多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定

一、引言

食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。

二、原理

邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。

把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。

所有上述过程的主要反应式如下：

酶

邻苯二酚邻苯二醌

邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸

KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I2

3I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI

三、材料和设备

苹果；马铃薯。

研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。

四、试剂

1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。

2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。

3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。4．0.04N抗坏血酸溶液：用粗天平称取0.35克抗坏血酸溶解到蒸馏水中，用水稀释至100毫升，混匀。溶液只能用一天。

5．5%的偏磷酸溶液：50克偏磷酸（经验式HPO3）溶解到蒸馏水中，稀释至1升后混匀，保存于磨口玻璃瓶中。

6．0.5%可溶性淀粉。

五、操作程序

称1克新鲜的植物材料，加蒸馏水于瓷研钵中研细，转移到50毫升容量瓶，混匀。充分振荡勿使沉淀下沉，吸10毫升这种悬浮液，倒入250毫升三角瓶中。加入1毫升pH6.4的磷酸缓冲液，再加入5毫升0.4N的抗坏血酸溶液，混匀。加入5毫升0.2%的邻苯二酚溶液，同时开始计时并充分振荡。为使空气中的氧气不断进入溶液一直要均匀地振荡2分钟。经精确作用2分钟后，加入5毫升5%的偏磷酸溶液以停止反应。（整个实验都应在20℃进行。即反各种试剂样液都予先放到20℃环境中，做时也在20℃环境下做，加入偏磷酸量还可根据自己的模索而定）。加入1毫升0.5%的淀粉溶液，用0.01N碘酸钾溶液滴定坑坏血酸的剩余物，直至兰色不消失为止。

同时进行对照滴定。为此吸取10毫升悬浮液注入另一只三角瓶中，加5毫升偏磷酸，再加入1毫升pH6.4磷酸缓冲液，5毫升0.4N抗坏血酸，再加淀粉液，也用0.01NKIO3溶液滴定。

六、计算多酚氧化酶活性

式中：A——多酚氧化酶活性（1克分析物质，20℃下，1min氧化抗坏血酸的微克分子数）；50——分析材料悬浮液的总体积；（ml）；

n——分析材料的重量（g）；

10——测定酶活性所取的悬浮液体积（ml）；

2——反应时间（min）；

a——用于滴定对照的0.01KIO3溶液体积（ml）；

b——用于样品滴定的0.01NKIO3溶液体积（ml）；

5——0.01N抗坏血酸溶液每ml换算为微克分子数抗坏血酸的系数（）。

多酚氧化酶活性测定及控制[文献综述]

毕业论文文献综述 生物工程 多酚氧化酶活性测定及控制 1 前言 多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。本文总结了多酚氧化酶的活性测定方法以及对其活性的控制，主要研究了抑制剂对其活性的影响，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。 多酚氧化酶（PPO）作为一种植物酶类，是引起果蔬褐变的主要因素。鲜切果蔬因组织被切分使PPO与酚类底物的接触机会增加，酚类物质被氧化成棕褐色的醌，导致产品褐变。抑制PPO活性取决于抑制剂的性质和浓度、底物的可利用性、pH值和温度。一些还原剂、酶类、螯合剂和蜂蜜等均已被用于防止果蔬酶褐变。本文主要总结了抑制剂对于控制果蔬PPO活性的研究。 2 主题部分 2.1 从果蔬中提取PPO（以莲藕为例） 2.1.1 丙酮法（丙酮法提取所得酶液比活力最高。适合需大量制样时使用） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加4倍量预冷至．18。C的丙酮(w／v为1：4)捣碎，搅拌3min，抽滤，冷风吹干残渣后，混匀，得丙酮粉。称取丙酮粉O．5 g，加入0．2 mol／L，pH为5．4的预冷磷酸二氢钠．柠檬酸缓冲液20ml，搅拌3min，8 000r／min离心10min，所得上层清液即为粗酶液。【1】 2.1.2 匀浆法（匀浆法提取的酶液没有活性） 将莲藕洗净，去皮，切碎，加入0．05mol／L，pH5．4的预冷磷酸氢二钠．柠檬酸缓冲溶液(含5％的PVPP)，料液比为1：2．2，捣碎，搅拌，抽滤。向滤渣中加入0．05mol／L，pH5．4磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲溶液(W／V为1：1)再次搅拌，抽滤，两次滤液合并，8 000r／min离心10rain，所得上清液即为粗酶液。【2】 2.2.3 匀浆浸提法（匀浆浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作简便，提取所得粗酶液活性

