DNS-氨基酸的制备和鉴定-
DNS-氨基酸的制备和鉴定
实验目的
1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理
2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法
实验原理
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下：
图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：
图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH
在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH
2
，即：
图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH
2
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH
2
产生蓝色荧光，可彼此区分开。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。
实验器材
1.聚酰胺薄膜（7×7cm）
2.电吹风一个
3.紫外灯一台
4.点样管（4支）
5.吸管
6.量筒
7.烧杯（500ml）8.铅笔
实验试剂
1.DNS-Cl丙酮溶液
2.展层液： V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100
3.氨基酸样品：标准Gly、Phe、His溶液
4.混合氨基酸溶液
实验操作
1.DNS标记：
取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul，再各加入30ulDNS-Cl丙酮溶液，混合均匀后置于37℃水浴中1小时；
2.点样：
在距聚酰胺薄膜底端1cm处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm，，重复2-3次，最多不宜超过5次；
3.展层：
1)配制展层液(V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100)100ml，可两个小组共同配制使用；
2)将展层液置于培养皿盖（加12-13ml）或底（加10ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜用皮筋
套上可使其站立后放入展层液中，盖上500ml烧杯；
3)待展层液上升到距顶端大约0.5cm时展层结束，将其取出，冷风吹干；
4.透射：
将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出。
注意事项
1.严格控制点样位置以及点样直径，点样时直径不宜超过2mm，不宜点在边缘，点样后马上用吹
风机冷风吹干，重复2-3次以保证点样量足够，点样不能太用力，防止聚酰胺薄膜断裂而影响展层；
2.展层液要现配现用，需混合均匀，用量既不可不足，又不可过量而导致把点样点没过；
3.展层后必须经电吹风将膜吹干；
4.使用紫外照射时要注意使用时间短。
实验结果
1.下面是我在本次试验中所得到的聚酰胺薄膜，由于实验中第一次点样过大，所以将聚酰胺薄膜
的左下角与其它区域分割开，以免影响展层结果。从左到右依次为丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）和混合氨基酸。
2.Rf值计算：
注：X为色斑中心至原点中心的距离，Y为溶剂前缘至原点中心的距离,其中Y值均相同为5.10cm。
在混合氨基酸中：
1.对于丙氨酸：X=
2.62cm,Rf=2.62/5.10=0.51
2. 对于苯丙氨酸：X=0.95cm，Rf=0.95/5.10=0.19
各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。
分析总结
从实验结果分析可得以下几条结论：
1.由实验原理可知，氨基酸的氨基与DNS-Cl反应后是黄绿色荧光。而Lys含有两个氨基，因
此L ys带有两个黄绿色荧光标记。又由于DNS-Cl主要与α-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys的δ-氨基反应后的DNS-Lys。
2.DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在
最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。
3.聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离
氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。导致所展示的层析结果。
4.展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展层液
与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有较大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。
5.从实验结果分析可得：混合氨基酸中应同时含有丙氨酸和苯丙氨酸两种。
实验中可导致误差出现的几点：
1.在聚酰胺薄膜上点样时用力过大，很可能会使聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导
致心形黄绿色荧光斑出现，我在点样时就出现这种情况，导致混合氨基酸的荧光斑的其中
一个出现心形；
2.点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影响实验结果，因严格控制点样点
的大小，最好不要超过2mm；还有点样时应重复2-3次，防止点样液成分不足；
