分子生物学基本技术
分子生物学基本技术
包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成
一、DNA的化学合成（无要求）－亚磷酸三酯法
DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的
合成的原理：
核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。碱基上的氨基用苯甲酸保护。每延伸一个核苷酸需四步化学反应
(1) 脱DMT游离出5′-OH 。(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸
二、聚合酶链式反应技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。
一)PCR的基本原理
双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。
(二)典型PCR的反应体系
1.耐热DNA聚合酶：
耐热DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA 聚合酶，Sac DNA聚合酶。其中Taq聚合酶应用最广泛。Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃时半衰期分别为40min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95℃。Taq酶的最适温度是72 ℃，较高温度下的DNA合成错
误率较低。因此一次加酶可满足PCR反应全过程的需要，使PCR 走向自动化。
纯化的Taq DNA聚合酶有5′→3′外切酶活性，而无3′→5′外切酶活性，无校对活性。因此在PCR中每2╳104个核苷酸中有可能掺入1个错误核苷酸，这对一般的PCR产物分析不会有多少影响，但将PCR扩增产物用于分子克隆时，需使用更准确的DNA聚合酶。
在100μL反应体系中，一般需Taq DNA聚合酶0.5-5单位，酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少。Taq DNA酶可在-20℃贮存至少6个月
2. PCR反应的缓冲液：
PCR的缓冲液一般制成10×，含有：500m mol/L KCl;100m mol/L Tris-HCl(pH8.3)；15m mol/L MgCl2;0.1% 明胶。
使用时要稀释10倍。其中Tris-HCl可维持反应体系的pH，KCl有利于引物的退火，但浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性，明胶可保护酶不变性失活，Mg2+能影响Taq酶的活性，影响反应的特异性和扩增DNA的产率，因此要将Mg2+。
3.引物：
PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引
物设计一般遵循以下原则：
(1)引物长度一般为15-30b，引物太短，就可能同非靶序列杂交得到
不需要的扩增产物。
(2)G+C含量G+C含量一般为40%-60%。引物的G+C含量和引物Tm 值应该协调，按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值。
(3)碱基的随机分布引物中4种碱基应随机分布，不要多个嘌呤或多个嘧啶连续出现。引物自身不应存在互补序列，以免自身折叠成发夹结构影响与模板的退火结合。两引物之间也不应有互补性，尤其是避免3′端的互补而形成引物二聚体，使靶序列的扩增量下降。
(4)引物浓度引物的浓度一般为0.1-0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增。
4.dNTP：
dNTP常用的浓度为20-200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等。dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误参入率，适当的低浓度会提高反应的精确度。另外，dNTP是磷酸根的来源，会与Mg2+结合，
也应注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。
5.模板DNA
模板可以是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、扩增后的DNA、cDNA等，RNA的扩增需要首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液。通常小片段模板
DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此PCR反应前用机械剪切或用稀有限制酶酶解基因组DNA，以提高产量。
PCR反应中模板加入量一般为102-105拷贝的靶序列。
6.温度循环参数
变性温度一般为在90-95℃。变性所需的时间取决于DNA的复杂性，一般用94℃30s对模板DNA进行变性，过高的温度及过长的时间会降低Taq酶的活性。引物的退火温度通过Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到，一般55-80℃30s。延伸温度选在70-75℃之间，此时Taq酶活性最高。延伸反应的时间根据扩增片段的长度而定，一般1 kb以内延伸1 min，更长的片段需相应延长时间。PCR的循环次数取决于模板DNA的浓度，一般25-30次。循环次数越多，非特异性产物也越多
(三)PCR技术的扩展
典型的PCR经过一定的调整可用于特殊的研究工作，使PCR技术扩展到分子生物学的各个方面，较常用的技术扩展有：
1. “巢式”PCR(nested PCR)