多酚氧化酶活性测定

实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定 一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O 2 ——————→ 邻醌＋ H 2 O 三、材料、仪器及试剂 1. 材料：马铃薯块茎等 2. 仪器：UV－1206或UV－1240分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3. 试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.01mol·L－1pH 6.5磷酸缓冲液；0.1m mol·L －1pH6.5磷酸缓冲液；0.05 mol·L－1pH5.5磷酸缓冲液；30%饱和度硫酸铵；0.1 mol·L－1儿茶酚； 20％三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备 称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1mol·L－1pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2～3ml 0.01mol·L－1 pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定

在试管中加入3.9ml 0.05 mol·L－1 pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol·L－1儿茶酚在37℃恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1～2min 内测定吸光度变化（A）值。 五、酶活性的计算 值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力以每min内A 525 和比活性。 A 酶提取液总量（ml） 酶活力（0.01A·min－1）＝———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量（ml） A 酶提取液总量（ml） 酶的比活性(0.01A·g－1Fw·min)=————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量（ml） 公式中：A —为反应时间内吸光度的变化值；W为样品鲜重（g）。

多酚氧化酶特性研究

多酚氧化酶特性研究 摘要: 采用分光光度法, 对板栗仁多酚氧化酶( PPO) 的催化特性、最适波长、最适反应时间、最适温度、最适pH 值、热稳定性等性质进行了研究, 同时研究了Vc、EDTA、NaCl、柠檬酸4种添加剂对板栗仁多酚氧化酶活性的影响。结果表明: 板栗仁多酚氧化酶催化氧化产物的最大吸收波长为410nm, 最佳反应时间为3min, 最适反应温度为30℃ , 最适pH 值为6. 0, 米氏常数Km = 0.0694mo l/L, Vmax = 3.918OD/min。95℃水浴处理5min该酶已基本失活, 其中V c和EDTA对板栗仁多酚氧化酶酶促褐变有很好的抑制效果。 关键词: 板栗; 多酚氧化酶; 褐变; 抑制多酚氧化酶( Polyphenolox idase, PPO ) 是由核基因编码的铜金属酶, 其酶促褐变机制是: 内源性酚类物质在多酚氧化酶的催化下氧化生成醌, 醌再相互作用生成高分子聚合物, 从而导致褐色素的生成。它能催化两类不同的反应, 可以使一元酚羟基化, 生成相应的邻二羟基化合物;也可以氧化邻苯二酚生成醌[ 1]。而酚类物质是果疏组织褐变的物质基础, 不同植物、同一植物的不同组织, 同一植物的不同品种、生长环境以及不同的发育期, 其褐变的主要酚类物质均有所不同, 导致酶褐变活性也有所差异。云南富产板栗, 但对板栗仁PPO 的活性及影响活性因素的研究则未见报道。1材料与方法 1.1材料 板栗市场购外观良好, 无病虫害, 无机械损伤新鲜的云南板栗。 1.2试剂与仪器 主要试剂: 聚乙烯吡咯烷酮( PVPP)、邻苯二酚、乙酸钠、冰乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇、乙醛、盐酸、维生素C ( V c)、EDTA、柠檬酸、氯化钠等, 均为国产分析纯。 主要试验仪器: TGL - 16G 高速台式冷冻离心机、722W 型分光光度计、HH - 4型数显恒温水浴锅、冰箱等。 1.3试验方法 1.3.1粗酶液的制备 酶液提取参照文献[ 2] 的方法, 有所改进。称150g 冷冻鲜样, 加入PH 值6.0 的0.05mol /L冷冻磷酸缓冲液150mL 和15gPVPP, 打浆, 过滤, 于3℃下12000r /min 离心15min, 取上清液置于0~ 4℃保存备用。 1.3.2褐变度( BD) 的检测 称5g 样品加入15mL 蒸馏水中研磨, 离心( 14000r/min、15min)。沉淀溶于15mL 甲醇甲酸溶液(体积比1:1), 充分浸提15min 后离心。 将两次所得上清液混匀后用蒸水定容为25mL, 离心, 取上清液检测410nm 下的吸光值An ×10 表示。 1.3.3总酚( TP) 的提取和含量检测 称取5g 样品, 加入15mL 乙醛- 盐酸溶液( pH3.0) 研磨, 在恒温水浴中震荡1h, 取出离心15000r /min, 30min, 量取滤液体积, 吸取5mL, 用蒸水定容到50mL, 测定A 值, 用邻苯二酚做标准曲线。 1.3.4酶活性的测定 取2mL 0.2mol/L 邻苯二酚溶液和2mL一定pH值的磷酸缓冲溶液加入到试管中, 然后加入0.5ml的粗酶液, 水浴保温3min后立即倒人比色管中, 在410nm波长处测定反应混合液的吸光值变化(△A), 每30s读数1次, 共记录3min。空白用