3.点样时若两点之间间隔过小，也会影响实验结果，本次实验宜控制在1cm左右。
思考题
聚酰胺薄膜层析法中对层析液有什么要求，层析液应具备什么特点？
就拿本实验来讲，聚酰胺薄膜层析法在分析氨基酸时展层液应具备以下特点：
1.能不同氨基酸形成不同程度的氢键，保证展层过程的顺利完成；
2.展层速度快，单层层析（7×7cm）一般只需15-20min；
3.不会将氨基酸或者聚酰胺薄膜破坏，影响实验结果。
影响Rf值的主要因素
1.物质结构对于Rf值的影响：
极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。
2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：
这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。
3.pH对Rf值的影响：
这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。
4.滤纸对Rf值的影响：
滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。
5.温度对 Rf值的影响：
Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。温度对Rf 值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以 Rf值也改变。一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±0.5℃。
各种氨基酸的生产工艺
各种氨基酸的生产工艺 1、谷氨酸 (1)等电离交工艺方法——从发酵液中提取谷氨酸，即将谷氨酸发酵液降温并用硫酸调PH值至谷氨酸等电点(pH3.0- 3.2)，温度降到10 以下沉淀，离心分离谷氨酸，再将上清液用硫酸调pH至1.5上732强酸性阳离子交换树脂，用氨水调上清液pH10进行洗脱，洗脱下来的高流分再用硫酸调pH1.0返回等电车间加入发酵液进行等电提取，离交车间的上柱后的上清液及洗柱水送去环保车间进行废水处理。 该工艺方法的缺点是：废水量大，治理成本高，酸碱用量大。 (2)连续等电工艺——将谷氨酸发酵液适当浓缩后控制40℃左右，连续加入有晶种的等电罐中，同时加入硫酸，控制等电罐中PH值维持在3.2左右，温度40℃进行结晶。 该工艺方法废的优点是：水量相对较少；缺点是：氨酸提取率及产品质量较差。 (3)发酵法生产谷氨酸的谷氨酸提取工艺——谷氨酸发酵液经灭菌后进入超滤膜进行超滤，澄清的谷氨酸发酵液在第一调酸罐中被调整pH值为3.20～3.25，然后进入常温的等电点连续蒸发降温结晶装置进行结晶，分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和母液，将一部分母液进入脱盐装置，脱盐后的谷氨酸母液一部分与超滤后澄清的谷氨酸发酵液合并；另一部分在第二调酸罐中被调整pH值至4.5～7，蒸发、浓缩、再在第三调酸罐中调pH值至3.20～3.25后，进入低温的等电点连续蒸发降温结晶装置，使母液中的谷氨酸充分结晶出来，低温的等电点连续蒸发降温结晶装置排出的晶浆被分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和二次母液。(4)水解等电点法 发酵液-----浓缩（78.9kPa，0.15MPa蒸汽）----盐酸水解（130 ℃，4h ）----过滤-----滤液脱色-----浓缩-----中和，调pH至3.0-3.2（NaOH或发酵液） -----低温放置，析晶-------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省 (5)低温等电点法 发酵液-----边冷却边加硫酸调节pH4.0-4.5-----加晶种，育晶2h-----边冷却边加硫酸调至pH3.0-3.2------冷却降温------搅拌16h------4 ℃静置4h------离心分离 --------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省 (6)直接常温等电点法 发酵液-----加硫酸调节pH4.0-4.5-----育晶2-4h-----加硫酸调至pH3.5-3.8------育晶2h------加硫酸调至pH3.0-3.2------育晶2h------冷却降温------搅拌16-20h------沉淀2-4h-------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、操作容易、生产周期短、酸碱用量省。 2、L-亮氨酸 （1）浓缩段 原料：蒸汽 将一次母液通入浓缩罐内，通入蒸汽，温度120度，气压-0.09Mpa，浓缩时间6h，结晶。终点产物：结晶液（去一次中和段） （2）一次中和段 辅料：硫酸，纯水 结晶液进入一次中和罐，通入硫酸，纯水，温度80，中和时间4h，过滤 终点产物：1，滤液（回收利用）2，滤渣（去氨解段）
DNS-氨基酸的制备和鉴定
生命科学学院 Life Science College 生 物 化 学 实验报告 姓名：柳伟雄班级：2013级生科一班学号：201300140062 同组者：曾玮璠
山东大学实验报告2015年3月18日 姓名：柳伟雄系年级：生科一班2013级同组者：曾玮璠 科目：微生物实验题目：DNS-氨基酸的制备和鉴定仪器编号： 一、目的和要求 1. 了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理 2. 掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法 二、原理 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸 DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman 法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
