GST蛋白纯化
GST bestarose 4FF说明书
默认分类2010-01-18 09:32:34 阅读257 评论0 字号：大中小
GST bestarose 4FF是专门用于纯化pGEX系列载体表达的GST标签蛋白，其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，操作简单，快速。
GST bestarose 4FF 可直接从预处理的细胞裂解物中纯化GST-tagged蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的生物活性。
GST bestarose 4FF 具有高流动性，易于放大，GST bestarose 4FF有快速方便的预装柱，Ez-Fast bestarose 4FF 1ml和5ml。
介质性能
谷胱甘肽是通过10碳原子的连接臂偶联到4%高度交联的琼脂糖上。最优的偶联作用使介质具有高GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽相互作用蛋白的结合能力。
总的蛋白结合能力约为每毫升填料结合10mg标签蛋白，动态结合能力随着外界因素改变，如不同的目标蛋白，流速等等。
如果需要去除GST部分（天然蛋白分子量为26KD），当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后用位点专一的蛋白酶消化，选用前种方法，可减少额外分离目的蛋白与GST步骤，消化后，目的蛋白直接用结合液洗脱即可。
表1 GST bestarose 4FF性能
配体谷胱甘肽与10碳原子连接臂
配体浓度 120-320μmol谷胱甘肽/ml填料
蛋白结合能力≈ 10mg重组GST-tagged蛋白/ml填料，GST，Mr26000
动态结合能力≈11mgGST-tagged蛋白/ml填料，Mr43000
平均颗粒大小90μm
组成 4%高度交联的琼脂糖
最大流速* 450cm/h（15ml/min），XK层析柱，柱高5cm,水溶性缓冲液，室温纯化
建议的流速** 上样：＜100cm/h（＜3ml/min ，XK层析柱）
洗涤与洗脱：100-300cm/h（3-10ml/min，XK层析柱）
化学稳定性所有常用的水溶性缓冲液中稳定，如：1M醋酸盐，pH7.4，6M 盐酸胍，室温，1h
pH稳定性 pH3-12
贮存温度 +4-30℃
贮存液 20%乙醇
* 水是室温的。
** 结合力与流速有关，低流速增加结合量，这在上样和洗脱过程中非常重要。蛋白性质，pH，温度也影响结合量。
试剂配制
缓冲液的配制：
用来配缓冲液的水及化学试剂纯度要求很高，建议试剂配好后，用0.45μm滤膜过滤。
结合液：PBS，pH7.3（140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3）
洗脱液：50mM Tris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH8.0）
注意：结合液和洗脱液中可以含有1-10mM DTT。
样品的准备：上样前，样品需离心或用滤膜过滤。
如果样品太稠，用结合液稀释，以防堵塞柱子，如果是batch纯化，则可以不过滤样品。
Batch 纯化
GST bestarose 4FF的准备
1. 确定你所需的介质体积。
注意：介质是贮存在20%乙醇中的，洗净后，配成50%。
2. 轻轻摇匀瓶中的介质。
3. 用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。
4. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液。
5. 加每毫升介质加5毫升PBS洗涤，颠倒混合。
6.沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液。
7.重复步骤5和6，2-3次。
Batch纯化步骤
1. 将细胞裂解液加入准备好的胶中，旋转仪轻轻转动混合，室温，至少30min,
2. 用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。
3. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于流穿液），保留一些，用SDS-PAGE电泳检测介质结合能力。
4. 每毫升步骤3沉淀加5毫升PBS洗涤。
5. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于洗涤液），保留一些，跑电泳。
6. 重复步骤4和5，两次。
7. 每毫升步骤5沉淀加0.5ml 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH8.0，旋转仪于室温轻轻转动混合5-10min。
8. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于洗脱液）。
9. 重复步骤7和8，两次。分别检测这三次的洗脱液。
注意：
? GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间。不同的GST融合蛋白结合效率差异显著。
? 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度，洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液，洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。
? GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件，分析纯化过程的每个步骤，该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GST-tagged蛋白。
? A280处的吸收值可用来估算GST-tagged蛋白浓度，约A280~1对应浓度为0.5mg/ml。
? GST-tagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定（如Lowry，BCA，和Bradford法）。如果用Lowry法和BCA法，样品首先要脱盐，或在PBS中透析去除谷胱甘肽，因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收，而Bradford法不受谷胱甘肽影响。
? 介质的再次使用，主要取决于样品的性质，必须是同一个样品，防止交叉污染。
层析柱层析
建议使用的层析柱：
Tricorn 10/100：柱体积8.5ml，柱高15cm。
XK 16/20：柱体积30ml，柱高15cm。
或者GST Ez-Fast 4FF 1ml和5ml的预装柱也可使用。
装柱
1. 所有的材料都处于纯化时所需的温度。
2. 用pH7.3 PBS冲洗柱底部的垫片，避免垫片下面滞留气泡，在液面低至1-2cm高度时关闭层析柱下端出口。
3. 摇匀瓶中的介质。
4. 估算所需介质的（匀浆的浓度约为60%）。
5. 吸取介质，用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中，这可以减少气泡的产生。
6. 立即用PBS灌满柱子，放上上层垫片，将柱子连接到泵上。