多酚氧化酶的活性测定的报告

朴东日：多酚氧化酶活性的测定。一、试验目的 本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原 理及操作技术。 二、试验原理 酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓 冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色 的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生 变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 三、试验材料、试剂及试验用品 材料：李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理：果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发 育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯 处理。 药品：预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ １ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚 ４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４） 四、实验方法：

1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。 2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。 3.最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。(注意空白为：2.5 mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为：以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。 4.多酚氧化酶酶活的计算公式：E=M×60/V (式1)式中：M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。

茶叶多酚氧化酶活性测试

江南大学-食品化学实验讲义茶葉多酚氧化酶的活性測定 茶葉多酚氧化酶的活性測定 一、目的要求 通過實驗，掌握茶葉多酚氧化酶活性的測定方法。 二、基本原理 茶葉多酚氧化酶是茶樹體內最重要的酶類之一，它不僅在茶樹生理代謝 過程中起著重要作用，而且在茶葉加工，尤其在紅茶製造過程中，催化 多酚類物質的氧化也起著主導作用。 多酚氧化酶的活性檢測方法，包括檢壓法、分光光度法、氧電極法和滴 定法等。多酚氧化酶是一種含銅的氧化酶，在一定的溫度、pH條件下， 有氧存在時，能使催化鄰苯二酚氧化生成有色物質，單位時間內有色物 質在460nm處的吸光度與酶活性強弱成正相關，即可計算出多酚氧化酶 的活力和比活性。反應式如下： 多酚氧化酶 鄰苯二酚（兒茶酚）＋1∕2 O2——————→ 鄰醌＋ H2O 三、材料、儀器及試劑 1、材料：茶樹鮮葉。 2、儀器：721型分光光度計；離心機；恆溫水浴；研缽或勻漿機；試管；移液管；紗布袋等。 3、試劑：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.1M磷酸緩衝液（pH6.5）；硫酸銨；1%鄰苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M尿素溶液或20%三氯醋酸。 四、操作步驟 1、粗酶液的製備 稱取洗盡茶樹鮮葉5.0g於研缽（或勻漿機）中，加入2g 不溶性聚乙烯吡 咯烷酮（事先用蒸餾水浸洗，然後過濾以除去雜質）和100ml 0.1M pH6.5磷酸緩衝液,磨成勻漿，用幾層紗布袋過濾，濾液加入30%飽和度硫酸銨，