纸层析法分离氨基酸实验报告材料
纸层析法分离氨基酸 一、前言 纸层析法 纸层析法又称纸色谱法，是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。它是一种以纸为载体的色谱法。固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开。当组分移动一定距离后，各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点。将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其他适宜方法确定斑点位置。根据组分移动距离(Rf值)与已知样比较，进行定性。用斑点扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量(如光度法、比色法等)。 纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有
机溶溶剂是流动相。 在环境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC应用普遍。 做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎，浸出绿色液体，将液体与层析液(石油醚)混合，将滤纸一段进入混合液体，四种色素在层析液中的溶解度不同，在滤纸上留下4条色素带。由此观查出各种色素的相对含量和种类。 纸层析法一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢;含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。 氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。随着生物工程技术产业的发展逐渐成为2l世纪全球的主要产业之一，氨基酸的需求量越来越大，品种变更越来越快，工艺改革越来越新。目前全世界氨基酸每年的产量为100万吨，而需求总量是800万吨。我国自20世纪60年代起，氨基酸的应用在食品工业占61,，在饮料工业占30,，医药、日用化工、农业、冶金、环保、轻工、生物工程技术等方面占用的比例逐年增加。 氨基酸在人类生活的很多方面都有着应用: （1）在食品行业的应用
DNS-氨基酸的制备和鉴定-
DNS-氨基酸的制备和鉴定 实验目的 1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理 2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法 实验原理 荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下： 图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。 DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即： 图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH
在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH 2 ，即： 图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH 2 DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH 2 产生蓝色荧光，可彼此区分开。 DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。 实验器材 1.聚酰胺薄膜（7×7cm） 2.电吹风一个 3.紫外灯一台 4.点样管（4支） 5.吸管 6.量筒
氨基酸发酵
第一部分基础练习 一、名词解释 1.末端产物阻遏：是指由某代谢途径末端产物的过量累积时而引起的反馈阻遏，是一种较为重要的反馈阻遏。 2.分解代谢物阻遏：是指细胞内同时存在两种碳源(或两种氮源)时，利用快的那种碳源(或氮源)会阻遏利用慢的那种碳源(或氮源)的有关酶合成的现象。 3.代谢调控:在发酵工业中，为了大量积累人们所需要的某一代谢产物，常人为地打破微生物细胞内的自动代谢调节机制，使代谢朝人们所希望的方向进行，这就是所谓的代谢调控。 4.营养缺陷型菌株因基因突变致使某一合成途径中断，丧失合成其生长中必需的某种物质的能力，使末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈抑制或调节，可使代谢途径中的某一中间产物过量积累，也可使分子代谢的中间产物和另一分支途径中的末端产物积累。 5.外源诱导物：抗生素生物合成过程中，参与次级代谢的酶，有些是诱导酶，诱导物有的是外界加入的，称外源诱导物。 二、问答题 1.答：氨基酸生产方法主要有合成法与发酵法两种。 2.答：野生型菌株，营养缺陷型突变株，或是氨基酸结构类似物抗性突变株. 3.答：氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制和在合成途径分枝点处的优先合成，除此之外，还有一些特殊的调节机制，如协同反馈抑制、合作（或增效）反馈抑制、同功酶控制、顺序控制、平衡合成、代谢互锁等。 4.答：在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸合成分支上的第一个酶——二氢吡啶合成酶（DDP合成酶）受到与本途径无关的另一种氨基酸——亮氨酸的阻遏（即代谢互锁）。 5.答：具有分子代谢途径的分支点。即在分支合成途径中，分支点后的两种酶竞争同一种底物，由于两种酶对底物的Km值（即对底物的亲和力）不同，故 两条支路的一条优先合成。 第二部分技能训练 一、选择题 1.D 2.C 3.D 4.B 5.B 6.A 7.C 二、问答题
氨基酸的制备.