先用一对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一PCR 技术即巢式PCR。第一次扩增所用引物称外引物(outer-primer)，第二次扩增作用的引物称内引物(inter-primer)。
进行“巢式”PCR可将外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，用外引物进行时，采用较高退火温度使内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。经过若干循环，待外引物基本消耗完毕后，只需降低退火温度即可直接进行内引物的PCR扩增。这种PCR技术被称为“中途进退式”PCR(drop-in-drop-out PCR)。
“巢式”及“中途进退式”PCR主要用于极少量模板的扩增。
2.复合PCR(multiplex PCR)
在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法称复合PCR。复合PCR主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。此外也常用于
多点突变性分子病的诊断。
3.不对称PCR(asymmetric PCR)
两种引物比例相差较大的PCR称不对称PCR。不对称PCR可制备用于
核酸序列分析的单链DNA片段或核酸杂交的探针等。
4.反转录PCR(reverse transcription PCR)
由于Taq酶只能以DNA为模板，当待扩增模板为RNA时，需先将其反转录为cDNA才能进行PCR扩增，这种PCR技术称为反转录PCR，在分
子生物学和临床检验等领域均有广泛应用。
5.涂片PCR(slide-PCR)
直接对载玻片上细胞涂片或组织切片进行PCR扩增的方法称涂片PCR。涂片PCR结合原位杂交技术特别适用于病理切片中含量较少的靶序
列的PCR检测。
6.反向PCR(inverse PCR)
扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR。在反向PCR中，要先将含有一段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列酶切后再进行PCR。反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增。
7.锚定PCR(anchored PCR)
用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3′端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR，可用于未
知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。
8.修饰引物PCR
为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等，可在引物的5′-末端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析物结合位点等，这种PCR技术称为修饰引物PCR。此外，还可将一些信号分子如荧光素、生物素等连接于引物的5′末端，当PCR完成后可对产
物直接进行检则。
PCR在生命科学中的应用非常广泛，已有不少专著可供读者参考。
第二节核酸的分子杂交
核酸分子杂交技术是分子生物中最常用的基本技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。
杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细胞或组织内进行原位杂交。
用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe)。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性核素，近年来也发展了一些非放射性标记物。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。
核酸分子杂交技术被广泛应用于基因克隆的筛选和酶切图谱制作、基因组中特定基因序列的定量和定性检测、基因突变分析以及疾病的诊断等方面。它的应用也大大推进了分子生物学的迅猛发展，如基因芯片就是分子杂
交技术进一步扩展的产物。
核酸的原位杂交有广阔的应用前景，但现时操作较繁，较易出现假阳性，故本节只介绍膜上印迹杂交。
一、探针的种类与选择
核酸分子探针可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等种类。探针选择正确与否，将会直接影响到杂交结
果的分析。
1.基因组DNA探针
几乎所有的基因片段都可被克隆到质粒或噬菌体载体中，获得大量高纯度的DNA探针。
但在选择此类探针时，要特别注意真核生物基因组中存在的高度重复序列(如人类基因组中的Alu序列)。要尽可能使用基因的编码顺序(外显子)作
为探针，而避免使用内含子及其它非编码顺序。
2.cDNA探针
cDNA中由于不存在内含子及其它高度重复序列，因此是一种较为理想的核酸探针。但cDNA探针不易获得，从而限制了它的广泛应用。另外，
还须注意其中的poly(dT)产生的非特异性杂交问题。
3.RNA探针
mRNA作为探针的优点是：①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，因此杂交温度可提高10℃左右，杂交的特异性更高；②RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交较少；③杂交后可用RNase将未杂交的探针消化掉，从而使本底降低。但是，RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，mRNA作为探针，其来源极不方便。因此，一般通过cDNA克隆、甚至基因克隆经体外转录而得到mRNA样或anti-mRNA样探针。