離心除沉澱，上清液再加硫酸銨使達60％飽和度，離心收集沉澱。將所 得沉澱溶於2~3ml 0.1M pH6.5磷酸緩衝液中，即為粗製酶液。 2、活性酶的測定 取酶液1ml於離心管中，加入3ml反應混合液（2.0ml 0.1M pH6.5磷酸緩 衝液，0.6ml 1%鄰苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恆溫水 浴中保溫10min，立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml終止反應。 4000rpm離心10min。取上清液，用1cm比色皿，在460nm波長處，在1~2min內測定吸光度值（A）。空白對照用緩衝液代替反應液中的鄰 苯二酚，其它條件相同。 五、酶活性的計算 以每克樣每分鐘內A460增加0.1為1個酶活力單位。 A460×酶提取液總量（ml） 酶活力（0.1A?g-1?min-1）＝—————————————————————————— 0.1×反應時間（min）×樣品鮮重（g）×測定時酶液用量（ml） 六、注意事項 1、反應混合液必須現配現用，否則會因鄰苯二酚自動氧化而失效；鄰苯 二酚還可用兒茶素代替。 2、脯氨酸是用作有色氧化產物形成的穩定劑和加速劑。

多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书

货号：QS1404 规格：50管/24样 多酚氧化酶检测试剂盒(PPO)说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。 测定原理： PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在525nm有特征光吸收。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体，60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体，40mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体，10mL×1瓶，4℃避光保存； 粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）或果汁样本的处理： 按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。 5min 第1页，共2页

茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定(3学时)解析

实验一茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定（3学时） 一、目的要求 1、通过实验，掌握茶叶多酚氧化酶活性的测定方法。 2、理解酶活性测定常规方法及一般原理。 二、基本原理 茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要作用，而且在茶叶加工，尤其在红茶制造过程中，催化多酚类物质的氧化也起着主导作用。 多酚氧化酶的活性检测方法，包括检压法、分光光度法、氧电极法和滴定法等。多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下： 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2 ——————→ 邻醌＋H2O 三、仪器及试剂 1、材料：茶树鲜叶。 2、仪器：721型分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。 3、试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；0.1M磷酸缓冲液（pH6.5）；硫酸铵；1%邻苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M尿素溶液或20%三氯醋酸。 四、操作步骤 1、粗酶液的制备：称取洗尽茶树鲜叶5.0g于研钵（或匀浆机）中，加入2g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2~3ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2、活性酶的测定：取酶液1ml于离心管中，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液，0.6ml 1%邻苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恒温水浴中保温10min，立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml终止反应。4000rpm离心10min。取上清液，用1cm比色皿，在460nm波长处，在1~2min内测定吸光度值（A）。空白对照用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚，其它条件相同。 五、结果计算 以每克样每分钟内A460增加0.1为1个酶活力单位。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020

实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的 1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。 2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。 二、实验原理 马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。 多酚氧化酶 邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O 2——————→邻醌＋H 2 O

三、试验材料、试剂及试验用品 1．材料：马铃薯块茎。 2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶 3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠 四、实验方法： 1.多酚氧化酶的提取 取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。 2.多酚氧化酶活性测定 采用比色法测定。将ｍl邻苯二酚加入2ｍl磷酸缓冲液（ｐＨ）中，加入ｍl酶提取液，立即于波长410nm下测定吸光值，2min后再计吸光值，以不加酶提取液的反应液做对照(注意空白为： ml缓冲液和 mL邻苯二酚溶液)。以每分钟吸光度变化为1个多酚氧化酶活性单位。 表1 多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定 实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的 通过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。 二、原理 多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。用分光光度法在525nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。反应式如下: 多酚氧化酶 邻苯二酚(儿茶酚)，1?2 O ——————? 邻醌， HO 2 2 三、材料、仪器及试剂 1. 材料:马铃薯块茎等 2. 仪器:UV,1206或UV,1240分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵或匀浆机;试管;移液管;纱布袋等。 ,13. 试剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP);0.01mol?L pH 6.5磷酸缓冲液;0.1m mol?L,1,1pH6.5磷酸缓冲液;0.05 mol?L pH5.5磷酸缓冲液;30%饱和度硫酸 铵;0.1 ,1mol?L儿茶酚; 20,三氯乙酸。 四、实验步骤 1. 粗酶液的制备 称取马铃薯块茎5g于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮(事先用蒸馏,1水浸洗，然后过滤以除去杂质)和100ml 0.1mol?LpH6.5磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加,1