氨基酸的制备方法 几乎所有的氨基酸分离纯化工艺均利用了氨基酸在不同的 pH 值时电荷量不同这一特性。氨基酸的分离纯化方法主要有:沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、膜分离法及结晶法等。 1、沉淀法 沉淀法是最古老的分离、纯化方法,目前仍广泛应用在工业上和实验室中。它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法,特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。 1.1利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀法 在生产中常利用各种氨基酸在水和乙醇等溶剂中溶解度的差异, 将氨基酸彼此分离。如胱氨酸和酪氨酸在水中极难溶解, 而其它氨基酸则比较易溶; 酪氨酸在热水中溶解度大,而胱氨酸则无大差别。根据此性质,即可把它们分离出来, 并且互相分开。另外, 可以利用氨基酸的两性解离有等电点的性质。由于氨基酸在等电点时溶解度最小, 最容易析出沉淀, 所以利用溶解度法分离氨基酸时, 也常结合等电点沉淀法。 1.2特殊试剂沉淀法 某些氨基酸可以与一些有机或无机化合物结合, 形成结晶性衍生物沉淀, 利用这种性质向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀剂, 使目标氨基酸与沉淀剂沉淀下来, 达到与其它氨基酸分离的目的。较为成熟的工艺有:揩氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下, 可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸, 分离这种沉淀, 用盐酸水解除去苯甲醛, 即可得精氨酸盐酸盐; 亮氨酸与邻一二甲苯一 4一磺酸反应, 生成亮氨酸的磺酸盐, 后者与氨水反应得到亮氨酸; 组氨酸与氯化汞作用生成组氨酸汞盐的沉淀,再经处理就可得到组氨酸。
实验七 氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 ●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 ●层析溶剂由有机溶剂和水组成 ●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值） 来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因
素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1 cm)。待溶剂上升15―20 cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5．显色用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6．计算各种氨基酸的Rf值。 四、结果与分析
分子生物学名词解释
弱化子是指原核生物操纵子中能显著减弱甚至终止转录作用的一段核苷酸序列，该区域能形成不同的二级结构，利用原核生物转录与翻译的偶联机制对转录进行调节。 分子伴侣是一类序列上没有相关性担忧共同功能的保守性蛋白质，它们在细胞内能帮助其他多肽进行正确的折叠、组装、运转和降解 基因家族在基因进化过程中一个基因通过基因重复产生两个或更多的拷贝，这些基因构成一个基因家族，是具有显著性的一组基因，编码相似的蛋白质的产物。 操纵子是指原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控元件组成的基因表达单元。 重叠基因具有部分公用核苷酸序列的基因，即同一段DNA携带了不同蛋白质的编码信息。重叠的序列可以是调控基因，也可以是结构基因的部分。 基因重排是指将一个基因从远离启动子的地方移到距启动子很近的地方从而启动转录的方式。 看家基因（管家基因）在个体的所有细胞中持续表达的基因。 复制子单独复制的一个DNA单元被称为一个复制子，它是一个可移动的单位。一个复制子在任何一个细胞周期只复制一次。 逆转录以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录过程与遗传信息的流动方向相反，故称为逆转录。逆转录过程是RNA 病毒的复制形式之一，需逆转录酶的催化。 沉默突变（同义突变）是指碱基的改变不引起氨基酸改变的突变。 同工tRNA指几个代表相同的氨基酸，能够被一个特殊的氨酰—tRNA合成酶识别的tRNA. 无义突变在DNA序列中任何导致编码氨基酸的三联密码子转变为终止密码子的突变，它使蛋白质合成提前终止，合成无功能的或无意义的多肽。 端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，作用是保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期。 核心启动子是指保证RNA聚合酶II转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点上游 -25 ~ -30bp处的TATA区。 切除修复DNA损伤的一种修复机制，直接切除受损伤的一条DNA片段，以其互补链为模板新合成DNA来取代切除的受损片段。 错配修复是对DNA错配区的修复。通过母链甲基化原则找出区分母链与子链从而修正子链上错配的碱基。 