单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则

1、目的

根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。

2、适用范围

适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。

3、职责

检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。

4、试剂及器材

4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株

4.2 马红球菌

4.3 小白鼠：16-18g

4.4 TSB-YE

4.5 TSA-YE

4.6 EB增菌液

4.7 李氏增菌液（LB1，LB2）

4.8 三糖铁琼脂

4.9SIM动力培养基

4.10 琼脂

4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA）

4.12 硝酸盐培养基

4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水

4.14 糖发酵培养基

4.15 过氧化氢

4.16 1%盐酸丫啶黄溶液

4.17 1%萘啶酮酸盐溶液

5、仪器设备

5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃

5.2 恒温水浴锅：46±1℃

5.3 离心机：4000r/min

5.4 显微镜

5.5 均质器

6、检测步骤

6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1

增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。

6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24

小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。

6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板

上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。角斜光照射平板。

6.4选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁琼脂和SIM动力培养基，培养于

25℃。一般观察2天-7天，阳性者可做下一步鉴定。

6.5纯培养：将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产

酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于TSA-YE上纯培养，做以下鉴定。

6.6染色镜检：将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查。用生理盐水制

成菌悬液，在油镜下观察。

6.7生化特性：溶血反应阳性、硝酸盐还原阴性、尿素酶阴性、MR-VP阳性、甘

露醇阴性、鼠李糖阳性、木糖阴性、七叶苷阳性。

6.8对小鼠的毒力试验：将符合上述特性的纯培养物借重于TSB-YE中，30℃培

养24小时，离心，弃上清夜，用0.85%灭菌生理盐水制备成浓度为1010cfu/ml 的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只-5只，每只0.5ml，观查小鼠死亡情况。致病株于2天-5天内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌有致病性。

6.9协同溶血试验：在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，在它们中

两者之间垂直接种可疑单核细胞增生李斯特氏菌，但不要触及它们，30℃培养24小时-48小时，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。

7、结果判定：

7.1单核细胞增生李斯特氏菌的菌落在MMA琼脂平板上为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。

7.2 三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产硫化氢。

7.3 SIM上有动力，且成伞状或月芽状生长。

7.4 单核细胞增生李斯特氏菌革兰氏阳性小杆菌

7.5 湿片检查，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

7.6溶血反应阳性、硝酸盐还原阴性、尿素酶阴性、MR-VP阳性、甘露醇阴性、鼠李糖阳性、木糖阴性、七叶苷阳性。

7.7 小鼠的毒力试验单核细胞增生李斯特氏菌有致病性。

7.8协同溶血试验，靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特氏菌的溶血增强。

8、支持性文件

《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验。

9、质量记录

9.1 检测原始记录

9.2 检测报告

单核细胞增生李斯特氏菌检验操作规程

单核细胞增生李斯特氏菌测定 1 提示 1.1 注意无菌操作。 2目的 用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的测定 3检测依据 《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌测定（GB 4789.30-2016）》。 4适用范围 本法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的测定。 5试验材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 5.1冰箱。 5.2 恒温培养箱。 5.3 均质器。 5.4 显微镜。 5.5 电子天平。 5.6 锥形瓶。 5.7 无菌吸管、微量移液器及吸头。 5.8 无菌平皿。 5.9 无菌试管。 5.10 离心管。 5.11 无菌注射器。 5.12 单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111或CMCC54004,或其他等效标准菌株。 5.13 英诺克李斯特氏菌(Listeriainnocua)ATCC33090,或其他等效标准菌株。 5.14 伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)ATCC19119,或其他等效标准菌株。 5.15 斯氏李斯特氏菌(Listeriaseeligeri)ATCC35967,或其他等效标准菌株。 5.16 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC25923或其他产β-溶血环金