硫酸铵使达60,饱和度，离心收集沉淀。将所得沉淀溶于2,3ml 0.01mol?L pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。 2. 活性酶的测定 ,1,1在试管中加入3.9ml 0.05 mol?L pH5.5磷酸缓冲液，1.0ml 0.1 mol?L 儿茶酚在37?恒温水浴中保温10min ，然后加入0.5ml酶液(可视酶活性增减用量)，迅速摇匀，倒入比色杯内，于525nm波长处以时间扫描方式，在1,2min内测定吸光度变化(A)值。 五、酶活性的计算 以每min内A值变化0.01为1个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力525 和比活性。 A 酶提取液总量(ml) ,1 酶活力(0.01A?min),———————×——————————— 0.01×反应时间测定时酶液用量(ml) A 酶提取液总量(ml) ,1酶的比活性(0.01A?gFw?min)=————————×—————————— 0.01×W×反应时间测定时酶液用量(ml) 公式中:A —为反应时间内吸光度的变化值;W为样品鲜重(g)。

苹果中多酚氧化酶最适-pH-的测定

实验二苹果中多酚氧化酶最适pH 的测定 一、实验原理 存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变。因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。多酚氧化酶是一种含铜离子的酶，它能催化两类不同的反应。一是一元酚羟基化，二是邻-二酚氧化。在一些植物中，多酚氧化酶能同时催化这两类反应；而在另一些植物中，多酚氧化酶仅能催化邻-二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。如果采用邻-二酚作底物，那么随着酶催化反应进行，反应混合物的吸光值因邻-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。 二、试剂和仪器 试剂：0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH分别为3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L 磷酸盐缓冲液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L儿茶酚溶液、0.05mol/L 磷酸盐缓冲液，pH=6.5、丙酮 仪器：组织捣碎机、抽滤装置、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器、离心机 三、实验步骤 1、从苹果中萃取多酚氧化酶 将100 g苹果迅速去梗和核后切成小块，和400mL左右预先冷冻至－26℃的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（20,000 rpm，2 min），然后迅速抽滤，保留滤纸上的沉淀部分，将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去，至沉淀无丙酮味。将所得丙酮粉转移至150 mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，搅拌30 min，然后离心（4℃,10000 r/m,20 min），离心所得上清液如有混浊，则用8层纱布过滤，从而得到多酚氧化酶提取液。 2、不同pH下多酚氧化酶活力的测定 在比色皿中分别加入1.8~1.1 mL pH为3.6的缓冲液和0.7mL儿茶酚溶液，搅匀后加入0.5~1.2mL多酚氧化酶提取液，迅速搅匀，测定反应混合物在400 nm 下的吸光值随时间的变化，参比以缓冲液代替酶液。依次测定4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0几个pH。

酶活性测定方法

一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；

多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定

多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定方法 （一） 试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。 2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。 3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。 4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。 贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。 贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升） 5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配） 方法： 1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。 2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。 3、结果计算：A多酚=0.44{[⑥-(④+⑤)/2]-[③-(①+②)/2]}*V1/V2/W/t V1：提取时酶液总量（毫升）V2：测定时酶液用量（毫升） ①、②、③、④、⑤、⑥：测定时消耗碘液量（毫升） t：酶反应时间（分） 2 4 2 2 同上 3 4 2 2 1 空白测定 4 4 2 1 2 测多酚氧化酶 5 4 2 1 2 同上 6 4 2 1 2 1 空白测定

多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚微板法)