转座子能够在没有序列相关性的情况下独立插入基因组新位点上的一段DNA序列，是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位。参与转座子移位及DNA链整合的酶称为转座酶。 密码的简并由一种以上密码子编码同一氨基酸的现象，对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子。 基因组一个细胞或病毒携带的全部遗传信息或整套基因，包括每一条染色体和所有亚细胞器的DNA序列信息。顺式作用元件是指启动子和基因的调节序列，主要包括启动子、增强子和沉默子。 DNA有义链DNA分子两条链中只有一条具有转录功能叫做模板链或反义链，无转录功能的链叫做编码链或有义链，这个基因的有义链可能是另一个基因的反义链。 -35序列23.-10序列在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。顺反子功能基因，意为通过顺式及反式试验所确定的一个遗传学单位。 核酶是一类具有催化活性的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性的剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。 比较基因组学在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因和基因结构进行比较，了解基因的功能、表达调控机制和物种进化过程的学科。 SD 序列存在于原核生物起始密码子AUG上游7~12个核苷酸处的一种4~7个核苷酸的保守片段，它与168-rRNA 3'端反向互补，所以可以将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。根据首次识别其功能意义的科学家命名。 基因敲除针对一个序列已知但功能未知的基因，从DNA水平设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制，从而推测该基因的生物学功能 冈崎片段是在DNA半不连续中产生的长度1000—2000个碱基的短的DNA片段，能被连接形成一条完整的DNA 链 C 值反常. 也称C值谬误，指C指往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必要的联系，某些较低等的生物C值却很大。 弱化子是指原核生物操纵子中能显著减弱甚至终止转
氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离（纸层析法） 一、实验原理 1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。 操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在滤纸上的移动速率用值表示： 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，值是常数，故可根据值作定 性依据。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。 三、实验试剂 1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2 2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。 戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色
氨基酸的分离与鉴定
实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法 目的要求 （1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。 （2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。 原理 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。 溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示： 溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。 本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。 试剂和器材 一、试剂 （1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。 （2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。 （3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。 （4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38 硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。 正丁醇（需重蒸），95%乙醇，88%甲酸，12%氨水（因氨易挥发，稀释前需测出毕重）。 0.5%茚三酮丙酮溶液。 二、器材 新华中速薄层析滤纸，层析缸（高约430mm，直径约290mm，具有磨口盖子），鼓风恒温箱，国产72型分光光度计，水浴锅，喷雾器，电吹风机，点样架，点样管，加溶剂的漏斗，针、线和尺子，橡皮（或线）手套，结晶皿。