5.17 马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC6939或NCTC1621,或其他等效标准菌株。 5.18 小白鼠:ICR体重18g～22g。 5.19 全自动微生物生化鉴定系统。 6.培养基和试剂 6.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE):。 6.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE):。 6.3 李氏增菌肉汤LB(LB1,LB2):。 6.4 1%盐酸吖啶黄(acriflavineHCl)溶液:。 6.5 1%萘啶酮酸钠盐(naladixicacid)溶液:。 6.6 PALCAM 琼脂:。 6.7 革兰氏染液:。 6.8 SIM 动力培养基:。 6.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:。 6.10 5%～8%羊血琼脂:。 6.11 糖发酵管:。 6.12 过氧化氢试剂:。 6.13 李斯特氏菌显色培养基。 6.14 生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。 6.15 缓冲蛋白胨水:见A.11。 7检验程序 第一法单核细胞增生李斯特氏菌定性检验

ISO标准(参考译文)单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法

国际标准ISO11290-1 第一版1996-12-15 食品和动物饲料微生物学---单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法第一部分 检测方法 目录 内容页次 1 范围 1 2 参考标准 1 3 定义 1 4 原理 2 5 培养基和试剂 2 6 设备和玻璃仪器 3 7 取样 3 8 取样前处理 3 9 步骤 3 10 结果表述7 11 检验报告7 附录 A 检验步骤图8 B 培养基和试剂的组成和配制9 C 亨氏证明试验16

食品和动物饲料微生物—单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法 第一部分 检测方法 警告：为了保障实验室人员的安全，强烈推荐执行单核增生李斯特氏菌检验应在具备相应设备条件的实验室进行，在有经验的微生物专家控制下，保温后的一切丢弃物应小心处理。特别是，强烈推荐孕妇不能操作单核增生李斯特氏菌的培养。 1 范围 本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数的水平方法。 限于简介中讨论的条件，本ISO11290适用于给人消费和作为动物饲料的产品。 2 参考标准 以下标准包含的条件；通过参照这些内容，组成了这部分ISO11290的条件。出版时，引用的这些版本是有效的。所有标准都需要修订，而各机构对本部分基于ISO11290的批准应鼓励调查和应用以下引用标准的最近版本。IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。 ISO6887：1983，微生物学---微生物检验中稀释液制备的一般导则 ISO7281：1996，食品及动物饲料微生物学---微生物检验通则 3 有关定义 本部分ISO11290适用以下定义： 3.1 单核增生李斯特氏菌依据本部分ISO11290实施检验，在固体选择性培养基上形成典型菌落并呈现固有形态、生理生化特征的微生物。 3.2单核增生李斯特氏菌的检验依据本部分ISO11290实施检验，在给定产品的质量和体积的条件下，检验这些微生物的存在或不存在。 4.原理 在本部分ISO11290范围内，单核增生李斯特氏菌检验需要四个连续的阶段（见附录A检验流程图） 注意1：李斯特氏菌可能存在量少并与大量的其它种类细菌混杂，因此需要选择性富集。同时也必须检测受破坏的李斯特氏菌，初级选择性富集培养基，含有降

单核细胞增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌 形态特征： ①革兰氏阳性的类球形杆菌 ②大小约为0.4~0.5µm x 0.5～2.0µm ③两端钝圆 ④在有些培养基中稍弯，单个、成V形或成对平行排列 ⑤在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性 ⑥兼性厌氧，无芽孢，一般不产生荚膜 ⑦在20~25℃时以4根周毛运动，在37℃时只有较少的鞭毛或1根鞭毛 培养特性： ①需氧和兼性厌氧 ②生长范围为2-42℃ ③最适温度为35-37℃ ④pH中性至弱碱性（pH9.6） ⑤在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。 ⑥在20-25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。 ⑦在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。

⑧在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。 ⑨在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用45°角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 生化特性：（甘露醇、木糖为阴性，其他为阳） 1.该菌触酶阳性，氧化酶阴性。 2.发酵多种糖类，产酸不产气。 发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖。 不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 3.不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解。 4.吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。 5.MR-VP试验和精氨酸水解阳性。 生化试验： ①动力试验+ 原理：有动力的细菌扩散生长，培养基浑浊，无动力的细菌培养基澄清。（结果：有动力，呈伞状生长，底为弯月牙形）

单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂(一)