7. 打开下端出口，设置流速。
8. 至少流过三倍柱体积的PBS，直到界面不变，在界面处做上记号。
注意：纯化时的流速不要超过75%的装柱流速。
9. 关闭泵，并关闭柱子下端出口，去除层析柱上层垫片，小心的用PBS封满柱子，在顶部形成一个凸面。
10. 从一角插入转接头，确保网下没有空气残留。
11. 将转接头缓慢向下移动（转接器上接口是打开的），到记号处停止，并锁住转接头，把把柱子连接到泵上或色谱分析系统上，开始平衡。如果需要可重新移动转接头的位置。
层析柱纯化步骤
1. 5倍体积的结合液平衡柱子。
2. 加入以处理好的样品。
3. 5-10倍柱体积的结合液洗涤柱子，直至在流穿液中检测不到东西。保留一些，用SDS-PAGE电泳检测介质结合能力。
4.5-10倍体积的洗脱液洗脱蛋白。
注意：
? 影响GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽作用的蛋白结合的最重要因素是介质的流速，GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间。蛋白性质，pH，温度也影响蛋白的结合。
? 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度，洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液，洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。
? GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件，分析纯化过程的每个步骤，该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GST-tagged蛋白。
? A280处的吸收值可用来估算GST-tagged蛋白浓度，约A280~1对应浓度为0.5mg/ml。
? GST-tagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定（如Lowry，BCA，和Bradford法）。如果用Lowry法和BCA法，样品首先要脱盐，或PBS中透析去除谷胱甘肽，因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收，而Bradford法不受谷胱甘肽影响。
? 介质的再次使用，主要取决于样品的性质，必须是同一个样品，防止交叉污染。
介质的清洁
当沉淀物，变性的及非特异性吸附的蛋白累积时，介质的结合能力会下降。
? 去除沉淀物及变性蛋白：2倍体积的6M盐酸胍洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS洗涤。? 去除疏水性结合的蛋白：用3-4倍体积的70%乙醇或2倍体积的1%Triton X-100洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS洗涤。
贮存
贮存于70%乙醇中，+4-30℃。
GST标签的切除
在大多数情况下，融合部分保留它的功能活性，可用完整的GST融合蛋白检测其活性。如果需要切除GST 标签，当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后，用位点专一的蛋白酶如PreScission蛋白酶，凝血酶或Xa因子切除。
如果酶切条件需要优化时，建议洗脱后酶切。易于随时取样，通过SDS-PAGE电泳分析产量，纯度及酶切情况。完全酶切的蛋白酶的用量，温度及酶切时间随不同的融合蛋白改变。在中试研究中确定融合蛋白的最适条件，如，加大酶量，酶切时间可以减小。
1. PreScission蛋白酶
PreScission蛋白酶，Mr 46000。
PreScission酶切缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA，1mM DTT，pH7.5。
PreScission蛋白酶酶切结合在层析柱上的GST-tagged蛋白
假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料
1. 接着“Batch纯化”步骤1-6或“柱纯化”步骤1-3。
2. 用10倍柱体积的PreScission蛋白酶缓冲液平衡结合带有融合蛋白的柱子。
3. 准备PreScission蛋白酶切体系：每毫升结合融合蛋白的柱体积，4℃条件下，准备80μl(160个单位) PreScission蛋白酶和920μlPreScission蛋白酶切缓冲液的混合物。
4. 将准备好的酶切体系加到层析柱上，封住层析柱。如果是batch纯化，PreScission蛋白酶切体系与介质混合即可，轻轻摇动或旋转悬浮液。
5. 4℃酶切4h。
6. 之后，用3倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子，用不同的管子收集洗脱液，以防收集的蛋白稀释，分析鉴定。如果是batch纯化，离心，500×g，5min，小心的将洗脱液转移到干净的管子里，洗脱液中含有目的蛋白，而GST标签部分及PreScission蛋白酶则继续留在介质上。
PreScission蛋白酶酶切洗脱的GST-tagged蛋白。
假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料
1. 首先用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽，或用PreScission蛋白酶酶切缓冲液透析。
2. 洗脱液中，100μg融合蛋白中加入1μl的PreScission蛋白酶。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定，则每毫升介质对应加80μl的PreScission蛋白酶。
3. 4℃酶切4h。
4. 用酶切后的样品平衡柱子，去除GST标签及PreScission蛋白酶。
5. 室温，孵育20-30min。
6. 沉淀，500×g，5min。目的蛋白在上清液中。
2. 凝血酶
凝血酶，Mr37000。
凝血酶酶切缓冲液：PBS，pH7.3。
缓冲液的配制：
1. 将500U凝血酶溶解在冷的500μl PBS，pH7.3(1U/μl)。
2. 轻和的涡旋溶解。
3. 分装80μl一管，保存在－80℃。
凝血酶酶切结合在层析柱上的GST-tagged蛋白
假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料
1. 接着“Batch纯化”步骤1-6或“柱纯化”步骤1-3。
2. 准备凝血酶酶切体系：每毫升的柱体积，4℃条件下，准备80μl(160个单位)凝血酶和920μl pH7.3PBS 的混合物。
3. 将准备好的酶切体系加到层析柱上，封住层析柱。如果的batch纯化，reScission蛋白酶切体系与介质混合即可，轻轻摇动或旋转悬浮液。
4. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。
5. 之后，用3倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子，用不同的管子收集洗脱液，以防收集的蛋白稀释，分析鉴定。如果是batch纯化，离心，500×g，5min，小心的将洗脱液转移到干净的管子里，洗脱液中含有目的蛋白，而GST标签及凝血酶则继续留在介质上。