30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备汇编
专利 中文 英语 查找前案 讨论此申请 查看PDF PDF 下载 公 CN103163226 A 开 号 发 布 申请 类 型 专 利 申 CN 201110417088 请 号 公 2013年6月19日开 日 申 请 2011年12月14日日 期 优 2011年12月14日先 权
日 公开号201110417088.3, CN 103163226 A, CN 103163226A, CN 201110417088, CN-A-103163226, CN103163226 A, CN103163226A, CN201110417088, CN201110417088.3 发 明 者 刘丽宏, 李鹏飞, 李丹, 张绪得, 陶蓓蓓 申 请 人 刘丽宏, 李鹏飞, 李丹 导 出 引 文 BiBTeX, EndNote, RefMan 被以下专利引用(4), 分类(2), 法律事件(3) 外部链接: 中国国家知识产权局, 欧洲专利数据库 (Espacenet) 30种氨基酸同时定量检测方法及试剂盒制备 CN 103163226 A 摘要 本发明提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒及其制备方法。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇衍生化处理，吹干复溶后，采用C18键合相硅胶为固定相，以含七氟丁酸和甲酸的乙腈水为流动相进行反相色谱梯度分离，运用质谱仪进行定量检测。本发明的试剂盒，测试灵敏度可达到10ng/ml，各项方法学指标均可满足氨基酸临床检验、工业生产和科学研究等定量需要。 权利要求(8) 1.一种高灵敏30种氨基酸同时定量检测试剂盒，其特征在于由特定浓度的稳定同位素内标样本、质控样本、衍生化试剂、流动相调节液组成。
实验七-氨基酸的分离鉴定
实验七-氨基酸的分离鉴定
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法 一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
●层析溶剂由有机溶剂和水组成 ●物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值） 来表示的： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1. 配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20 mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样
氨基酸生产工艺
氨基酸生产工艺 主讲人：韩北忠 刘萍 氨基酸是构成蛋白成分 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。 氨基酸 α 碳原子分别以共价键连接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。 氨基酸的用途 1. 食品工业： 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。 2. 饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 3. 医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 4. 化学工业：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。 氨基酸的生产方法 发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。 生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡。 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品, 1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原
实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
实验六蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。 3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1．蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6 mo叭。盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L一氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2．纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数 层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以R f值表示： 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R f值，借此可以达到定性、鉴别的目的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、时间等都会影响R f值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器 （1）干燥箱 （2）水浴锅 （3）安培瓶 （4）层析缸 （5）吹风机 （6）喷雾器 2．试剂
