GST 表达全攻略

摘要：来自通用电气医疗集团（GE Healthcare）的谷胱甘肽硫转移酶（GST）基因融合系统是一种表达、纯化和检测大肠杆菌中所产生的GST标签蛋白的多功能系统。系统包括三个主要成分：pGEX质粒表达载体、GST纯化的产品以及一系列GST检测产品。一系列切割GST 标签的位点特异蛋白酶则是该系统的补充。

GST亲和标签实现了温和的纯化过程，不会影响蛋白的天然结构和功能。

GST基因融合系统的优势包括：

?所有pGEX载体带有tac启动子，实现化学诱导的高水平表达

?温和、非变性的缓冲液成分，以分离活性蛋白

?基于Glutathione Sepharose?填料的亲和层析产品实现了从微克到克规模样品的一步纯化?方便的预装柱形式适合单个样品或平行筛选多个重组克隆

?pGEX载体上的PreScission?蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点能将目的蛋白从融合产物中切割下来

?利用抗-GST抗体轻松检测融合蛋白

在天然情况下，GST以分子量26,000的蛋白存在，它在大肠杆菌中的表达产物具有完全的酶活。经过鉴定，pGEX载体的重组日本血吸虫（Schistosomajaponicum）GST的晶体结构与天然蛋白一致。pGEX质粒载体将基因或基因片段与GST融合后，在细胞内高水平诱导表达。

重组蛋白很容易利用Glutathione Sepharose填料通过亲和层析从比如大肠杆菌细胞裂解液中纯化（图1），要么是预装柱，要么是分批纯化。

图 1. Glutathione Sepharose High Performance、Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 以及GlutahioneSepharose 4B目前都有大包装填料，预装柱以及多孔板，用于GST标签蛋白的纯化。

利用位点特异的蛋白酶，可实现目的蛋白与GST的切割，此蛋白酶的识别位点位于pGEX载体上多克隆位点的上游。GST标签的切除是在柱中进行的，作为纯化步骤或纯化后离线的一部分。重组蛋白可利用GST检测模块中提供的免疫分析来检测，或用抗-GST抗体在Western blotting中检测，或通过比色分析来检测。

pGEX载体

通过将一个基因或基因片段插入某个pGEX载体的多克隆位点，可构建出GST标签蛋白。载体提供了三种翻译读码框，从EcoRI限制性酶切位点开始（详见表1）。

pGEX载体是为基因或基因片段的高水平细胞内诱导表达而设计的。大肠杆菌中的表达产生了标签蛋白，GST部分在氨基端，目的蛋白在羧基端。目前有13个pGEX载体（详见图2）；所有载体都有tac启动子，用于高水平的化学诱导表达，以及内部的lac1q基因，在任何大

肠杆菌宿主中使用。

图2. 谷胱甘肽硫转移酶融合载体的图谱，显示出读码框和主要特征。所有13个载体在三种读码框内多克隆位点的下游都有终止密码子。（此图谱中未指出）。

9个载体有扩展的多克隆位点（MCS），含有6个限制性酶切位点。扩展的MCS有助于从多种市售λ载体的文库构建物中获得的cDNA片段的定向克隆。pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3都在GST结构域和多克隆位点之间编码了PreScission蛋白酶的识别位点，用于位点特异的切割。pGEX-4T-1、pGEX-4T-2和pGEX-4T-3都来自pGEX-2TK，含有凝血酶的识别位点。pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3则是pGEX-3X的衍生物，含有Xa因子的识别位点（详见表1）。

表1. pGEX载体的蛋白酶切割位点

pGEX-2TK设计独特，它通过融合产物的体外直接标记，实现了表达蛋白的检测。此载体含有从心肌中获得的cAMP依赖蛋白激酶的催化亚基的识别位点。蛋白激酶位点位于GST结构域和MCS之间。利用蛋白激酶和[γ-32P]ATP可直接标记表达的蛋白，用标准的放射测定或放射自显影技术可轻松检测。pGEX-2TK是pGEX-2T的衍生物；它的融合蛋白可用凝血酶来切割。pGEX载体都提供了三种翻译读码框，从EcoRI限制性酶切位点开始。pGEX-1λT、pGEX-6P-1、pGEX-4T-1和pGEX-5X-1可直接接受并表达分离自λgt11文库的cDNA片段。索取pGEX载体的更多资料