单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂 (一) 单核细胞增生李斯特氏菌（LM）是一种由李斯特氏菌属（Listeria） 引起的感染性疾病，该疾病主要感染免疫功能低下人群，通常会导致 败血症和脑膜炎等严重并发症，严重威胁人类健康。因此，开发出一 种快速、敏感、高效的LM检验培养基和试剂至关重要，这可以加速LM 的检测和诊断，有效地减少疾病的传播。 一. 检验培养基 1. 构成成分：单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基是由肉汤、肉汤胰 蛋白胨、乳糖、黄曲霉素、普鲁兰甲酸和酵母提取物等组成的。 2. 作用：肉汤是一种富含氮源和其他必需营养成分的培养基，在培养 微生物中发挥着重要的作用。肉汤胰蛋白胨是一种蛋白质水解物，可 为细菌提供营养和生长因子，促进其繁殖。乳糖则是一种碳源，能够 促进细胞的代谢和繁殖。黄曲霉素作为一种广谱抗生素，可以有效地 抑制杂菌的生长。普鲁兰甲酸和酵母提取物则可以用来增加LM在培养 基上的特异性和灵敏度。 3. 优点：单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基在培养LM时具有快速、敏感、特异性好等优点，可以大大缩短LM的检测时间，确保病菌的检 测率。 二. 检验试剂 1. 依赖性及非依赖性试剂：检验试剂可分为依赖和非依赖试剂。依赖

试剂需要依赖细菌代谢产物或生长结果的变化来作出结果，如葡萄糖酶试剂。而非依赖试剂则不需要依赖于细菌代谢的结果，如反应纸片试剂。 2. LM检测常用试剂：LM检测常用试剂包括气体生成剂试剂和反应纸片试剂。前者是一种单元试剂，含有半胱氨酸脱氨酶和甲酸氢化酶等催化剂，当培养基内细菌产生气体时，该试剂会发生颜色变化，表示LM检测阳性。而反应纸片试剂则能够迅速地检测LM生长的结果，并呈现出明显的颜色变化。这种试剂具有使用方便、结果稳定等优点。 3. 优点：LM检验试剂具有便于使用、结果稳定和灵敏度高等特点，可以有效地加速LM的检测和诊断，从而避免其传播和蔓延。 结论： 单核细胞增生李斯特氏菌检验培养基和试剂是一对极为重要的检测手段，在LM的检测过程中发挥着至关重要的作用。它们的快速、敏感、高效能够帮助医学工作者准确、迅速地判断出LM的存在，掌控便于控制LM在流行病学上的传播和感染的趋势。因此，它们是保障人类健康和安全的必要手段，也为LM的预防和控制提供了重要的保障和基础。

李斯特菌检验

李斯特氏菌 李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。李斯特氏菌 - 概况 李斯特菌 李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。李斯特氏菌 - 特点 李斯特菌快速检测试剂盒 1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。 2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则

单核细胞增生李斯特氏菌检验检测细则 1、目的 根据《中华人民共和国国家标准》GB/T4789.30-2003单核细胞增生李斯特氏菌检验进行单核细胞增生李斯特氏菌检验。 2、适用范围 适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。 3、职责 检测人员负责按照本规程对被测样品进行检测；校核人员负责对检测操作人员是否规范以及检测结果是否准确进行审核；授权签字人负责综合管理和检测报告的签发。 4、试剂及器材 4.1 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株 4.2 马红球菌 4.3 小白鼠：16-18g 4.4 TSB-YE 4.5 TSA-YE 4.6 EB增菌液 4.7 李氏增菌液（LB1，LB2） 4.8 三糖铁琼脂 4.9SIM动力培养基 4.10 琼脂 4.11 改良的Mc Bride琼脂（MMA） 4.12 硝酸盐培养基 4.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水 4.14 糖发酵培养基 4.15 过氧化氢 4.16 1%盐酸丫啶黄溶液 4.17 1%萘啶酮酸盐溶液 5、仪器设备 5.1 恒温培养箱：30±1℃、24℃±1℃ 5.2 恒温水浴锅：46±1℃ 5.3 离心机：4000r/min 5.4 显微镜 5.5 均质器 6、检测步骤 6.1样品的收集及处理：无菌取样25g（ml）放灭菌均质器中加225mlEB和LB1 增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。 6.2增菌培养：EB增菌液30℃培养48小时，LB1增菌液225ml放30℃培养24 小时，吸取0.1ml，加入10ml LB2增菌液中二次增菌。 6.3分离培养：将EB增菌液和LB2二次增菌分离于选择培养基MMA琼脂平板 上，培养30℃48小时，挑选可疑菌落，用白织灯45。角斜光照射平板。