氨基酸提取与制备
氨基酸提取与制备 发布时间:2006/12/20 16:03:00 文章来源:科技文献 氨基酸提取与制备 氨基酸的生产方法有4种：经典的提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶法。提取法是最早发展起来的，是生产氨基酸的最基本方法。所谓提取法是指蛋白质或以含有蛋白质的物料为原料，经酸、碱、或酶水解以后提纯氨基酸的方法。早期提取法是建立在溶剂抽提、等电点结晶和沉淀剂分离的基础上。随着离子交换树脂的应用，使氨基酸的分离更为容易，简化了提炼工序，缩短了操作时间，提高了氨基酸收率。提取法的优点是原料来源丰富，投产比较容易，但产量低，成本高，三废较严重。在国外多数氨基酸生产已逐步为微生物发酵法及化学合成法所取代。在目前4种生产方法中，发酵法生产占主导地位。酶拆分法也占相当地位。化学合成法倾向于氨基酸衍生物的制备。提取与分离是氨基酸生产的基本技术。无论何种方法均有分离纯化工序。即提纯也是提高氨基酸质量的关键步骤之一。目前仍有一定数量品种如半胱氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸、组氨酸、亮氨酸用提取方法生产，且占主要的地位。对于中国来说，具有丰富动物资源的角、骨、血、蹄、皮、毛发、羽毛及鱼鳞等，有待充分利用。目前已综合利用的有人发、猪血、猪毛、羊毛、丝素丝胶、皮革边料、蚕蛹巢丝、水产品下脚料等。 提取法生产氨基酸主要经过3个步骤。即蛋白质水解、氨基酸提取分离及结晶精制。 氨基酸的生物活性及应用 氨基酸是构成蛋白质的基本单元，也是合成机体抗体，激素和酶的原料，在人体内有特殊的生理功能，是维持生命现象的重要物质。氨基酸以肽键结合而存在于各种功能与结构不同的蛋白质分子中。蛋白质是生命的基础物质，它对机体的生长、维持、防御及生理功能极为重要。 迄今，氨基酸及其衍生物的品种超过100多种。广泛地应用于食品、饲料、化工、农业及医药等方面。氨基酸作为药物在医疗保健事业中是一类占有重要地位和充满希望的分支。 由于人们对氨基酸广泛参与机体正常代谢和许多生理机能的认识不断加深，氨基酸代谢紊乱与疾病的关系以及在防治某些疾病中的重要作用等，愈来愈被人们所瞩目。众所熟知，氨基酸对处于蛋白质—能量营养不良（Protein-Enerey Malnutrition, PEM)状态病人的营养支持，早日康复，降低发病率与死亡率，具有非常重要的意义。目前，随着中国肠外和经肠营养支持疗法的推广应用，氨基酸如同维生素、激素一样，已成为现今临床治疗上不可缺少的药品。 氨基酸作为某些疾病的治疗药物以及作为合成多肽类药物的中间原料，应用也较广泛。至今已能工业生产的多肽类药物有谷胱甘肽（3肽）、促胃液素（5肽）、催产素（9肽）、抗利尿素（9肽）、ACTH（24肽）及降钙素（32肽）等已用于临床。 此外，利用氨基酸与母体药物结合制成的前体药物，近几十年来发展也很快。它们可以改善药物的理化性质和稳定性，改善药物吸收提高血药浓度增进药物疗效，降低副作用与毒性。目前临床上广为应用或正在开发中的这类药物很多。例如阿司匹林赖氨酸或精氨酸、茶碱赖氨酸、硫霉素甘氨酸、甲硝唑氨基酸酯以及非甾体抗炎药物（如消炎痛、布洛芬、酮基布洛芬、萘普生、二氯灭酸、炎痛喜康等）的赖氨酸或精氨酸盐等。 肠外输入纯氨基酸混合液或经口（包括管饲）氨基酸混合物，均可为机体利用。不过，无论经肠或肠外投给的氨基酸制剂，都必须符合营养学的要求，这样才能达到以氨基酸作为合成体蛋白的“构件”的目的，否则必有部分氨基酸作为能源利用，同时增加尿素的排泄。 为达到良好的蛋白质营养，必须同时供应充足而且组成平衡的各种氨基酸与能量，使细胞可以进行各种蛋白质的生物合成。在合成过程中，需要21种氨基酸（其中不包括甲基组氨酸及羟脯氨酸）。就人类营养来讲，其中8种（有称9种）为必须氨基酸（即体内完全不能合成或合成速率不能满足最适生长需要而必须由食物蛋白供给的氨基酸），其他为非必需氨基酸（即体内可从必需氨基酸或其他代谢物转变而成的氨基酸）。近年发现，几种非必需氨基酸在某些情况下也是必需的或必要的。 当摄入一种完全的氨基酸混合物后，肝细胞内的蛋白质合成十分旺盛；如其中缺乏一种必需氨基酸，则合成趋于停止。在肠外营养时，已证实同时输注色氨酸与不含色氨酸的酪蛋白酸水解液，可获得正氮平衡；如将二者分开输注，则为负氮平衡。由引可见，必需氨基酸在蛋白质营养中的重要性。 此外，各个氨基酸之间的相互作用也极其复杂。所谓平衡的氨基酸模式系一种氨基酸组成，其间产生不利的相互作用应为最低。这方面将涉及以下3个问题。
氨基酸的鉴定
氨基酸的鉴定——纸层析法 171850044钱诗晨 一、实验目的 掌握纸层析法的基本原理。 通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并不学会分析未知样品中的氨基酸组分 二、实验原理 1、层析法又称色谱法（Chromatography），是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等。 分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用Rf值来表示： 在一定条件下，物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。 三、实验试剂 1.酸性展层剂——正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2