为了补充pGEX载体，目前还有GST载体的测序引物，可立即用于pGEX载体中插入的双链DNA的测序。

多种大肠杆菌宿主菌株可用于pGEX载体的克隆和表达。E.coli BL21，一种用于重组蛋白的最优表达的蛋白酶缺陷的冻干大肠杆菌宿主菌株，也可单独购买。（未完，待续）

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GST融合蛋白构建、表达与纯化

GST 表达融合蛋白 载体 pGEX-KG 大小：5006bp ，氨苄青霉素抗性（Amp r ），IPTG 诱导表达 酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、 HindIII 994 GST 分子量： 构建pGEX-KG-YFG 重组质粒 1、分析所感兴趣的基因（your favorite gene, YFG ） Primer Premier 5.0软件，分析YFG 含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG 载体的多克隆位点有重合 2、确定合适的双酶切位点

3、设计PCR上、下游引物 Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物 酶切位点外最多含6个碱基 3’端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾 3’端至少保证有10个碱基完全配对 得分（Rating）大于70 [注意] 上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框 下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA） 4、引物合成及保存 合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：beijing@https://www.docsj.com/doc/c115676365.html,，Tel：81767586）；纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳？；价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/μl（100μM），工作浓度：10pmol/μl（10μM），-20°C保存 5、PCR扩增YFG

模板：质粒10ng/μl稀释少量-20°C保存 引物：10pmol/μl（10μM）-20°C保存 Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2×Master Mix 扩增片段小于2.0kb 反应条件 （1）预变性94°C 5 min （2）变性94°C 30 s （3）退火待定30 s （4）延伸72°C 待定 （5）重复2-5 25-30个循环 （6）补平缺口72°C 10 min （7）暂存10°C [注意] 退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）－4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min 循环数小于30，减少错配 琼脂糖电泳检测PCR产物 0.8%有效分离范围：10~0.8kb；1.0%有效分离浓度7~0.5kb 50ml TAE加入5μl EB母液（5mg/ml） 100V，30-45min 拍照或者紫外灯下切胶回收 6、构建pGEX-KG-YFG 酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG 回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收 连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng 转化铺平板：Amp r 挑单克隆：Amp r（四个菌落足够了） 鉴定：小提质粒酶切or菌体PCR 7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 （1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根） （2）2 ml离心管中，加入25μl BL21+ 3μl质粒（300-500ng），混匀（质粒≤感受态1/10）（3）冰上放置30min （4）42°C，90s

GST融合蛋白的纯化步骤

GST融合蛋白的纯化步骤 一、制取细胞的裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS缓冲液; 2.加入溶菌酶至最终浓度1mg/ml，冰上或冷藏放置30min; 3.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动并温育10min; 5.4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 二、纯化GST融合蛋白： 1.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 2.混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 3.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 4.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 5.重复步骤3和4两次； 6.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 三、用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： 1.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; 3.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 四、蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： 1.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位1mlPBS 的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； 2.4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 3.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 五、谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3.4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。 查询关键词：GST融合蛋白的纯化步骤，GST蛋白纯化步骤，蛋白纯化 试验用的生化试剂，本公司均可以提供，如有需要，请联系我们，我们将为您提供最满意的服务。

GST-Pull-Down原理

分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解 GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。 GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间 新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。这两种实验的设计和实施都有所不同。

GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。我们实验室就是这么做的，当然也有细菌表达GST-A蛋白，而B蛋白通过细胞裂解液中得到，电泳后直接western blot检测。 1、首先你的目的是“要检测这两种蛋白是否与寄主细胞之间存在相互作用”，也即是说要寻找这两种蛋白的相互作用蛋白---在寄主细胞表面，也就是说你要寻找的相互作用蛋白是膜蛋白，对吗？pulldown似乎不是达到你目的的最佳办法，因为你首先要提膜蛋白。而膜蛋白一般都疏水，量少，好像难以pulldown----缓冲液系统不适合。我想，你真正的目的是检测寄主细胞表面是否有你这两个蛋白的受体或配体，细胞ELISA应该可以胜任这个目的。其他方法你可以在查查看？ 2、如何保证你融合蛋白（细胞提取物）的尽可能大的活性，只有一条：快速、低温纯化。即，要保证你纯化过程尽量低温，时间尽量短，得到蛋白后立刻冻纯-70。当然，你还是有必要做下你蛋白活性到底丧失有多快。 3、如果你还是执意要做pulldown，最好还是直接买珠子，试剂盒太贵了，不划算。