4.寡核苷酸探针
寡聚核苷酸探针可根据需要随心所欲地用DNA合成仪合成，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带的不利影响。寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其Tm，因此它特别适合于基因点突变分析；另外，由于序列的复杂性降低，因此杂交所需时间也较短。需要注意的是，短寡核苷酸探针所带来的标记物较少，特别是非放射性标记时，其灵敏度较低，因此当用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时，以采用较长的探针为好。
设计寡核苷酸序列用于分子杂交时应遵循以下几个原则：
(1)探针长度：一般要求10-50bp。设一段寡核苷酸的长度为n，则其在DNA中随机出现的频率(P)为1/4n。因此可以计算出，分析大肠杆菌基因只需12碱基长的寡核苷酸探针(大肠杆菌基因组DNA含量为4×106bp,12-mer 碱基顺序的随机频率为1.7×10-7)；而对于人基因组则需17或18-mer(人基因组DNA含量为2.9×109bp,17-mer和18-mer碱基顺序随机出现的频率分别为1.7×10-10和6.9×10-10)。过短则特异性降低，过长则不仅合成较
困难，而且延长杂交时间。
(2)G∶C对含量:应为40%-60%，超出此范围会增加非特异性杂交。
(3)一定不要含有探针内部互补顺序：即不应有＞4bp的碱基反向互补配对，否则会形成探针内部“发夹”状结构。
(4)避免有同一碱基的连续出现：不可＞4个，如-GGGGG-。
(5)最好用计算机与已知的各种基因序列进行同源性比较：如果此寡核苷酸序列与非靶基因序列有70%以上的同源性或连续8个以上的碱基序列相同，则最好不用，重新设计。
二、标记物的选择
放射性核素是灵敏度极高的标记物，但易污染环境，需严格的防护措施，故近年来开发了不少非放射性标记物，有些已达到相当高的灵敏度，只是一些试剂价格较昂贵，目前，放射性核素仍广泛使用，但非放射性标记物的使用率正在日益增高。
(一)放射性核素标记物的选择
常用于标记核酸探针的放射性核素有32P、3H和35S，有时也用14C、125I以及131I等。各种放射性核素的适用范围是由其物理特性所决定的，表5-1列举了上述几种放射性核素的物理特性。
(四)非放射性标记物的选择
根据其检测方法：非同位素标记物可分为以下几类：
(1) 半抗原：目前使用较多的非放射性标记物是生物素和地高辛，它们都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫检测。
(2) 配体：生物素还是一种抗生物素蛋白(卵白素，avidin)和链霉菌类抗生物素蛋白(strep tavidine)的配体，可以利用亲和法进行检测。
(3) 荧光素：如FITC、罗丹明类等，可以被紫外线激发出荧光进行观察，主要适用于细胞原位杂交。
(4) 化学发光：一些标记物可与另一物质反应而产生化学发光现象，可以象放射性核素一样直接对X-光胶片进行曝光，这类标记物可能是今后研究的主流。
(5) 光密度或电子密度标记物：如金、银等，适用于细胞原位杂交，可在光镜下或电镜下进行观察。
三、探针的放射性核素标记
1.切口平移法
线状、超螺旋及带缺口的环状双链DNA均可作为切口平移法的模板。
首先，极微量的DNase I在Mg2+的存在下，在DNA链上随机形成单链切口。利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5′→3′核酸外切酶活性在切口处将旧链从5′末端逐步切除。同时，在DNA聚合酶I的5′→3′聚合酶活性的催化下，在切口的3′末端-OH上合成新的DNA单链。如果在反应液中含有一种或多种标记的核苷酸(如32P-dCTP)，则这些标记的核苷酸将替代原来的核苷酸残基，从而形成高放射活性的DNA探针。
2.随机引物法
随机引物是含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物，可以与任意序列的核酸杂交，形成DNA聚合酶的引物，目前市售的随机引物为6个核苷酸残基的各种可能排列顺序共46=4090种。将变性后的模板DNA与随机引物混合复性，在大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)催化下合成新链，反应液中有［α-32P］-dNTP时，即可形成放射性核素标记的DNA 探针。加入的随机引物越多，探针合成的起点越多，得到的探针会越短。3.末端标记法
利用T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶、KlenowDNA聚合酶、末端转移酶等可以标记探针的一端，标记活性较切口平移法和随机引物法低得多，一般很少用作分子杂交的探针，主要用于DNA序列测定，故不作详细介绍。
4.探针的纯化
探针标记后，有时需要用凝胶过滤法除去未掺入的dNTP等小分子，收集含探针的第1锋，有时还需用酒精沉淀探针。
四、探针的非放射性标记
按照标记方法的不同，现有的非放射性标记物主要有两种类型，一种是预先已连接在NTP或dNTP上，因此可象放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸探针上，如生物素、地高辛等。另一类是直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上。后一类标记过程更为简单，可能是今后研究发展的主流。
1.酶促标记法