凝血酶酶切洗脱的GST-tagged蛋白。
假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料
1. 洗脱液中，1mg融合蛋白中加入10μl的凝血酶。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定，则每毫升介质对应加80μl的凝血酶。
3. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。
4. 酶切后，用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽，或用凝血酶酶切缓冲液透析。然后再用样品平衡柱子。
5. 室温，孵育20-30min。
6. 沉淀，500×g，5min。目的蛋白在上清液中，而GST标签及凝血酶则继续留在介质上。
3. Xa因子
Xa因子，Mr48000。
注意：Xa因子是由二硫键连接的两个亚基组成。因为还原型谷胱甘肽能破坏二硫键，因此，在酶切反应前，必须将它去除。
Xa因子酶切缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM CaCl2，pH7.5。
缓冲液配制：
1. 将400U Xa因子溶解在冷水中(1U/μl)。
2. 轻和的涡旋溶解。
3. 分装80μl一管，保存在－80℃。
Xa因子酶切结合在层析柱上的GST-tagged蛋白
假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料
1. 接着“Batch纯化”步骤1-6或“柱纯化”步骤1-3。
2. 用10倍柱体积的Xa因子缓冲液平衡结合带有融合蛋白的柱子。
3. 准备Xa因子酶切体系：每毫升结合融合蛋白的柱体积，准备80μl(80个单位) Xa因子和920μl Xa因子酶切缓冲液的混合物。
4. 将准备好的酶切体系加到层析柱上，封住层析柱。如果的batch纯化，Xa因子切体系与介质混合即可，轻轻摇动或旋转悬浮液。
5. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。
6. 之后，用3倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子，用不同的管子收集洗脱液，以防收集的蛋白稀释，分析鉴定。如果是batch纯化，离心，500×g，5min，小心的将洗脱液转移到干净的管子里，洗脱液中含有目的蛋白和Xa因子，而GST标签则继续留在介质上。
Xa因子酶切洗脱的GST-tagged蛋白。
假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料
1. 首先用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽，或用Xa因子酶切缓冲液透析。
2. 洗脱液中，1mg融合蛋白中加入10μl的Xa因子。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定，则每毫升介质对应加80μl的Xa因子。
3. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。
4. 用酶切后的样品平衡柱子，去除GST标签。
5. 室温，孵育20-30min。
6. 沉淀，500×g，5min。目的蛋白和Xa因子在上清液中。
疑难解答
GST-tagged 蛋白不结合到介质上
? 裂解时，融合蛋白变性：过度的裂解会引起蛋白变性，并阻碍它结合到介质上，建议采用温和的裂解方法，这些条件需经验摸索。
? 在细胞裂解液及缓冲液中加入DTT：DTT终浓度为1-10mM，可显著增加蛋白结合量。
? 检测pGEX空载体表达的GST活性：制备转化了pGEX质粒的细胞裂解液，检测GST的结合情况。如果由空质粒表达的GST具有高亲和性，融合蛋白可能改变了GST的构象，导致它的亲和性降低。大量的研究表明温度降为+4℃，且减少洗涤时，有利于增加结合量。
? 使用前平衡柱子：pH低于6.5，或高于8时，融合蛋白的结合效率很差，上样前，请确保介质已用pH6.5-8.0的缓冲液平衡。
? 使用结合能力高的介质：如果介质已经用了很多次，则有必要更换新的介质。
? 上样时，降低流速。
GST-tagged蛋白不能完全从介质上洗脱下来
? 增加洗脱时间：洗脱时，降低流速。
? 增加洗脱液体积：尤其在层析柱上切除标签时，需要大量的洗脱液洗脱目的蛋白。
? 增加洗脱液中谷胱甘肽浓度：大多数情况下用10mM谷胱甘肽足够了。特殊情况下用50mM Tris-HCl，20-40mM 还原型谷胱甘肽，pH8.0作为洗脱液。
? 增加洗脱液的pH：低pH会降低洗脱效果，在不需要增加谷胱甘肽浓度的情况下，可将pH调为8-9。
? 增加洗脱液的离子强度：加入0.1-0.2M NaCl。
? 更换新的介质。
? 在洗脱液中添加非离子型去污剂：非特异性疏水作用会阻碍融合蛋白的溶解和洗脱，加入非离子型去污剂如0.1%Trion X-100或2%N-octylglucoside可明显改变洗脱的效果。
纯化后出现杂带的原因
? 与融合蛋白一起纯化到的蛋白，Mr 70000：分子量为70000的蛋白可能是E.coli基因dnaK的编码产物，它参与蛋白的折叠。据报道上样前，样品在50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4缓冲液中37℃放置10min，可避免这种现象发生。或用ATP琼脂糖凝胶或离子交换剂将DnaK蛋白去除。
? 增加蛋白酶抑制剂：蛋白酶可将目的蛋白降解成多个片段，需在裂解液中加入1mM PMSF。注意：在用凝血酶或Xa因子酶切前，必须先将丝氨酸蛋白酶抑制剂除去。而PreScission蛋白酶不受大多数蛋白酶抑制剂影响。
? 用蛋白酶突变的宿主菌：杂带可能是宿主蛋白酶水解的结果，如果这是主要原因，我们可以采用蛋白酶突变的宿主菌，如lon-或ompT。
? 缓和裂解方法：可用显微镜或裂解液的半透明现象来观察细胞的裂解情况，裂解前，先加些溶菌酶（0.1倍柱体积的含10mg/ml溶菌酶的Tris-HCl溶液）。避免泡沫生成，它会引起蛋白变性，过度的裂解也会使宿主蛋白和融合蛋白一起洗脱下来。
? 可以添加的纯化步骤：杂带是由所谓的伴侣分子蛋白产生，该蛋白在E.coli中参与蛋白的正确折叠，这包括DnaK（Mr~70000），DnaJ（Mr~37000），GrpE（Mr~40000），GroEL（Mr~57000）和GroES（Mr~10000）及其它蛋白。许多从这些杂蛋白中纯化融合蛋白的方法已经报道。
? 交叉吸附E.coli中抗体蛋白：E.coli中可能会存在许多抗GST标签的抗体，它们会与融合蛋白相互吸附。
GST标签不完整切除
? PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子与融合蛋白的比例不正确：检查酶切反应中融合蛋白的量。参照每毫升GST bestarose 4FF介质能吸附10毫克融合蛋白，大多数情况下，介质不能被融合蛋白饱和。比例：PreScission蛋白酶，至少10U/mg融合蛋白。
凝血酶，至少10U/mg融合蛋白。
Xa 因子，不少于1%（W/W）融合蛋白，一些融合蛋白，需用5% Xa因子，最佳的量需要经验摸索。
