氨基酸的分离鉴定—纸层析法
氨基酸的分离鉴定—纸层析法
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：
化学与生物工程学院生物工程系
生物化学实验报告
课程名称：生物化学
实验项目：氨基酸的分离鉴定—纸层析法
实验室名：生物化学实验室
实验时间：2012-11-15
任课老师：杨艳
专业班级：生物工程1142 学生姓名：髙晔
学号：201121030219 组别：第五组
实验内容
【实验目的】
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理，掌握氨基酸纸层析的操作方法。
【实验原理】
纸层析法（paper chromatography）通常用于蛋白质的氨基酸成分的定性和定量。1944年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸，得到很好的分离效果。到现在为止，纸层析法已经成为定性或定量测定多肽，核酸碱基，糖，有机酸，维生素，抗生素等物质的一种最简单易行的分离分析工具。
层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物，可做双向层析。其原理是以滤纸为惰性支持物的分配层析，层析溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，由于分配系数不同，结果物质在两相间不断分配而得到分离。
其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值（rate of folw, R f）来表示。R f=原点至层析斑点中心的距离/原点至溶剂前沿的距离=X/Y
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与被测物的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用单向纸层析法分离氨基酸。【实验器材】
1 器材
层析缸、毛细管、小烧杯、量筒、培养皿、分液漏斗、层析滤纸(新华一号)、喷雾器（或白瓷盘），烘箱（或吹风机）、铅笔、直尺
2 试剂
1)、扩展剂40mL 将20 mL水饱和的正丁醇和5 mL醋酸以体积比4：1在分液漏斗中进行混合。然后与15mL蒸馏水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。
2)、氨基酸溶液0．5％的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0．5％)各配置5mL 。
3)、显色剂50～100mL 0．1％水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】
（1）检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。（2）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约5mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。
（3）规划：带上手套，取宽约10cm、高约15cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2～3 cm 处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、
B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见下图。
图2 实验装置示意图
（4）点样：用毛细管分别取10mL左右的氨基酸样品点在四个位置上。干后重复点样，同一位置上需点2～3次，2～3mL/次，保证每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。其中3个是已知样，1个是待测样品。
（5）层析：用针、线将滤纸缝成筒状，纸的两侧边缘不能接触且要保持平行，参见图1-1。向培养皿中加入扩展剂，使其液面高度达到1cm左右，将点好样的滤纸筒直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面在A线下约1cm），罩上大烧杯，仍用塑料薄膜密封。当扩展剂上升到A线时开始计时，每隔一定时间测定一下扩展剂上升的高度，填入表1中。当上升到15～18cm，取出滤纸，剪断连线，立即用铅笔描出溶剂前沿线，自然风干或用电吹风热风吹干。
（6）显色：用喷雾器在通风厨中向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。
（7）计算各种氨基酸的R f值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表2。
（8）以层析时间为横坐标，扩展剂上升高度为纵坐标画图，求出扩展剂上升到15cm时所需要的时间。
【实验结果与数据处理】
表1 扩展剂前沿上升速度
X（min）0 5 10 15 20 30 40 60 90 …
Y（cm）0 0.8 1.5 2.15 3.75 4.85 5.9 7.9 8.88 (15)
表2 各种氨基酸的R f值
赖氨酸脯氨酸亮氨酸待测氨基酸原点到层析斑点中心的距离0.11 0.43 0.70 0.44
原点到溶剂前沿的距离0.88 0.88 0.88 0.88
R f0.12 0.48 0.79 0.50
判断待测氨基酸赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸
【实验结论】
通过实验可以知道每种氨基酸的在扩展剂中的移动速率是不相同的，利用每种氨基酸在纸上的位置不同可以计算出氨基酸的Rf值。和标准的Rf值对比，得出氨基酸种类。
据此由上表2可知，混合氨基酸是由赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸组成。
【注意事项】
⑴.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面(即展层时样品可能达到的部分)。
⑵.点样斑点不能太大，防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且点样后吹风温度不宜过高，以免样品变性(斑点发黄)。
⑶.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。
⑷.展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。
⑸.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单
向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶
剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分
别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。
指导教师批阅意见：
成绩评定：
指导教师签字：
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注：1、报告内的项目或内容设置，可根据实际情况加以调整和补充。
2、学生提交实验报告时间为实验后10日内。