目前应用最广的非同位素标记物是生物素(biotin)。生物素可通过一条碳链臂与UTP或dUTP 嘧啶环的5位碳相连，连接物的碱基配对能力不变，而且仍然是许多DNA修饰酶的良好底物。碳链臂可长可短，但臂长为16或11个原子时，效果为佳。除dUTP外，一系列生物素标记的dATP和dCTP 也已被研制和应用。德国Boehringer Mannheim公司生产的地高辛(digoxigenin)标记物也已被逐步推广使用。
生物素和地高辛标记的dNTP可以用切口平移法、随机引物法及末端移酶末端标记法等进行核酸探针(包括DNA、RNA和寡核苷酸探针)的标记。但要注意，由于生物素等标记物是连接在碱基上，而不是磷酸基团，因此不能用多核苷酸激酶法进行末端标记。2.化学标记法
化学标记法是将标记物与化学性质较活泼的基团相连，在一定条件下使
活泼基团活化而与核苷酸的特定部位共价结合，常用的有：
(1)光敏生物素(photobiotin)：与核酸探针混合后，在一定条件下用强可见光照射10-20分钟，即可与探针相连，形成的标记探针可在-20℃下保存8-10个月，是目前常用的标记法。标记时DNA制品不能用Tris溶液溶解，
不能含有蛋白质，且小片段探针标记效率偏低。
(2)胞嘧啶生物素标记法：单链核酸中的胞嘧啶在亚硫酸氢钠作用下形
成亚硫酸化中间物，然后与乙二胺经转氨基作用形成胞嘧啶胺衍生物，再与
生物素酯反应形成生物素酰胺衍生物。
(3)生物素肼标记法：生物素肼在磺酸的催化下与单链核酸中的胞嘧啶
反应，形成N4-生物素标记的衍生物。
(4)酶的直接交联：将辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶通过化学方法直接交联到核酸探针上，通过酶促反应显示探针的位置。
五、膜上印迹杂交的条件选择
膜上印迹杂交操作的基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其含量与大小。有关印迹的基本知识在第二章
已经介绍，这里主要介绍杂交条件的选择。
DNA分子杂交实质上是双链DNA变性和具同源序列的两条单链复性的过程。
(二)非放射性核素探针的检测
除酶直接标记的探针外，其它非放射性标记物并不能被直接检测，而需经两步反应将非放射性标记物与检测系统偶联。第一步称为偶联反应，第二
步称为显色反应。
1. 偶联反应
大多数非放射性标记物是半抗原，可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。另一类非放射性标记物如生物素，作为抗生物素蛋白(卵白素，avidin)的配体，可通过亲合法进行检测。avidin是一种糖蛋白，有4个与生物素结合的位点，与生物素的亲合力极高。但是，由于体内存在内源性生物素的干扰，同时，由于avidin为糖蛋白，中性环境下带正电荷，易与其他带负电荷的生物大分子非特异性结合，导致假阳性结果。近年来使用的链亲和素不是糖蛋白，等电点为中性，较少形成非特异性结合，特异性较高。
2.显色反应
通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行杂
交信号的检测。常用的检测物质与方法有以下几类：
(1)酶法检测：这是最常用的检测方法。通过酶促反应使其底物形成有
色反应产物。最常用的酶是碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
碱性磷酸酶可使其作用底物BCIP(5-bromo-4-chloro-4-indolyl phosphate)脱磷并聚合，释放出的H+使NBT(nitroblue tetrazolium,硝基蓝四氮唑)还原而形成紫色化合物。
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)催化下列反应：
AH2+H2O2→2H2O+A
因此可采用一种能产色的氢供体化合物作为HRP的底物，在HRP的作用下氧化脱氢，从而在杂交部位生成不溶于水的有色物质，除可用于滤膜杂交外，亦可用于原位杂交的显微镜下检测。通常用作HRP的显色底物有DAB(3，3′-diaminobenzidine,二氨基联苯胺）和TMB(3,3′,5,5 ′-tetramethylbenzidine,四甲基联苯胺)。此外还有人采用phenylenediamine,O-dianisi dine(3,3′-dimethoxybenzidine)，以及
4-chloro-1-naphthol等。
DAB经HRP催化反应后形成一种红棕色沉淀物。TMB的反应产物为蓝色，较之红棕色的DAB产物更易于观察，特别是在显微镜下。而且DAB 是一种致癌物质，而TMB无致癌性。
(2)荧光检测法
荧光检测法主要用于非放射性探针的原位杂交检测。荧光素FITC(isothiocyanate)应用最广，罗丹明(rhodamine)类也常被采用，但荧光强度较低。Rhodymenia phycoerythrin(RPE)是一种重要的荧光蛋白(fluorescent phycobiliprotein)，它的吸收光谱广，荧光强度高(大约为荧光素的20-50倍)。
(3)化学发光法(chemiluminescence)
化学发光是指在化学反应过程中伴随的发光反应。应用化学发光法检测固相支持物上的DNA杂交体最为适宜。目前最有前途的是辣根过氧化物酶催化luminol(3-aminophthalate hydrazine)伴随的发光反应。
(4)电子密度标记(detection electron-dense labels)：
利用重金属的高电子密度，在电子显微镜下进行检测。主要适合于细胞原位杂交检测。
第三节基因克隆
基因克隆的技术路线大致包括以下几个程序：
①分离制备待克隆的DNA片段(目的DNA)；
②在体外连接目的DNA片段和载体；
③重组DNA分子转入宿主细胞；
④筛选、鉴定阳性重组子；
⑤重组子的扩增。
分子生物学前沿技术