在一般情况下，融合蛋白的浓度为1mg/ml时，酶切效果最好。反应液中加入≤0.5%SDS（W/V）可以有效增加Xa因子切除标签的效果。用不同浓度的SDS实验，以得到最适浓度。
? 增加酶切时间和酶量：融合蛋白不会降解的情况下，可将PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子的酶切时间延长为20h。酶的用量也可以提高。
? 核查特异性酶切位点：核对DNA序列，与已知序列比对，核查基因克隆的序列特异性酶切位点是否改变。
确保加入蛋白酶抑制剂：
? PreScission蛋白酶：酶切前，在50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，pH7.5的缓冲液中透析或更换缓冲液。
? Xa因子：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM CaCl2，pH7.5的缓冲液中透析或更换缓冲液。? Xa因子需要激活：功能性的Xa因子需要用Russell’viper venom激活，激活反应条件为Russell’viper venom与Xa因子的比例为1%，在8mM Tris-HCl，70mM NaCl，8mM CaCl2，pH8.0的缓冲液中37℃孵育5min。
? Xa因子识别位点后的第一个氨基酸是Arg或Pro：核查融合蛋白的核苷酸序列，确保Xa因子识别后的三个核苷酸编码Arg或Pro。
酶切后的多条带分析：
? 检测条带出现的时间：确定杂带不是出现在酶切前，这些条带可能是蛋白酶水解的结果。
? 融合蛋白可能含有PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子识别的序列：核查序列。
GST融合蛋白构建、表达与纯化
GST 表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达 酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量： 构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点
3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框 下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存 合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.docsj.com/doc/eb1352131.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG
模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存 引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件 （1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定 （5）重复2-5 25-30个循环 （6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了） 鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 （1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根） （2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s
GST融合蛋白的纯化步骤
GST融合蛋白的纯化步骤 一、制取细胞的裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS缓冲液; 2.加入溶菌酶至最终浓度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min; 3.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动并温育10min; 5.4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 二、纯化GST融合蛋白： 1.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 2.混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 3.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 4.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 5.重复步骤3和4两次； 6.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 三、用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： 1.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; 3.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 四、蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： 1.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位1mlPBS 的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 3.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 五、谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。 查询关键词：GST融合蛋白的纯化步骤，GST蛋白纯化步骤，蛋白纯化 试验用的生化试剂，本公司均可以提供，如有需要，请联系我们，我们将为您提供最满意的服务。
GST-Pull-Down原理
分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间 新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。
GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。 1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。其他方法你可以在查查看？ 2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。 3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。
GST融合蛋白的纯化
