComments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。 单击Ok进入下一画面。

3、泵参数设定：（以二元泵为例） 在“Flow”处输入流量，如1ml/min，在“SolventB”处输入70.0，(A=100-B)，也可Insert一行”Timetable”，编辑梯度。在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 单击Ok进入下一画面。 4、自动进样器参数设定： 选择合适的进样方式，如图所示，进样体积1.0ul，洗瓶位置为6 号。“StandardInjection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功 能。“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。 点击Ok进入下一画面。 5、柱温箱参数设定： ●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度，并选中它，点击”more>>”键，如图所示，选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。 ●点击ok进入下一画面。 6、VWD检测器参数设定： ●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长，如254nm， 在”Peakwidth(Responsetime)”下方点击下拉式三角框，选择合适的响应时间，如 >0.1min(2s)。

waters 2695 高效液相色谱仪操作规程

Waters Alliance 高效液相色谱仪操作规程 一、概述 1.设备使用范围：主要用于样品中食品添加剂、农药残留、兽药残留、毒素、污染物、非法添加物测定。 2.设备主要技术/性能指标： 四元溶剂混合支持等度和梯度应用，具有11个独特的梯度曲线。自动混合持术能够以任何比例混合四种溶剂。先进的溶剂分配功能。串联流路具有无脉冲溶剂分配，无需使用湿润器。在线溶剂脱气和溶剂自动压缩实现准确的流路。集成的密封清洗实现稳定操作，并且所有溶剂类型均符合规格。 检测器包括光电二极管阵列、示差折光检测器。 二、使用要求 1.存放环境温度10～30℃，湿度≤80%，电压220V。 2.流动相和纯水应用微孔滤膜过滤（纯有机相或含一定比例有机相的用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的用水系滤膜）。一次制得的纯水或缓冲盐流动相应在连续24小时内使用完，如未使用完也应弃去不用，并重新配制新鲜的流动相。如需使用，应重新过滤。流动相的pH值应在色谱柱填料允许的范围内。该泵带有真空脱气机，可不超声，但要在泵电源开启后，等脱气机停止工作后（约需5分钟）再进行泵的其它操作。 3.流动相禁止使用氯仿、三氯（代）苯、亚甲基氯、四氢呋喃、甲苯等；慎重使用四氯化碳、乙醚、异丙醚、酮、甲基环己胺等，以免造成对柱塞密封圈的腐蚀。 三、操作程序 A：开机步骤 1.打开计算机，进入Windows界面。 2.打开仪器电源，待仪器各部分自检完成。 3.将2695泵密封垫清洗管路、洗针管路以及ABCD管路分别放入适当的溶剂。

4.Prime seal wash：按2695面板Diag键，选择Prime SealWash，清洗泵头，直至 出口管有液滴流出，按Halt，停止Prime，再按close关闭界面。。 5.Prime needle wash：再选择Prime NdlWash，清洗进样针1-2次,直至黄管有液体喷出。Close并Exit，退出Diag界面。 6.Dry Prime：按2695面板Menu/Status键,再按Direct Function键做Dry Prime (注: 此操作仅在管路中没有液体时执行,否则直接进入步骤6)。 7.Wet Prime：按2695面板Menu/Status键,再按Direct Function键做Wet Prime，5mL/min分别冲洗当天实验需要使用的管路各2分钟。 8.Purge Injector：按2695面板Menu/Status键,再按Direct Function键做Purge Injector，灌注注射器一次。 B：新建方法 1.运行Empower3软件，用户名：system，密码：manager。 2.点击“Run Samples”选择存放数据文件的项目“project”和仪器系统，进入样 品采集界面，确认仪器通讯正常。 3.按“edit method set ”按钮，建立方法组，设置仪器方法。 4.在右下方仪器方法下拉菜单中，选取设置好的仪器方法，按“monitor”按钮，观 察基线，待基线平稳，按停止按钮,可准备进样。 C：样品分析 1.将样品放入2695样品盘中，记录每一个样品对应的位置号。 2.Empower软件中，先单进样一次，若条件合适，确定运行时间。 3.在“samples”状态编辑样品表，开始自动进样。 D：数据处理及打印 1.在Empower3软件中运行“Browse Project ”，在“Channel”表中打开数据，建 立处理方法。 2.用建立好的处理方法处理数据。 3.在“Results”表中选择要打印的结果，选择“Report method ”，打印数据。

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项 一、操作步骤： 1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能） 注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。 3.排气结束后，关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。 注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同） 4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。 二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。 注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。

高效液相色谱仪验证方案

高效液相色谱仪验证文件 …年 （设备编号：…..）

…………………有限公司 目录 1验证方案的起草与审批 2概述 3验证目的 4再验证人员 5验证支持性文件 6相关文件检查 7仪器状态检查 8运行确认

9性能确认 10再确认 1验证方案的起草与审批1.1验证方案的起草 1.2验证方案的审批

2概述： ?设备名称：高效液相色谱仪 ?设备编码：………. ?规格型号：…………… ?制造商：……………….. 本高效液相色谱仪主要由四元泵、一个柱温箱、一个可变紫外检测器、一个自动进样器和一台………..工作站组成，各部分由工作站软件控制。 本仪器主要用于分析原料和成品的有关物质和含量。 为验证本仪器性能的稳定性，确认本仪器在检验工作中的准确性，特安排本次验证。