分子生物学前沿技术 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ， LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近
分子生物学常用技术 习题
第五章常用分子生物学技术的原理及其应用习题（引自网络精品课程） 一、选择题 （一）A型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链DNA 与RNA 分子之间的杂交 B ．双链DNA 与RNA 分子之间的杂交 C ．单链RNA 分子之间的杂交 D ．单链DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ．DNA 片段 B ．cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ．RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ．DNA 印迹 B ．RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ．PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ．Western blot 中的探针是 A ．RNA B ．单链DNA C ．cDNA D ．抗体 E ．双链DNA 7 ．Northern blotting 与Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性内切酶消化 C ．探针必须是RNA D ．探针必须是DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ．RNA 印迹 D ．DNA 芯片技术 E ．DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在PCR 反应中不能作为模板 A ．RNA B ．单链DNA C ．cDNA D ．蛋白质 E ．双链DNA 10 ．RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ．cDNA C ．逆转录酶 D ．RNA E ．dNTP 11 ．关于PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性DNA 聚合酶 C ．dNTP D ．含有Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ．DNA 链末端合成终止法不需要 A ．ddNTP B ．dNTP C ．引物标记 D ．DNA 聚合酶 E ．模板 13 ．cDNA 文库构建不需要 A ．提取mRNA B ．限制性内切酶裂解mRNA C ．逆转录合成cDNA D ．将cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是GST D ．也可以是6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 16 ．动物整体克隆技术又称为
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰
接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上[2]。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml离心管相匹配。 机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验[3]。 EVA膜约100~200μm厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。 优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的显微切割技术相比[4]，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较
常用的分子生物学内容和相关技术
常用的分子生物学内容和相关技术 一、分子克隆（分子操作） 大肠杆菌中1．原核表达系统（PET28a，PET30a 等） 融合蛋白抗原免疫动物 原核表达系统蛋白转导系统（TAT） 大肠杆菌中
2．真核表达系统（pcDNA3）：用于transfection（基因转染） 在培养的动物细胞中 分子克隆的方法： ●选择合适的表达载体 ●选择酶切位点，设计PCR引物并合成 ●制备待克隆的靶基因
?PCR（来源培养细胞或组织、植物的mRNA cDNA） ?RT-PCR ?质粒中已克隆的目的片段 ?人工合成cDNA片段 退火后形成双链 二、细胞培养 ?动物细胞 ?植物细胞 ?原代细胞培养 ?传代细胞培养 三、探讨功能： 与细胞生长、增殖、凋亡的关系，检测mRNA、蛋白质的表达变化及意义 ?内源基因：或使内源基因表达抑制（RNAi, down-regulation）或缺失、突变 ?外源基因：通过transfection（基因转染）、电转移、显微微注射等方法将外源基因导入培养的细胞中过 表达（overexpression），在mRNA、蛋白质水平上 表达上调（up-regulation） ?信号传导：protein-protein interaction