微生物检验报告结果及事项

微生物检验报告结果及事项--青岛科标生物实验室 一、涉及定性项目的检验结果报告 沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157：H7、空肠弯曲杆菌、副溶血性弧菌（定性）等，如果检样是称重取样，则最后检测结果一定报告为检出/25g或未检出/25g。如果检样是体积取样，则最后检测结果一定报告为检出/25mL或未检出/25mL。检测标准要求g必须要小写，mL中m必须小写，L则必须大写。记录中所有有用的信息必须填上，无法填充的用“/”划掉。 二、菌落总数检验结果报告 1.菌落总数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约以整数报告，如80.5CFU 可修约报告为81CFU;80.4CFU则修约报告为80CFU。 2.菌落总数大于等于100CFU时，左边数第3位数字采用四舍五入原则修约后，取前2位数字，后面位数用0代替，也可用10的指数形式表示：如10-2两平板平均菌落数为238CFU/g，可修约为240CFU/g，最后报告为24000CFU/g 或2.4×104CFU/g。 3.霉菌、酵母菌、乳酸菌、蜡样芽孢杆菌、产气荚膜梭菌报告形式和菌落总数一样。 4.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。 三、大肠菌群检验结果报告。 LST初发酵，产酸产气，接种BGLB复发酵后仍产酸产气，则证明样品受到了大肠菌群污染，可检索MPN表，得出相应结果。检测时如果采用（10-1，10-2,10-3）三个稀释度，最后BGLB产气管为（2，0，0），查MPN表可得出大肠菌群检

测值为9.2MPN/g；检测时如果采用（100，10-1,10-2）三个稀释度，最后BGLB 产气管仍为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为0.92MPN/g；如果采用（10-2，10-3,10-4）三个稀释度，最后BGLB产气管仍然为（2，0，0），查MPN表可得大肠菌群检测值为92MPN/g。称重取样以MPN/g为单位报告，体积取样以MPN/mL为单位报告。大肠杆菌、粪大肠群群、副溶血性弧菌（定量）、总大肠菌群当检出阳性结果时，都会涉及查MPN表，其规律和大肠菌群一样。 四、饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌检验结果报告 根据CN平板上生长的蓝色或绿色菌落的计数和生化确证试验的结果，计算出每250mL水样中的铜绿假单胞菌数量，结果以CFU/250mL报告。 五、饮用天然矿泉水中产气荚膜梭检验结果报告 根据SPS平板上黑色菌落的计数和生化确证试验的结果，计算出每50mL水样中产气荚膜梭菌的数量，结果以CFU/50mL报告。 六、涉及到用29921进行结果判定的项目，每个项目要出5份报告。送检样品用企业标准进行结果判定的，出报告时要参考企标进行出具。 七、阪崎肠杆菌检验结果报告 根据阪崎肠杆菌显色培养基绿色菌落的生长情况和生化确证试验的结果，报告每100g（mL）样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。 八、化妆品中粪大肠菌群检验结果报告 根据发酵乳糖产酸产气，EMB平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告每10g被检样品中检出粪大肠菌群。 九、化妆品中铜绿假单胞菌检验结果报告

李斯特菌检验应用

李斯特氏菌 李斯特菌 李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。其中单增李斯特菌是唯一能引起人类疾病的。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的 李斯特菌快速检测试剂盒 1、分布广：存在于土壤、水域(地表水、污水、废水)、昆虫、植物、蔬菜、鱼、鸟、野生动物、家禽。 2、生存环境可塑性大：能在2-42℃下生存(也有报道0℃能缓慢生长)能在冰箱冷藏室内较