GST融合蛋白的纯化 诱导和收集菌体 在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。IPTG浓度一般为 0.1～1.0mM。 5000rpm 5min离心收集菌体。 亲和层析柱的制备 取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。 将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。 每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。 在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。 将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。 收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。 0.45um过滤后加入亲和层析柱。 室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。 用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。 配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。 用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。 测各管洗脱液蛋白浓度。 PAGE电泳检测纯度。 亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。或者按照beads使用说明书上的方法再生。 如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。 如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。
GST蛋白纯化步骤
制备细胞裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS; 2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min; 3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min; 5. 4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 纯化融合蛋白： 7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 11.重复步骤9和10两次； 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。
分子机制-蛋白检测-GST-pulldown
主题：GST-pulldown 概述： GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。 其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
步骤： １.Glutathione琼脂糖珠预处理； ２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜； ３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上； ４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液； ５.将细胞裂解液上清加入beads； ６.加上SDS上样缓冲液； ７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。 流程图：
GST融合蛋白纯化方法
GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体； 2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h； 3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）； 以下步骤均在冰上操作： 4超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h； 5 2000 g，3min离心弃上清； 6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清； 7重复步骤6 两次； 8加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min； 92000 g，3 min离心，收集上清； 10重复步骤8-9至少两次； 11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度； 12将蛋白置于-20℃保存。 P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条 Thrombin cleavage (using thrombin produced by Amersham) 1. Thrombin cleavage of eluted fusion protein bound to Sepharose * Mix 50 μl of thrombin (< 10 cleavage U/ml) solution and 950 μl of 1 x PBS for each ml of Glutathione Sepharose bed volume Add thrombin protease mixture to Glutathione Sepharose pellet Gently shake or rotate the suspension at r.t. for 2-16 h Centrifuge the suspension at 500 x g for 5’ to pellet the beads and carefully transfer the eluted fraction to a clean tube. 2. Thrombin cleavage of eluted fusion protein. Add 10 μl of thrombin solution (10 cleavage units) per mg fusion protein. If the amount of fusion protein in the eluate has not been determined, add 80 μl (80 U) of thrombin for each ml of Glutathione Sepharose bed volume from with the fusion protein was eluted. Mix gently and incubate at r.t. (22-25C) for 2-16 h. Once digestion is complete, GST can be removed by first removing glutathione by extensive dialysis (2,000 vol/ml) against 1 x PBS followed by batch purification.
GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化
收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴 爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.docsj.com/doc/eb1352131.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴 爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州 510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海 200031) 摘 要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒 人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂 引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2 方法1.2.1 目的基因的扩增及纯化 根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2 pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建 将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3 重组质粒的筛选和鉴定 将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3
GST标签蛋白纯化的GSH磁珠
GST标签蛋白纯化的GSH磁珠 产品组分 储存方法 保存于20%乙醇中，2-8℃保质期一年。切勿冻存。 (1). 还原型谷胱甘肽容易氧化，Elution Buffer要求现配现用；(2). 不同的GST融合蛋白与磁珠结合的强弱程度不同，对大部分的GST融合蛋白，使用含有10 mM还原性谷胱甘肽的Elution Buffer即可洗脱目标蛋白。对少数结合能力较强的GST融合蛋白，可以适当延 长洗脱时间，增加洗涤次数，或提高Elution Buffer中还原型谷胱甘肽的浓度。 (3). Binding Buffer和Elution Buffer中可以添加1~5mM EDTA，1~10mM DTT，0.1~1% Triton X-100，0.1~1% Tween 20等，以 提高目标蛋白的稳定性。A. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；冰浴 超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在 粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。 B. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释平衡 ，即为粗蛋白样品。 C. 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，弃上清；用适量含1%(v/v) Triton X-100或1%(v/v) NP-40的Binding Buffer重悬；加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；置于冰上10min，即为粗蛋白样品。一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL发酵液收获1g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为5～10mg，则需要取10 mL 10%(v/v)的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化，以下即以此为例进行详细说明。 本手册提供以下三种样品的处理方法： 目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合目标蛋白的缓冲液，包括结合缓冲液(Buffer A )和洗脱缓冲液(Buffer B)。 以下提供一个较强结合力的GST标签蛋白的纯化流程，以供参考。 实验方法 1. 缓冲溶液配制 2. 样品处理 3. 磁珠预处理 A. Binding Buffer : 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 B. Elution Buffer : 50 mM Tris- HCl, 10 mM GSH, pH 8.0. Preparation Method: Add 0.307g GSH to 100 mL 0.1 M Tris- HCl, then adjust pH to 8.0 with 0.1 M HCl and add deionized water to a total volume of 100 mL.注： 1. Buffer Preparation 2. Sample Preparation 3. Magnetic beads pretreatment 4. Protein Binding 5. Washing 6. Elution 7. After treatment of magnetic beads 8. Regeneration of magnetic beads Magnetic Beads Cells/bacterium Target protein Other proteins Magnetic Separator Collect Supernatant Pipette Repeat Binding buffer Washing buffer Elution buffer 12 3
GST蛋白纯化
三．GST融合蛋白纯化 （1）GST亲和纯化 1．介质保存：20％乙醇 2．所需试剂： ①10×PBS（1L）：pH7.4 (4℃) 150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g) ②10×洗脱前buffer（100ml）：pH8.0 (25℃) 50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g) ③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)：pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.0 50mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g) 洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM，加还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度20mM 也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM，未对比过。 8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer（加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽）④3M NaCl 3．纯化步骤及注意事项： ①PBS平衡柱子：至少5个柱体积 ②上样：经对比发现，上样流速需极慢才能结合，一般上样过夜（纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力） ③PBS洗杂蛋白：洗到紫外监测基线平，至少1小时，时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时，这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。 ④洗脱前buffer换体系：至少2个柱体积，8ml介质一般用20ml ⑤洗脱buffer洗脱蛋白：洗脱速度很快，一般第2、3管浓度最大，注意收峰 ⑥3M NaCl再生柱子：一般会洗出一个小盐峰，再生时间不可过长，否则对柱子有伤害，5个柱体积即可 （2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB为例） 先后使用过sigma和鼎国的凝血酶，sigma的酶效率更高。 