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)

第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天

1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS

GST融合蛋白的纯化

GST融合蛋白的纯化 诱导和收集菌体 在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。IPTG浓度一般为 0.1～1.0mM。 5000rpm 5min离心收集菌体。 亲和层析柱的制备 取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。 将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。 每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。 在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。 将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。 收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。 0.45um过滤后加入亲和层析柱。 室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。 用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。 配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。 用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。 测各管洗脱液蛋白浓度。 PAGE电泳检测纯度。 亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。或者按照beads使用说明书上的方法再生。 如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。 如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。

重组蛋白表达系统的选择

重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 宁

1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min 90min 18H 24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较

GST蛋白纯化步骤

制备细胞裂解物： 1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS; 2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min; 3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀； 4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min; 5. 4℃3000g(5000r/min)离心30min; 6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L; 纯化融合蛋白： 7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min; 8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白； 10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE; 11.重复步骤9和10两次； 12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白； 用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白： a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中; c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清； 蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞： a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。每毫升树脂加入50单位荣誉1mlPBS的蛋白酶，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～16h,用小规模实验确定精确时间； b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清小心移至新管中; 13.10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。 谷胱甘肽琼脂糖树脂的处理： 1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆； 2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆）； 3. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清; 4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,颠倒数次，混合匀浆，4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清； 5.每毫升树脂加入1ml冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，悬浮冰上放置待用。

分子机制-蛋白检测-GST-pulldown

主题：GST-pulldown 概述： GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。 其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。 目的： 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 原理： 利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

步骤： １.Glutathione琼脂糖珠预处理； ２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜； ３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上； ４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液； ５.将细胞裂解液上清加入beads； ６.加上SDS上样缓冲液； ７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。 流程图：

GST融合蛋白纯化方法

GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体； 2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h； 3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）； 以下步骤均在冰上操作： 4超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h； 5 2000 g，3min离心弃上清； 6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清； 7重复步骤6 两次； 8加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min； 92000 g，3 min离心，收集上清； 10重复步骤8-9至少两次； 11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度； 12将蛋白置于-20℃保存。 P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条 Thrombin cleavage (using thrombin produced by Amersham) 1. Thrombin cleavage of eluted fusion protein bound to Sepharose * Mix 50 μl of thrombin (< 10 cleavage U/ml) solution and 950 μl of 1 x PBS for each ml of Glutathione Sepharose bed volume Add thrombin protease mixture to Glutathione Sepharose pellet Gently shake or rotate the suspension at r.t. for 2-16 h Centrifuge the suspension at 500 x g for 5’ to pellet the beads and carefully transfer the eluted fraction to a clean tube. 2. Thrombin cleavage of eluted fusion protein. Add 10 μl of thrombin solution (10 cleavage units) per mg fusion protein. If the amount of fusion protein in the eluate has not been determined, add 80 μl (80 U) of thrombin for each ml of Glutathione Sepharose bed volume from with the fusion protein was eluted. Mix gently and incubate at r.t. (22-25C) for 2-16 h. Once digestion is complete, GST can be removed by first removing glutathione by extensive dialysis (2,000 vol/ml) against 1 x PBS followed by batch purification.

GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴　爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.docsj.com/doc/c115676365.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴　爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州　510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海　200031) 摘　要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1　材料和方法1.1　材料1.1.1　菌株、质粒　人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2　生化试剂和分子生物学试剂　引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2　方法1.2.1　目的基因的扩增及纯化　根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2　pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建　将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3　重组质粒的筛选和鉴定　将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3