长时间生长繁殖。 3、适应范围大：酸性、碱性条件下都适应。 4、带菌较高的食品有：牛奶和乳制品；肉类(特别是牛肉)；蔬菜；沙拉；海产品；冰淇凌 单核细胞李斯特菌在半固体培养基上生长情况 李斯特菌具有较强的反抗力，秋冬时期在土壤中能存活5个月以上，在冰块内也可存活3～5个月，许多冷冻肉类都是它的“温床”。这种细菌对高温的反抗力也比较强，能在100℃下挺15～30分钟，在70℃下可存活30分钟以上。 单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。 该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有 1、形态与染色

吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测编制说明

《吉林省食品安全地方标准 食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量方法》 一、任务来源 本标准对《食品卫生微生物学检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量方法》地方标准进行制定。受吉林省卫生厅委托。项目编号：D BS22/019-2012。 1.承担及参加单位 本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本标准主要参加单位：长春市预防控制中心。 主要起草人：刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇 2.标准制定的主要过程： ⑴确立标准制定的基本原则，比较与研究国内相关检验方法的文献报道，并结合大量的实验室方法的研究工作，制定出标准的讨论稿。 ⑵组织有关参加单位进行实验室比队验证工作，结合比队结果，找出实验过程存在的问题，汇总、分析数据，修改标准文本。 ⑶撰写《食品卫生微生物学检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量方法》标准文本的《征求意见稿》和标准《编制说明》等材料。 ⑷把标准文本送给十位专家征求意见，汇总专家意见。根据专家意见对标准文本进行完善。 ⑸提交《食品卫生微生物学检验食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量方法》（送审稿）《编制说明》供卫生厅审议。 二、本标准立项背景 单增李斯特氏菌已成了新兴的重要的食源性疾病的病原菌，近几年来，包括我国在内的许多国家相继出现因李斯特氏菌而引起的食物中毒暴发事件，并且正逐年上升。因此受到各国政府高度重视，纷纷制定策略,开展监督监测工作，

以便预防和控制该菌的污染、传播。 在我国已加入WTO的背景下，我国的食品安全质量将面临新的更大的挑战。为减少贸易壁垒，减少国家的名誉和经济损失，与国际接轨，提高检测能力，建立和研制发达国家公认的方法，势在必行。国外许多国家均建立了食品中的定量方法或原则，规定了各种食品的限量标准（如美国规定了食品中允许的水平下不能生长）。近些年中国对食品中的量化方法仍停留在科学研究上。根据中华人民共和国食品安全法的明确规定，国家要建立食品安全风险监测制度，对食源性疾病、食品污染以及食品中的有害因素进行监测。这就要求尽快建立科学可行的单增李斯特氏菌（）的定量检测方法。同时用定量方法对食品中的量化，制定各类食品中该菌的限量标准，与国际标准尽早接轨。建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量方法，为制定食品的限量标准，开展食源性李斯特氏菌病在食品中的危害的风险评估提供依据，从而更科学的评价食物链中的危害与人体健康风险的相关性，完善与强化国家的食品安全体系。 三、本标准的主要依据： 经查FDA、USDA和我国均无相应国家标准报告。 食品微生物学检验単增李斯特氏菌检验。 2.国内杂志公开报道的単增李斯特氏菌检验定量检验方法的文献。 四、增加的内容 本标准分为两种检测方法： 第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法 第二法：MPN计数法 其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。 商品化鉴定系统的应用。该标准应用了Vitek GNI＋全自动微生物免疫分析仪）或API 1003试剂条1（法国生物梅里埃公司）或其他微量生化鉴定试条。这些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用，鉴定效果很好。

李斯特氏菌检测方法介绍—科标检测

李斯特氏菌检测 李斯特菌（也称李氏杆菌）引起的急性传染病，以败血病为主要症状，伴有内脏器官和中枢神经系统病变。李斯特菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的，为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827～1912），1940年被第三届国际微生物学大会命名为李斯特菌。 单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。 李斯特菌在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。李斯特菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。 科标检测在微生物检测领域拥有丰富的经验，可以针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析，为客户提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，保证产品质量安全，专业得到了国内、国际知名企业的广泛认可。 实验步骤 1. 增菌培养 将未开封的测试片贮藏在≤8℃的环境下，并在包装上标示的有效期内使用。在高湿度的地方，最好在使用前将测试片回复到室温。 取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。 2. 分离 共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3 LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。 已开封的测试片，将开口反折，用胶带封好。 加入七叶苷和Fe3 的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。 在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和