鼎国凝血酶买来为干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（补1M CaCl2至终浓度2.5mM），分装至每管10μl共100管，30U/管。 合并GST柱下来的目的蛋白，紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。用鼎国凝血酶摸酶浓度：每35mg蛋白用凝血酶50μl，酶切约20小时。 对比25℃水浴酶切和摇床中酶切，定时取样检测酶切结果，发现摇床中酶切更快（可能是摇动过程中酶与蛋白能充分结合），但摇床中酶切产生的沉淀也更多。 GST琼脂糖凝胶FF 一、简介 GST琼脂糖凝胶是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料，一步分离就可得到很纯的目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。 本产品是本公司自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，很好的物理和化学稳定性，使用寿命长，使用方便。良好的批次重复性，易于放大，所以无论是研发还是生产都是理想的选择。 二、亲和填料特性：
GST 标签蛋白纯化工具
https://www.docsj.com/doc/eb1352131.html, GST 标签融合蛋白 -纯化、检测 谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个含有211个氨基酸的蛋白，通常将该蛋白加入到重组蛋白的末端以便对该重组蛋白进行纯化或检测。具有组氨酸的非融合蛋白会产生非特异性结合，这会阻碍组氨酸标签的亲和纯化。但GST标签则与之不同。由于GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，所以可以获得更高的纯度。 GST 标签蛋白纯化工具 GSH琼脂糖凝胶或者磁珠，高效纯化GST标签和GST融合蛋白 PurKine?GST-Tag纯化系统基于创新的高载量基质，确保一步操作即可从大肠杆菌和哺乳动物细胞表达系统的裂解液中高效纯化出重组GST融合蛋白和GSH结合蛋白。该产品线产品经过特殊优化，是确保纯化蛋白的稳定性、可溶性和产量的最优方案。 PurKine?GST-Tag纯化填料也可以以预装柱和试剂盒的形式提供，使用更加便捷。此外，Abbkine还提供琼脂糖凝胶树脂填料和磁珠形式产品。 GST树脂洗脱体积 (ml) 洗脱浓度 (mg/ml) 蛋白载量 （mg/ml） Abbkine 5 1.18 11.8 Supplier G 5 0.95 9.5 PurKine? GST-Tag Glutathione Resin 4FF比起G品牌产品，具有更高的洗脱效率和
蛋白载量. Fig. GST 重组蛋白纯化结果对比： PurKine ?GST-Tag Glutathione Resin 4FF (Lane B) ，G 品牌产品 (Lanec 注意事项： GST tag （谷胱甘肽巯基转移酶）的洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，如果蛋白不可溶，很难用变性的方法进行纯化。 https://www.docsj.com/doc/eb1352131.html, 产品名称 产品形式 货号 规格 PurKine ? GST-Tag Glutathione Resin Agarose Resin BMR20100 5ml/10ml/50ml/100ml PurKine ? GST-Tag Glutathione Packed Column Packed Column BMC20100 1ml ×5/3ml ×5 PurKine ? GST-Tag Purification Kit (Glutathione) Kit (Agarose Resin) KTP20100 1ml ×5/3ml ×5 PurKine ? GST-Tag Glutathione Resin 4FF Agarose Resin BMR20104 5ml/10ml/50ml/100ml PurKine ? GST-Tag Glutathione Packed Column 4FF Packed Column BMC20104 1ml ×5/3ml ×5 PurKine ? GST-Tag Glutathione Magbeads Agarose Magbeads BMM20100 1ml/5ml/10ml
实验八 亲和纯化GST融合蛋白
实验八单柱亲和纯化GST融合蛋白 Single Column Purification of GST Fusion Proteins N末端或C末端GST融合蛋白 纯化方法 运用谷胱甘肽琼脂糖凝胶(0.5-2 ml) 谷胱甘肽树脂预装柱(0.5-1 ml) 进行GST融合蛋白纯化的方法，适用于25-100 ml的诱导培养菌(纯化2.5-10 mg GST融合蛋白) 1. 细菌培养：直接挑取表达质粒新转化的单菌落, 加入25-100 ml LB+Amp液体培养基中（含 氨苄100 μg/ml），37℃振荡培养至OD600nm达0.5。 2. 诱导蛋白表达：加入终浓度为0.3 mM 的IPTG，30-37℃振荡培养3 h，诱导蛋白表达。设立 阴性对照。取样10-20 μl进行SDS-PAGE电泳, 取样1-2 μl进行Western blot鉴定。表达的时间和温度根据表达量, 可溶性和稳定性进行调整, 对于37℃不稳定或不溶的蛋白, 0.1 mM 的IPTG 20-25℃诱导培养6-20 h; 10-16℃振荡培养12-24 h. 3．细胞收集：5000×g离心10分钟(4℃), 弃上清。-20/-80℃贮存。细胞冻融利于破碎。4．破碎细胞:用5-10 ml的裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 0.1 NaCl) 将菌体重悬，超声破碎细胞(冰浴)，使融合蛋白释放。15000-19000×g离心30分钟，上清即为可溶性蛋白的细胞粗提物。上样5 μl进行SDS-PAGE电泳鉴定（Western:: 1∶10稀释, 上样5 μl）。5．谷胱甘肽树脂预装柱的平衡: 20 ml的缓冲液4℃进行柱平衡。每毫升谷胱甘肽树脂大约能够结合5-10 mg GST融合蛋白。 6．结合融合蛋白：用柱帽堵上，将澄清的细胞粗提物加入谷胱甘肽树脂预装柱(0.5 ml, # ; 1 ml, # )，4℃放置15-30 min。取少量流过液(上样5 μl)，并与细胞粗提物的PAGE电泳进行比较，鉴定蛋白结合效率。 7．洗柱：用10X 5-8 mL的缓冲液洗柱，可用 2x5 ml高盐缓冲液(0.5 M NaCl)洗柱。 8．融合蛋白的洗脱：用1-2 ml (每管~1/2柱床 体积) 10 mM 谷胱甘肽(# )的缓冲液将 目的蛋白洗脱, 收集4-6管。 9．SDS-PAGE电泳分析:上样5-15 μl进行 SDS-PAGE电泳鉴定。可通过280 nm UV 吸光 值或Bradford蛋白检测法进行检测。
GST蛋白表达、纯化步骤