GST标签蛋白纯化的GSH磁珠

GST标签蛋白纯化的GSH磁珠 产品组分 储存方法 保存于20%乙醇中，2-8℃保质期一年。切勿冻存。 (1). 还原型谷胱甘肽容易氧化，Elution Buffer要求现配现用；(2). 不同的GST融合蛋白与磁珠结合的强弱程度不同，对大部分的GST融合蛋白，使用含有10 mM还原性谷胱甘肽的Elution Buffer即可洗脱目标蛋白。对少数结合能力较强的GST融合蛋白，可以适当延 长洗脱时间，增加洗涤次数，或提高Elution Buffer中还原型谷胱甘肽的浓度。 (3). Binding Buffer和Elution Buffer中可以添加1~5mM EDTA，1~10mM DTT，0.1~1% Triton X-100，0.1~1% Tween 20等，以 提高目标蛋白的稳定性。A. 大肠杆菌、酵母等细胞内表达蛋白：表达细胞用适量Binding Buffer稀释，加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；冰浴 超声裂解细胞，即为粗蛋白样品。如果样品过于粘稠，可根据需要在 粗样品中加入适量核酸酶，在冰上放置30min，以降解核酸。另外，如果目标蛋白含量较低，建议将粗蛋白样品进行离心操作。 B. 胞外表达蛋白：取胞外表达上清，用等量Binding Buffer稀释平衡 ，即为粗蛋白样品。 C. 动物细胞胞内表达蛋白：取适量动物细胞，用适量PBS洗涤1次，弃上清；用适量含1%(v/v) Triton X-100或1%(v/v) NP-40的Binding Buffer重悬；加入蛋白酶抑制剂（如Biotool Cat.# B14001）；置于冰上10min，即为粗蛋白样品。一般情况下，磁珠的使用量是由用户根据目标蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目标蛋白，250 mL发酵液收获1g湿重的菌体，通过预实验估算其目标蛋白产量为5～10mg，则需要取10 mL 10%(v/v)的磁珠悬液用于目标蛋白的纯化，以下即以此为例进行详细说明。 本手册提供以下三种样品的处理方法： 目标蛋白与磁珠的结合性能将直接影响目标蛋白的纯化效率，各种缓冲液配制也将在一定程度上影响目标蛋白的回收率和纯度。因此，在较大规模蛋白纯化之前，用户应该自行设计实验，筛选出适合目标蛋白的缓冲液，包括结合缓冲液(Buffer A )和洗脱缓冲液(Buffer B)。 以下提供一个较强结合力的GST标签蛋白的纯化流程，以供参考。 实验方法 1. 缓冲溶液配制 2. 样品处理 3. 磁珠预处理 A. Binding Buffer : 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH 7.4 B. Elution Buffer : 50 mM Tris- HCl, 10 mM GSH, pH 8.0. Preparation Method: Add 0.307g GSH to 100 mL 0.1 M Tris- HCl, then adjust pH to 8.0 with 0.1 M HCl and add deionized water to a total volume of 100 mL.注： 1. Buffer Preparation 2. Sample Preparation 3. Magnetic beads pretreatment 4. Protein Binding 5. Washing 6. Elution 7. After treatment of magnetic beads 8. Regeneration of magnetic beads Magnetic Beads Cells/bacterium Target protein Other proteins Magnetic Separator Collect Supernatant Pipette Repeat Binding buffer Washing buffer Elution buffer 12 3