3验证目的： 3.1设备安装状态检查：检查设备各部件完整无损，电源稳定可靠，安装环境符合要求， 确认仪器经过校正合格且在有效期。 3.2运行确认：确认仪器的各种控制功能与性能符合要求；在正常运行情况下，确认高 压泵的流速，柱温箱温度控制和自动进样器等符合要求；确认电脑及工作站权限使用设置与运行，数据处理稳定可靠。 3.3性能确认：以………检测为例，证明高效液相色谱仪系统适应性，….检测的线性及 重复性等性能符合要求 4 5验证支持性文件 本方案依据下面列出规的有关条款，结合本公司需求制定。以下规为有效的最新文本，设备所提供的性能及参数应能满足以下规的有关要求。 ?《高效液相色谱仪计量检定规程》JJG 705-2002 ?《液相色谱仪标准操作程序》 ?《高效液相色谱仪使用说明书》 ?《药品GMP指南》 ?《中国药品检验标准操作规》 6相关文件检查 6.1检查确认

U3000高效液相色谱仪操纵制度及封面

安徽省产品质量监督检验检验研究院仪器设备 操作规程 （cg———2016） 设备编号（） 仪器名称U3000 液相色谱仪操作规程 编制 审核 批准 2016 年月日

U3000高效液相色谱仪操作规程 一基本原理 U3000高效液相色谱系统由：①输液泵②自动进样器、③色谱柱温箱、④检测器、⑤数据处理系统组成。 使用高效液相色谱时，液体待检测物由流动相带入色谱柱，通过压力在色谱柱中移动，由于试样中各组分在色谱柱内固定相与流动相间分配或吸附特性的差异，不同的物质组分顺序离开色谱柱，经检测器检测得到不同的色谱峰信号，依据组分的保留时间和响应值（峰面积或峰高）进行定性和定量分析。

二操作前准备 1.1流动相的配制： 1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。 1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜（0.45um）还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。 1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。1.2对照品供试品处理： 1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），使其浓度为 0.1~1mg/mL（根据检测结果再适当调节溶液的浓度）。 1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜（0.45um）还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。 1.3色谱柱的选择：根据样品的性质选择适当的色谱柱。 三操作顺序 1.开机

2.1打开UPS（不间断电源）电源，打开仪器接线板电源开关； 2.2打开电脑显示器电源，打开电脑主机电源（POWER），启动电脑； 2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源； 2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动,等显示“本地仪器控制器运行空闲”,可以关闭界面。 2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标（工作站主程序）。 2.6在左下方点击仪器，则在右边会自动显示该仪器控制面板。 2.7旋开泵上的排液阀(两圈以上)；设置A通道为100%，点击“冲洗”，然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”；（默认冲洗5分钟）；然后分别“冲洗”流路中其他通道气泡；排完气泡后关闭排液阀； 2.8设置流动相的比例及流速后，点击“马达”。此时泵自动会以设置的流速进行运行。

高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总

高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总 1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。 6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7. 设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9．填写登记本，由负责人签字。 10．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 11．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 12．所有过柱子的液体均需严格的过滤。 13．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。 选择波长要从以下几个方面考虑： 1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。

高效液相色谱法测定手册

高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱仪检定规程

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LC-10AD型高效液相色谱仪检定规程 1.适用范围 适用于岛津LC-10AD型高效液相色谱仪的检定。 2.职责 检验员：严格按照检定规程进行周期检定。 QC主管：监督检查检定规程执行情况。 3.检定项目和技术要求 3.1.输液系统 3.1.1.泵流量设定值误差：Ss＜±2%；流量稳定性误差：＜±2% 3.1.2.定性测量重复性误差（5次定量管进样）：RSD≤1.5% 3.1.3.定量测量重复性误差（5次定量管进样）：RSD≤1.5% 3.2.紫外检测器性能 3.2.1.可调波长紫外—可见光检测器波长示值误差：＜±2nm；重复性误差：＜±1nm 3.2.2.基线漂移：≤5×10-3（AU/h）；基线噪声：≤5×10-4(AU) 3.2.3.最小检定浓度（静态）：4×10-8g/ml（萘的甲醇溶液） 4.检定条件 4.1.环境温度为10～30℃，8小时内温度波动不超过±3℃，相对湿度低于65%。 4.2.电源电压：220±22V，电源频率：50±0.5Hz。 4.3.检定设备 4.3.1.秒表：分度值小于0.1s。 4.3.2.分析天平：最大称量200g，最小分度值0.1mg。 4.3.3.容量瓶 4.3.4.微量注射器 4.3. 5.标准物质和试剂 5.检定方法

5.1.泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的检定。 将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为液动相，按表1设定流量，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集10～25分钟，称重，按下式计算Ss和S R。 Ss=（Fm—Fs）/Fs×100% S R=（Fmax—Fmin）/F×100% 式中Ss为流量设定值误差（%）； Fm=（W2—W1）ρt·t为流量实测值； W2：容量瓶+流动相的重量（g）； W1：容量瓶的重量（g）； Fs：流量设定值（ml/min）； ρt：实验温度下流动相的密度（g/cm3）； t：收集流动相的时间（min）； S R：流量稳定性误差（%）； Fmax：同一组测量中流量最大值（ml/min）； Fmin：同一组测量中流量最小值（ml/min）； F：同一组测量中的算术平均值（ml/min）。 5.2.定性、定量测量重复性的检定 将仪器联接好，使之处于正常工作状态，用进样阀的定量管注入适当的标准溶液（萘或联苯）或稳定的待分析样品溶液，记录保留时间和峰面积，连续测量5次，按下式计算相对标准偏差RSD。 RSD= [Σ（Xi—X）2]/（n—1）×1/X×100% 式中，RSD为定性、定量重复性的相对标准偏差； Xi为第i次测得的保留时间或峰面积；