◆Two hybrid system ◆Western blot ◆免疫荧光双标记图像分析 ?细胞:BrdU,Flow Cytometry（cell cycle，apoptosis） ?动物：成瘤 四、检测表达 ?DNA:Reporter gene(promoter activity),Hybridization （DNA-Southern blot，RNA-Northern blot，tissues or cells-in situ） ?RNA:RT-PCR，Real-time PCR,microRNA Gene chips:cDNA,microRNAs ?Proteins （tissues or cells-Western blot or immunohistochemistry，serum or conditional medium–ELISA）
分子生物学技术
分子生物学技术 近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA微阵列、转基因技术等等。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。1953年Watson & Crich发现DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。 在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。 一、分子生物学技术 由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。实时荧光定量PCR技术的应用,不仅使临床基因检测更加快速,而且使基因检测进入定量阶段,这特别有利于某些疾病治疗效果的评价。免疫检验中的放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）,酶免疫分析（Enzyme Iimrrmnoassay，EIA）,金标记免疫分析,荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay，FIA）,时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）,化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLI A）,电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay ，ECLI）技术的临床应用不仅拓宽了免疫学检测的领域,同时提高了免疫学检测的灵敏度,促进了免疫检测的自动化。特别是化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析技术的诞生,使得免疫学检验进入了一个新的时代,检测灵敏度可达pg水平,其检测速度、分析自动化程度及分
分子生物学前沿技术培训资料
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸
分子生物学常用技术考试题目及答案
1．P C R反应过程中，引物粘合所需温度一般是A．72℃ B．85℃ C．75℃ D．65℃ E．55℃ 2．PCR反应过程中，引物延伸所需温度一般是 A．95℃ B．82℃ C．72℃ D．62℃ E．55℃ 3．PCR反应体系不包括 A．模板DNA B．Taq DNA聚合酶C．特异性引物A、B D．ddNTP E．含Mg2+的缓冲液 4．PCR的循环次数一般为 A．5～10次B．10～15次C．15～20次D．20～25次E．25～30次 5．PCR反应体系与双脱氧末端终止法测序体系不同的是缺少 A．模板B．引物C．DNA聚合酶D．ddNTP E．缓冲液 6．Sanger法测序不需要 A．Klenow小片段B．引物C．dNTP D．标记dNTP E．ddNTP 7．Sanger法测序的基本步骤不包括 A．标记模板B．模板-引物杂交C．引物的延长与合成阻断 D．电泳E．放射自显影直读图 8．Sanger法测序的四个反应体系中应分别加入不同的 A．模板B．引物C．标记dNTP D．DNA聚合酶E．ddNTP 9．人类基因组计划的主要研究内容不包括 A．遗传图分析B．物理图分析C．转录图分析 D．序列图分析E．蛋白质功能分析 10．1996年，英国科学家克隆的Dolly羊所采用的技术是 A．转基因技术B．核转移技术C．基因剔除技术
D．肽核酸技术E．反义核酸技术 11．Maxam-Gilbert法与Sanger法测序的共同点是均需 A．引物B．Klenow大片段C．ddNTP D．化学裂解试剂E．电泳后放射自显影读图 12．Sanger法测序所得直读图像中，由终点至始点所读序列为 A．待测DNA5ˊ→3ˊ的碱基序列B．待测DNA3ˊ→5ˊ的碱基序列 C．待测DNA互补链3ˊ→5ˊ的碱基序列D．待测DNA互补链5ˊ→3ˊ的碱基序列E．引物5ˊ→3ˊ的碱基序列 13．PCR实验的特异性主要取决于 A．DNA聚合酶的种类B．反应体系中模板DNA的量 C．引物序列的结构和长度D．四种dNTP的浓度E．循环周期的次数14．基因剔除（knock out）的方法主要被用来研究 A．基因的结构B．基因的功能C．基因的表达 D．基因的调控E．基因的突变 15．反义核酸作用主要是 A．封闭DNA B．封闭RNA C．降解DNA D．降解DNA E．封闭核糖体的功能 16．有关Sanger法测序的叙述，不正确的是 A．只需标记一种dNTP B．一般应去除DNA聚合酶I 的5ˊ→3ˊ外切酶活性C．与dNTP相比阻断剂应尽可能的多D．反应时间不必太长 E．应采用超薄高压电泳 17．经电泳后将DNA转移至NC膜上的技术是 A．Southern blotting B．Northern blotting C．Western blotting D．Eastern blotting E．in situ hybridization
第十二章 常用分子生物学技术的原理及其应用