氨基酸合成
氨基酸，核苷酸及相关分子的生物合成 PART 1. 氨基酸及相关生物分子的合成 氨代谢概述 氮气通过固氮作用变成氨 20种氨基酸的生物合成 其他由氨基酸衍生的生物分子的合成 氮循环 氮可通过固氮酶复合物来固定 ?固氮作用：在固氮生物中将氮气转化为氨 ?Cyanobacteria (蓝绿藻, photosynthetic) ?rhizobia (根瘤菌, symbiont 共生生物) ?硝化作用：进入土壤的氨被氧化成为硝酸盐而获得能量的过程。 ?反硝化作用：细菌通过在厌氧条件下将硝酸盐转化为氮气来实现固定的氮和大气中的氮的平衡的过程。 ?固氮复合酶的关键成分是二固氮酶还原酶和二固氮酶。固氮是通过一个具有高度还原状态的二固氮酶催化及摄 取8个电子而实现的，其中6个电子用于还原氮气，2个电子用于产生1分子的氢气。且要求还原酶水解ATP 用于还原二固氮酶。固氮过程中ATP起着催化作用而不是发挥热动力学效应。 氨通过谷氨酸和谷氨酰胺渗入到生物分子中 谷氨酸通过转氨作用为其他大多数氨基酸提供氨基，谷氨酰胺中的酰胺氮也是大多数生物合成中氨基的来源。?将氨根离子吸收进谷氨酸的最重要的两个途径： ?首先是谷氨酸和氨离子在谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）催化下合成谷氨酰胺的反应。 ?在细菌和植物中，由谷氨酰胺经谷氨酸合酶（glutamate synthase）催化反应得到。 谷氨酰胺合成酶是氨代谢中一个主要的调控点 ?这种酶含有12个相同亚基，并且可以通过别构作用（allosterically）和共价修饰（covalent）进行修饰。 ?谷氨酰胺合成酶的别构调节 ?这酶受至少八种别构因子的累积性抑制，多数是谷氨酰胺代谢反应的产物。 ?谷氨酰胺合成酶的共价修饰 ?细菌中谷氨酰胺合成酶的Tyr残基能可逆的被腺苷酰化，这种共价修饰提高了别构抑制剂的敏感度。 ?腺苷酰化酶对变构抑制剂更敏感。 ?谷氨酰胺合成酶的AMP基团的添加和去除是被腺苷酰基转移酶（adenylyltransferase，AT）催化的。 ?腺苷酰转移酶的活性可通过结合到一种称为P II 的调节蛋白质上而进行调节。 ?共价修饰的机制： ?P II 是一种调节蛋白，它的活性是被P II 的一个Tyr残基的尿苷酰化共价修饰所调节的。腺苷酰转移酶复合物（AT）与尿苷酰化的P II 结合可引起谷氨酰胺合成酶去腺苷化，激活谷氨酰胺合成酶活性，而AT与脱尿苷酰化的P II结合则可以引起谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化，抑制谷氨酰胺合成酶活性。 ? P II 的尿苷酰化和脱尿苷酰化都是由尿苷酰转移酶(uridylyltransferase)催化的 。 氨基酸的合成 ?几种反应在氨基酸和核苷酸的生物合成中担当重要角色，值得注意：?含有辅因子吡哆醛磷酸的酶催化的转氨反应和重排反应 ?利用四氢叶酸或S－腺苷甲硫氨酸为辅因子的一碳单位转移反应 ?谷氨酰胺中的酰胺氮的转氨基作用： 转移谷氨酰胺的氨基的反应是由谷氨酰胺转酰胺酶催化的。 这种酶有两个结构域，其中一个结合谷氨酰胺，另一个结合作为氨基受体的第二个底物。
实验七氨基酸的分离鉴定精修订
实验七氨基酸的分离鉴 定 标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]
实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 二、原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。 惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。 展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。 分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。 当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。 不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移 值）来表示的：
Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 三、材料与方法 （1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮 （2）操作步骤 1.配置层析液置于密闭的层析缸中。 2．准备滤纸：取层析滤纸一张。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。 3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。干后再点一次。 4．扩展?用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1cm)。待溶剂上升15―20cm时即取出滤纸，铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5．显色?用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。