GST蛋白纯化

三．GST融合蛋白纯化 （1）GST亲和纯化 1．介质保存：20％乙醇 2．所需试剂： ①10×PBS（1L）：pH7.4 (4℃) 150mM NaCl（87.75g），16mMNa2HPO4(57.3g)，4mM NaH2PO4(6.24g) ②10×洗脱前buffer（100ml）：pH8.0 (25℃) 50mM Tris（6.1g），100mM NaCl(5.8g) ③洗脱buffer即凝血酶酶切buffer(500ml)：pH10.0 (25℃)加入谷胱甘肽后pH变为8.0 50mM Tris（3.035g），100mM NaCl(2.925g) 洗脱前加1M CaCl2至终浓度2.5mM，加还原型谷胱甘肽（干粉）至终浓度20mM 也有文献使用谷胱甘肽终浓度为10mM，未对比过。 8ml介质结合的融合蛋白一般用30ml洗脱buffer（加75μl CaCl2和0.12g还原型谷胱甘肽）④3M NaCl 3．纯化步骤及注意事项： ①PBS平衡柱子：至少5个柱体积 ②上样：经对比发现，上样流速需极慢才能结合，一般上样过夜（纯化原理是谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白对谷胱甘肽的亲和力） ③PBS洗杂蛋白：洗到紫外监测基线平，至少1小时，时间充分的话最好用较慢流速洗2到3小时，这样洗脱下来的目的蛋白中杂蛋白较少。 ④洗脱前buffer换体系：至少2个柱体积，8ml介质一般用20ml ⑤洗脱buffer洗脱蛋白：洗脱速度很快，一般第2、3管浓度最大，注意收峰 ⑥3M NaCl再生柱子：一般会洗出一个小盐峰，再生时间不可过长，否则对柱子有伤害，5个柱体积即可 （2）凝血酶酶切融合蛋白（以NGB为例） 先后使用过sigma和鼎国的凝血酶，sigma的酶效率更高。 鼎国凝血酶买来为干粉，3000U每管，溶于1ml凝血酶酶切buffer（补1M CaCl2至终浓度2.5mM），分装至每管10μl共100管，30U/管。 合并GST柱下来的目的蛋白，紫外分光光度计OD595测蛋白浓度。用鼎国凝血酶摸酶浓度：每35mg蛋白用凝血酶50μl，酶切约20小时。 对比25℃水浴酶切和摇床中酶切，定时取样检测酶切结果，发现摇床中酶切更快（可能是摇动过程中酶与蛋白能充分结合），但摇床中酶切产生的沉淀也更多。 GST琼脂糖凝胶FF 一、简介 GST琼脂糖凝胶是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它的谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白的亲和色谱填料，一步分离就可得到很纯的目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。 本产品是本公司自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，很好的物理和化学稳定性，使用寿命长，使用方便。良好的批次重复性，易于放大，所以无论是研发还是生产都是理想的选择。 二、亲和填料特性：

实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定

实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG

GST 标签蛋白纯化工具

https://www.docsj.com/doc/c115676365.html, GST 标签融合蛋白 -纯化、检测 谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个含有211个氨基酸的蛋白，通常将该蛋白加入到重组蛋白的末端以便对该重组蛋白进行纯化或检测。具有组氨酸的非融合蛋白会产生非特异性结合，这会阻碍组氨酸标签的亲和纯化。但GST标签则与之不同。由于GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，所以可以获得更高的纯度。 GST 标签蛋白纯化工具 GSH琼脂糖凝胶或者磁珠，高效纯化GST标签和GST融合蛋白 PurKine?GST-Tag纯化系统基于创新的高载量基质，确保一步操作即可从大肠杆菌和哺乳动物细胞表达系统的裂解液中高效纯化出重组GST融合蛋白和GSH结合蛋白。该产品线产品经过特殊优化，是确保纯化蛋白的稳定性、可溶性和产量的最优方案。 PurKine?GST-Tag纯化填料也可以以预装柱和试剂盒的形式提供，使用更加便捷。此外，Abbkine还提供琼脂糖凝胶树脂填料和磁珠形式产品。 GST树脂洗脱体积 (ml) 洗脱浓度 (mg/ml) 蛋白载量 （mg/ml） Abbkine 5 1.18 11.8 Supplier G 5 0.95 9.5 PurKine? GST-Tag Glutathione Resin 4FF比起G品牌产品，具有更高的洗脱效率和

蛋白载量. Fig. GST 重组蛋白纯化结果对比： PurKine ?GST-Tag Glutathione Resin 4FF (Lane B) ，G 品牌产品 (Lanec 注意事项： GST tag （谷胱甘肽巯基转移酶）的洗脱条件温和，有助于保持蛋白功能活性，适合pull-down 检测，具有很好的线性动态范围，但分子量较大，可能会影响蛋白质的功能和下游实验，如果蛋白不可溶，很难用变性的方法进行纯化。 https://www.docsj.com/doc/c115676365.html, 产品名称 产品形式 货号 规格 PurKine ? GST-Tag Glutathione Resin Agarose Resin BMR20100 5ml/10ml/50ml/100ml PurKine ? GST-Tag Glutathione Packed Column Packed Column BMC20100 1ml ×5/3ml ×5 PurKine ? GST-Tag Purification Kit (Glutathione) Kit (Agarose Resin) KTP20100 1ml ×5/3ml ×5 PurKine ? GST-Tag Glutathione Resin 4FF Agarose Resin BMR20104 5ml/10ml/50ml/100ml PurKine ? GST-Tag Glutathione Packed Column 4FF Packed Column BMC20104 1ml ×5/3ml ×5 PurKine ? GST-Tag Glutathione Magbeads Agarose Magbeads BMM20100 1ml/5ml/10ml