第十二章常用分子生物学技术的原理及其应用 一、选择题 A型题 1、用来分析蛋白质的技术是 A、Northern blotting B、Southern blotting C、Western blotting D、亲和层析 E、离子交换层析 2、用来分析DNA的技术是： A、Northern blotting B、Southern blotting C、Western blotting D、亲和层析 E、离子交换层析 3、下列哪一种不是核酸探针的标记 A、同位素标记 B、非同位素标记 C、地高辛标记 D、生物素标记 E、辣根过氧化物酶标记 4、当双链DNA经加热变性后，按下列哪种方式放置可获得单链DNA？ A、37℃水浴 B、室温 C、4℃冰箱 D、冰水或颗粒冰内 E、100℃水浴 5、与Southern blotting比较，核酸的Dot blotting中可省略的步骤是 A、电泳 B、核酸样品固定于NC膜 C、杂交信号检测 D、标记探针 E、制备样本核酸 6、原位杂交是指 A、在NC膜上进行杂交分析 B、在组织切片或细胞涂片上进行杂交分析 C、直接将核酸点在NC膜上进行杂交分析 D、在PVDF膜上进行杂交分析 E、在凝胶电泳中进行杂交分析 7、关于PCR引物的选择，下列哪项是错误的？ A、由于变性温度在95℃，故可选择具有二级结构的引物 B、尽可能选择(G+C)含量在50%左右并随机分配的引物 C、避免连续的多聚嘌呤顺序 D、反应过程中，每种引物的浓度一般在0、1 – 0、5 mol/L E、应避免两引物末端重叠形成二聚体 8、有关DNA链末端终止法的不正确说法是 A、需要dNTP B、需要ddNMP C、需要ddNTP D、dNTP:ddNTP的比例要合适 E、需要放射线同位素和荧光染料 9、用PCR技术完成对某一遗传病的疾病基因纯合性缺失的研究过程中不需要的 步骤为： A、受检者血白细胞的分离 B、白细胞DNA的制备 C、配制PCR反应体系 D、PCR反应及其产物的琼脂糖电泳 E、反应产物的SSCP分析 10、在DNA测序的化学裂解法中需要
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术?核酸分子杂交技术 ?由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（ｐrｏbe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DＮA和细胞总RNＡ。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或ＲNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。? 固相杂交 ?固相杂交（soｌｉd－phase ｈｙbｒｉdizatｉon)是将变性的DNＡ固定于固体基质(硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上,再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。? 斑步杂交(dot hyｂrｉｄizａtｉoｎ）??是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或ＲNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交(blｏttｉng hybridizatioｎ） ?Southｅrn印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的ＤNA片段，将凝胶上的DＮA变性并在原位将单链ＤNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(ＲELP)等。 ?Ｎortｈeｒn印迹杂交:由Southeｒm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上，进行杂交反应,以鉴定基中特定mRＮＡ分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。? 差异杂交(differential hybridｉzatｉon) ?是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同ｃDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNＡ逆转录后的ｃDNA)分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低（仅5％左右),价值不大。 ?cDＮA微点隈杂交（cDＮＡmiｃroａｒray hybriｄizａtion）? 是指将cDNA克隆或cDNA的ＰCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNＡ探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。??寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotｉｄｅmicｒoarraｙhybridizatiｏn)? 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、
分子生物学常用实验技术
分子生物学常用实验技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第二章 DNA酶切及凝胶电泳 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA的提取和cDNA合成 第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第六章基因组DNA的提取 第七章 RFLP和RAPD技术 第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章分子杂交技术 第十章测序技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检