十单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序

DBS22 DBS22/019—2012 吉林省食品安全地方标准 食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年发布 2013年实施 吉林省卫生厅发布 前言 本标准根据GB/T1.1-2000《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》的要求编写. 本标准分为两种检测方法： 第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法; 第二法：MPN计数法。 其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品. 本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。 本标准负责起草人:刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇

吉林省食品安全地方标准 食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测 1 范围 本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 2。1 冰箱：2℃～5℃和—18℃。 2.2 恒温培养箱:30℃±1℃、36℃±1℃。 2。3 均质器。 2。4 显微镜：10×～100×. 2.5 电子天平：感量0。1 g. 2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL(具0。01 mL刻度）、10 mL（具0。1 mL刻度)。 2。8 无菌平皿:直径90 mm。 2。9 无菌试管：16 mm×160 mm.。 2.10 离心管:30 mm×100 mm。 2.11 无菌注射器：1 mL. 2。12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。 2。13 马红球菌（Rhodococcus equi）。 2.14 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3。1 含0。6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB—YE）：见附录A中A.1。 3。2 含0。6％酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA—YE）：见附录A中A。2。 3。3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。 3。4 1％盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A中A。3.2。1。 3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液:见附录A中A.3.2。1。 3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A。4。 3。7 革兰氏染液：见附录A中A.5。 3.8 SIM动力培养基：见附录A中A。6。 3。9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR)和V-P试验用]：见附录A中A.7。3.10 5%-8%羊血琼脂：见附录A中A.8。 3。11 糖发酵管:见附录A中A。9. 3.12 过氧化氢酶试验：见附录A中A。10. 3.13 李斯特氏菌显色培养基。 3。14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒. 第一法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法 4 检验程序

《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》

《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明 一、编制的目的和意义 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌，是危害公共卫生和食品行业的一种重要人畜共患致病菌，主要存在于肉类、乳制品和蔬菜中，可引起脑膜炎、败血症和流产，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重。自1961年，英国首次报道2例由单增李斯特菌引起的脑膜炎病例以来，相继在美国、加拿大、比利时等国家报道了新生儿单增李斯特菌感染事件。1985年美国有52人死于食用受单增李斯特菌感染的软干酪。2011年美国18个州72人因食用受李斯特菌污染的甜瓜而染病。在我国感染性腹泻致病菌中李斯特菌居首位。因此，建立快速、特异、灵敏的检测标准对于单增李斯特菌早期预防及疫情的有效控制至关重要。 我国目前主要采用传统培养方法进行单增李斯特菌的检测，需要一周时间左右，费时费力。本次研究以单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列为靶基因设计一对引物，采用EMA与PCR相结合的方法进行检测，能够有效地区分单增李斯特菌的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示， PCR检测单增李斯特菌的灵敏度在1.0×102

cfu/mL左右，从预增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要2 d左右，与传统培养学方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异性强，可用于检测饲料中单增李斯特菌的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。 二、任务来源及编制原则和依据 1、任务来源 根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中单核细胞增生李斯特氏菌活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210481）的起草、制定工作。 2、编制原则 符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则，开展了本次研究工作。 3、编制依据 主要依据以下标准：NY/T 1902 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验，GB 4789.30 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB 19489 实验室生物安全通用要求，GB 4789.28 食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。 三、编制过程