实验八 亲和纯化GST融合蛋白

实验八单柱亲和纯化GST融合蛋白 Single Column Purification of GST Fusion Proteins N末端或C末端GST融合蛋白 纯化方法 运用谷胱甘肽琼脂糖凝胶(0.5-2 ml) 谷胱甘肽树脂预装柱(0.5-1 ml) 进行GST融合蛋白纯化的方法，适用于25-100 ml的诱导培养菌(纯化2.5-10 mg GST融合蛋白) 1. 细菌培养：直接挑取表达质粒新转化的单菌落, 加入25-100 ml LB+Amp液体培养基中（含 氨苄100 μg/ml），37℃振荡培养至OD600nm达0.5。 2. 诱导蛋白表达：加入终浓度为0.3 mM 的IPTG，30-37℃振荡培养3 h，诱导蛋白表达。设立 阴性对照。取样10-20 μl进行SDS-PAGE电泳, 取样1-2 μl进行Western blot鉴定。表达的时间和温度根据表达量, 可溶性和稳定性进行调整, 对于37℃不稳定或不溶的蛋白, 0.1 mM 的IPTG 20-25℃诱导培养6-20 h; 10-16℃振荡培养12-24 h. 3．细胞收集：5000×g离心10分钟(4℃), 弃上清。-20/-80℃贮存。细胞冻融利于破碎。4．破碎细胞:用5-10 ml的裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 0.1 NaCl) 将菌体重悬，超声破碎细胞(冰浴)，使融合蛋白释放。15000-19000×g离心30分钟，上清即为可溶性蛋白的细胞粗提物。上样5 μl进行SDS-PAGE电泳鉴定（Western:: 1∶10稀释, 上样5 μl）。5．谷胱甘肽树脂预装柱的平衡: 20 ml的缓冲液4℃进行柱平衡。每毫升谷胱甘肽树脂大约能够结合5-10 mg GST融合蛋白。 6．结合融合蛋白：用柱帽堵上，将澄清的细胞粗提物加入谷胱甘肽树脂预装柱(0.5 ml, # ; 1 ml, # )，4℃放置15-30 min。取少量流过液(上样5 μl)，并与细胞粗提物的PAGE电泳进行比较，鉴定蛋白结合效率。 7．洗柱：用10X 5-8 mL的缓冲液洗柱，可用 2x5 ml高盐缓冲液(0.5 M NaCl)洗柱。 8．融合蛋白的洗脱：用1-2 ml (每管~1/2柱床 体积) 10 mM 谷胱甘肽(# )的缓冲液将 目的蛋白洗脱, 收集4-6管。 9．SDS-PAGE电泳分析:上样5-15 μl进行 SDS-PAGE电泳鉴定。可通过280 nm UV 吸光 值或Bradford蛋白检测法进行检测。

GST蛋白表达、纯化步骤

Protein Expression Protocol: 1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, grow overnight; 2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight; 3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree; 4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS to resuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice; 5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition; 6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12% SDS-PAGE; 7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100 inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree; 8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS to resuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice; 9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition; 10.Prepare the supernatants for purification. 蛋白表达注意事项： 1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成 较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化； 2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。主要有以下方法可以减少包涵体的形成: a.降低IPTG的浓度。IPTG终浓度0.2～0.8μM都可以诱导细菌表达蛋白； b.加入IPTG后，把细菌生长温度降至16～30度。较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水 相互作用，从而可减少包涵体的形成； c.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻 止分泌到周质的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl； d.供给丰富的培养基，优化培养条件，如供氧、pH等。 3.超声后加入终浓度1% Triton x-100处理30～60min，有利于去除膜碎片和膜蛋白； 4.若需表达的蛋白含稀有密码子较多，尝试更换E.c oli宿主菌株，如Rosseta。 5.若表达毒性蛋白，造成细菌死亡或者生长缓慢，可以使用pLysS 菌株。