分子生物学实验技术实验内容
2006年《分子生物学实验技术》实验内容 一、RT-PCR （一）总RNA的提取 实验安排： 每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS-Biotragents液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入1、将100μl酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。 8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 （二）反转录 实验安排： 每人做一管。 反应体系（20μl）：按下列顺序加样
μl45×Buffer μl6dNTPs μl1RNA酶抑制剂 μl1Oligo（dT）μ随机引 μ反转录AMV1 μ提取RNA6 总体μ20 1h 42反应条件：℃ 注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。dNTPsBuffer加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。℃，以防酶失活。4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20 PCR （三）实验安排：每人做一管。 ：按下列顺序加样μl）反应体系（50 ddHO 32.7μl 2510×PCR Buffer μl 4μldNTPs 2P1 μl 2μlP2 0.3Taq μl 4cDNA template μl μl50Total 反应程序： 预变性94℃2min 30s 变性94℃ 45s 退火50℃ 1min 延伸72℃
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术 包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成 一、DNA的化学合成（无要求）－亚磷酸三酯法 DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的 合成的原理： 核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。碱基上的氨基用苯甲酸保护。每延伸一个核苷酸需四步化学反应 (1) 脱DMT游离出5′-OH 。(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。 上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸 二、聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。 一)PCR的基本原理 双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。 (二)典型PCR的反应体系 1.耐热DNA聚合酶： 耐热DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，Tth DNA聚合酶，VENT DNA 聚合酶，Sac DNA聚合酶。其中Taq聚合酶应用最广泛。Taq酶在92.5℃、95℃和97.5℃时半衰期分别为40min、30min和5-6min，故PCR中变性温度不宜高于95℃。Taq酶的最适温度是72 ℃，较高温度下的DNA合成错
分子生物学技术
载体构建 通过载体构建的方法可将目的基因构建在真核/原核表达系统中，然后运送至受体细胞中，在该细胞中实现目的基因的过表达、KD等。我们公司拥有丰富的载体资源，包含慢病毒载体、腺病毒载体、逆病毒载体以及多种过表达载体、Knock down等，能够实现含目的基因的病毒包装及过表达、KD等。 载体架构流程图 GST pull-down 1.技术简介 GST pull-down实验是一个有效验证酵母双杂交系统的体外试验技术。将靶蛋白质-GST融合蛋白质亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白质亲和的支撑物，充当一种\“诱饵蛋白质\”，目的蛋白质溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的\“捕获蛋白质(目的蛋白质)\”，洗脱结合物通过SDS-PAGE 电泳分离，最后经western blot，从而证实两种蛋白质间的相互作用；\“诱饵蛋白质\”和\“捕获蛋白质\”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白质、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 2.实验原理
利用重组技术将PES1蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合表达，融合蛋白通过GST与琼脂糖微球上结合的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，如果PES1与NPM1之间有直接相互作用，当结合了PES1蛋白的GTH微球的与含有NPM1蛋白的细胞裂解液混合孵育，再通过离心富集GST微球，得到的样品中可以检测到NPM1。 3.实验目的 在体外检测NPM1(nucleophosmin )与Pes1(pescadillo)之间的直接相互作用，确定PES1与NPM1相互作用的结构域。 4. 实验流程 5.技术服务 1）验证两种蛋白质间相互作用 2）验证目的蛋白与细胞裂解物蛋白互作