多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚微板法) 简介： 多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性，多酚氧化酶是一种蛋白体 Leagene 多酚氧化酶(PPO)检测试剂盒(邻苯二酚比色法)检测原理是以邻苯二酚作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪420nm 处检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的多酚氧化酶活性，尤其适用于检测水果中多酚氧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、研钵或匀浆器 3、离心管或试管 4、低温离心机 5、酶标板 6、酶标仪 操作步骤(仅供参考)： 1、准备样品： ①植物样品：取植物组织或水果中层果肉加入预冷的PPO Lysis buffer 研磨或匀浆，10000g，4℃离心，留取上清液，-20℃冻存，用于多酚氧化酶的检测。 ②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，-20℃冻存，用于多酚氧化酶的检测。 ③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用PPO Lysis buffer 进行适当匀浆，10000g，4℃离心，取上清液，-20℃冻存，用于多酚氧化酶的检测。 编号 名称 TE0427120T Storage 试剂(A):PPO Lysis buffer 500ml 4℃避光试剂(B):PPO Assay buffer 5ml 4℃避光使用说明书 1份

植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定

植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定 作者:《果蔬贮藏加工学实 来源:华南农大浏览数:2949 录入:2007-6-16 14:53:40 验指导》 植物抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的测定 一、原理 抗坏血酸氧化酶能利用空气中的氧氧化抗坏血酸成为脱氢抗坏血酸；多酚氧化酶可催化 空气中的氧氧化多酚，成为相应的醌，形成的醌能被抗坏血酸还原。 因此，在酶提取液中加入抗坏血酸，可测定抗坏血酸氧化酶的活性，加入抗坏血酸及焦 儿茶酚，可测定抗坏血酸及多酚氧化酶两者的活性，相减即可求出多酚氧化酶的活性。抗坏 血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸。碘酸钾在酸性条件下与碘化钾反应放出碘， 放出的碘与抗坏血酸作用，将之氧化成脱氢抗坏血酸，多余的碘能使淀粉变为蓝色。 二、材料与设备 材料：马铃薯块茎 设备：水浴锅、台秤、离心机 试剂：pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液、0.1％抗坏血酸、0.02mol/L焦儿茶酚、10％三氯乙 酸、1％淀粉。 0.05mol/L碘液：碘化钾2.5g溶于200ml蒸馏水，加冰醋酸1ml，再加0.1mol/L碘酸钾 12.5ml，定容至250ml。 三、试验步骤 （一）酶液制备： 称取马铃薯块茎10.0g，用预冷pH6.0 1/15mol/L磷酸缓冲液，研磨匀浆，定容至50ml， 在18-20℃水浴浸提30分钟，中间摇动数次，再于3000×g离心10分钟，取上清液，4℃保存备 用。 （二）酶活性测定： １. 取6个三角瓶(50-100ml)，标上号码，分别加入下列试剂(ml)： ┌──┬────┬───────┬─────────┬──┬─────┐ │瓶号│ 蒸馏水│0.1％抗坏血酸│0.02mol/L焦儿茶酚│ 酶│煮5分钟酶│

邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性

邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性 试剂配制 (1)1%邻苯三酚溶液 (2)乙醚。(3)0．5N盐酸。(4)重铬酸钾标准溶液——o．75g重铬酸钾溶于1升0.5N HCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)。 (5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。标收曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用o．5N HCI稀释成各种不同浓度。定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。 2。投作步骤取1g土样(过o．25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。取出后加4mlpH 4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。比色时用波长为430nm的滤光片。为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正 没食于酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。在 无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。 3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。 多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克 数表示。 我不知道找个“紫色没食子素”是什么意思？是不是要找个试剂啊？我问了几个老师，他们都没有听说过这个试剂。我的有的药品冯老师本来说他那有，可是我做的时候去找了，缺了几个，王老师说想办法买了，已经给李老师说了，买了后做，这几天榆林大风降温，那个移栽没有办法进行，上面红颜色的我不知道怎么做了，萃取不知道是萃取什么，看不太懂，还有测那个中性磷酸酶时的酚溶液是苯酚加水就可以了么？我这几天在图书馆查了很多资料，可是都没有啥结果（ 配制方法：在大烧杯中加入80mL去离子水，再加入300g 苯酚，在水浴中加热搅拌、混合至苯酚完全溶解。将该溶液倒入盛有200mL去离子水的1000mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，

曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法

曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、 总酚含量和丙二醛含量的测定方法 1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定 1.1基本原理： 多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。 1.2实验试剂和仪器： a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL） b．试剂 1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液 母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。 母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。 取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。 2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。 3）50mmol/L邻苯二酚溶液 取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。 1.3实验步骤 1）酶液制备 称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 2）活性测定 取一支试管，加入4.0mL 50mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（2.0mL 0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液加蒸馏水稀释4.0mL）和1.0mL 50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100μL 酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 1.4数据处理： 记录反应体系在420nm处的吸光值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线

多酚氧化酶的活性测定的报告

xx日： 多酚氧化酶活性的测定。 一、试验目的 本试验的目的在于掌握多酚氧化酶活性测定的一般原理及操作技术。 二、试验原理 酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。 三、试验材料、试剂及试验用品 材料： 李子样本80个（按照80个预算药品）李子处理： 果实发育早期、果实发育中期、果实发育后期、发育中期果实用1-MCP处理、发育中期果实用乙烯处理。 药品： 预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚 ４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４） 四、实验方法： 1.ＰＰＯ的提取取１ｇ李子果肉样品，冰浴研磨，加入预冷的磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）２０ｍＬ，在４℃下离心（４２００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，取上清液为蜜柚果肉ＰＰＯ酶提取液。

2.ＰＰＯ活性测定采用比色法测定。将１ｍＬ（０．１ｍｏｌ／Ｌ）邻苯二酚加入４ｍＬ磷酸缓冲液（ｐＨ６．４）中，加入１ｍＬ酶液，立即于波长４２０ｎｍ下测定吸光度的变化，每隔２０ｓ记录１次，共记录３ｍｉｎ。以不加酶提取液的反应液做对照，以每分钟吸光度变化０．０１为１个ＰＰＯ酶活性单位。 3. 最后作吸光度A与反应时间的关系曲线图，依据曲线最初直线段的斜率(ΔA/t)计算PPO活力。(注意空白为：2.5mL缓冲液和0.5 mL 0.01 mol/L邻苯二酚溶液)一个酶活力单位定义为： 以每分钟每毫升增加吸光值0.001的酶量为一个酶活力单位U。 4. 多酚氧化酶酶活的计算公式： E=M×60/V(式1)式中： M—每秒钟增加的吸光值V—粗酶液的体积/mL。

酶活测定方法

二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定 一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。 二、基本原理 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 梨、苹果、马铃薯等。 （二）仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。 （三）试剂 1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。 取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。 3．50 mmol/L邻苯二酚 称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。 四、实验步骤 （一）酶液制备 称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 （二）活性测定 取一支试管，加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s 时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 五、实验结果与计算 1．将测定的数据填入下表

(整理)多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定一、引言 食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法,但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。 二、原理 邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O2作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。 把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20℃下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min 内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。 所有上述过程的主要反应式如下： 酶 邻苯二酚邻苯二醌 邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸 KIO3+5KI+6HCl→6KCl+3H2O+3I2

3I2+3Vc→3-脱氢Vc+6HI 三、材料和设备 苹果；马铃薯。 研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。 四、试剂 1．0.2邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2天配制）。贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。 2．0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIO2（预先在102℃烘2 小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIO3和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI， 溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。 3．pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫 升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。 4．0.04N抗坏血酸溶液：用粗天平称取0.35克抗坏血酸溶解到蒸馏水中，用水 稀释至100毫升，混匀。溶液只能用一天。 5．5%的偏磷酸溶液：50克偏磷酸（经验式HPO3）溶解到蒸馏水中，稀释至1升后混匀，保存于磨口玻璃瓶中。