Protein Expression Protocol: 1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, grow overnight; 2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight; 3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree; 4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS to resuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice; 5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition; 6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12% SDS-PAGE; 7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100 inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree; 8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS to resuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice; 9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition; 10.Prepare the supernatants for purification. 蛋白表达注意事项： 1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成 较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化； 2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。主要有以下方法可以减少包涵体的形成: a.降低IPTG的浓度。IPTG终浓度0.2～0.8μM都可以诱导细菌表达蛋白； b.加入IPTG后，把细菌生长温度降至16～30度。较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水 相互作用，从而可减少包涵体的形成； c.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻 止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl； d.供给丰富的培养基，优化培养条件，如供氧、pH等。 3.超声后加入终浓度1% Triton x-100处理30～60min，有利于去除膜碎片和膜蛋白； 4.若需表达的蛋白含稀有密码子较多，尝试更换E.c oli宿主菌株，如Rosseta。 5.若表达毒性蛋白，造成细菌死亡或者生长缓慢，可以使用pLysS 菌株。
GST融合蛋白柱上酶切
FriendBio,Your Trusted Friend in Scientic research！ GST融合蛋白柱上酶切 1. 试剂准备 缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH 值至8.0 缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione 易氧化，需现用现配 2. 层析柱准备 2.1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去离子水 2.2. 将GST亲和树脂悬浮，取2ml加入层析柱中，连接上恒流泵 2.3. 用5倍柱体积的缓冲液A进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用 3.柱上酶切 3.1. 裂解菌体，充分离心后收集上清 3.2. 取上清加入层析柱，置于旋转培养器上，室温孵育1h，收集流出液，留样待检 3.4. 用5倍柱体积的缓冲液A进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液，留样待检 3.5. 向层析柱中添加适量3C酶，并添加适量体积的缓冲液A，室温下进行柱上酶切~3h 3.6. 分别收集流穿和3倍柱体积缓冲液B清洗的洗脱产物，SDS-PAGE分析结果 3.7. 取上一步骤得到的流穿于新的GST亲和树脂再次进行GST亲和层析，收集流穿，即为酶切后的目的蛋白组分 3.8. 将纯化过程中得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分等）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化及酶切效果 详细步骤可参照GST亲和层析介质使用说明书
GST纯化蛋白
表达纯化GST融合蛋白 （准备工作：灭离心管上面没有刻度，有塞子的管子。很小的三角烧瓶，用锡箔纸封口）（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21（DE3）pLysS （2）活化：取20μl菌液加入11ml LB（Amp r）（500倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h） （3）取10ml菌液加入100ml LB（Amp r）（10倍稀释）（剩余菌液4°C保存） （4）37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8（OD600小于1.0即可） （5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置 （6）加入IPTG，终浓度1 mM （7）30°C，250rpm，诱导适当时间（预实验确定）章foxa2 16℃过夜 sirt1 25℃过夜（8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液 （9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞 （10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中（无气泡）注:配GST 时最后加PMSF能够减少很多泡沫。加PMSF，蛋白酶抑制剂，溶菌酶。 （11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W（冰浴）（12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min （13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入10ul 5×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存） （14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液（或PBS）重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS 上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存） （15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min （16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀注：如果蛋白在沉淀中说明形成包涵体，不容易纯化。 （17）考马斯亮蓝染色 （18）电泳的同时混匀glutathione sepharose beads（4B）（mixed slurry），取200μl加入15ml离心管中（2份） （19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清 （20）加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟（或过夜）（横放） （21）4°C，3000rpm，离心3min （22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次（冰上）GST裂解液加PMSF，ＤＴＴ，蛋白酶抑制剂。每次4℃摇床7分钟，3000rpm离心5分钟。 （23）10ml TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）洗涤2次（冰上） （24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油），混匀 （25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE(煮蛋白的时候，蛋白就会从GST珠子上掉下来离心上样时吸取上清) （26）-20°C保存beads （如果就是纯化蛋白不做下面的pull down就用GSH洗珠子，让其竞争性结合珠子，摇床离心取上清，蛋白要-80℃取上清，最后将上清，珠子都取出一些做考马斯亮蓝染色看看有没有将珠子从GST上洗脱下来） [附录] GST裂解缓冲液（前四个组分配好之后4°C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加）