单增李斯特氏菌及其检测方法

单增李斯特氏菌及其检测方法 一、单增李斯特氏菌 单增李斯特氏菌，学名Listeria mon ocytoge nes, —种革兰氏阳性菌，是李斯特菌属。李斯特菌属(Listeria)共分为2个群，7个种：第一群包括单核细胞增生性李斯特菌(L monocytogenes，LM)(亦称产单核细胞李斯特菌)、伊氏李斯特菌(L ivanovii)(亦称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(L innocua)(亦称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌(L welshimei)塞氏李斯特菌(L seeligeri，第二群包括格氏李斯特菌(L grayi和莫氏李斯特菌(L mulTayi。其中，单增李斯特菌是唯一能引起疾病的人畜共患病的。它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为、和单核细胞增多。 二、单增李斯特氏菌检测方法 1. 细菌培养法 该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有C02的微需氧环境中生长，生 长温度范围C -45C，最适温度为30 C -37C，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。LM在普通琼脂平板上呈细小直径约、 半透明露水样菌落。在血琼脂平板上有B溶血环。在显色培养基上呈蓝绿色。 2. 生化鉴定法 该菌主要生化特性如下： ①触酶阳性； ②氧化酶阴性； ③发酵多种糖类； ④产酸不产气； ⑤不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤 维二塘； ⑥不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解； ⑦吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性；

⑧VP、甲基红试验和精氨酸水解试验阳性； ⑨对碱和盐抵抗力强，60-70r经5-20分钟可杀死，70%酒精5min、％石碳酸、% 氢氧化钠、％福尔 马林20min可杀死此菌。 ⑩该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。 3. 血清凝集法 根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1/2a、1/2b、1/2c、 3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。抗原结构与毒力无关，对人致病的主要为血清型1/2a、1/2b、4b,占全球本病病例约90%。 关于血清凝集法用的诊断血清方面，推荐天津生物芯片公司生产的单增李斯特氏菌全套诊断血清产品，该菌最常见的O: 3，O: 5，O: 8和O: 9型的诊断 血清被纳入这套产品，详情如下： 二十三、单增李斯特菌诊断血清 4. 核酸扩增法 核酸扩增技术，即聚合酶链式反应（/ polymerase chainreaction, PCR，其基 本原理是设计、合成两条寡核苷酸，作为引物，对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端，然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增，使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。/公

食品微生物检验技术W4402单增李斯特氏菌检验—国标解读与检验准备-4-微教材

《农产品/食品微生物检验技术》课程-微教材 知识讲解 一、国家标准版本 目前，国家最新标准为《GB 4789.30-2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生单增李斯特氏菌检验》。 2010版本标准代替GB/T 4789.30-2008《食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》。 它与GB/T 4789.30-2008 相比，主要变化如下： ——修改了标准的中英文名称； ——删除“第二法全自动酶链荧光免疫分析仪筛选法”； ——删除“第三法全自动病原菌检测系统筛选法”。 本标准的附录A 为规范性附录。

本标准所代替标准的历年版本发布情况为： ——GB 4789.30-1994、GB/T 4789.30-2003、GB/T 4789.30-2008。 二、标准内容 （一）范围 标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的检验方法。本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。 （二）设备和材料 除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。 2.2 恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃。 2.3 均质器。 2.4 显微镜：10×～100×。 2.5 电子天平：感量0.1 g 。 2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）。 2.8 无菌平皿：直径90 mm。 2.9 无菌试管：16 mm×160 mm.。 2.10 离心管：30 mm×100 mm。 2.11 无菌注射器：1 mL。 2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。 2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。 2.14 小白鼠：16 g～18 g。 2.15 全自动微生物生化鉴定系统。 （三）培养基和试剂 3.1 含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A 中A.1。3.2 含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录 A 中A.2。 3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A 中A.3。 3.4 1 %盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A 中A.3.2.1。

ISO李斯特菌

国标标准ISO11290-1 1996 (E) 食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法 ------第一部分检测方法 1. 范围 2. 参考标准 3. 定义 4. 原理 5. 培养基和试剂 6. 设备和玻璃器皿 7. 取样 8. 待检样品前处理 9. 程序 10. 结果表达 11. 检测报告 附录： A.检测程序图 B.培养基和试剂的组成和配制 C.亨氏斜射光镜检

食品和动物饮料微生物学----单核增生李斯特氏菌的检测和计数方法 ------第一部分检测方法 警告：为了保障实验室人员的健康，强烈推荐在适当装备、由有经验的微生物专家控制以及检测中的所有培养物得以谨慎处理 的实验室进行单核增生李斯特氏菌检测；尤其是强烈建议孕妇不要从事单核增生李斯特氏菌的培养工作。 1 . 范围 本ISO11290详细说明了单核增生李斯特氏菌检测和计数方法。 在绪论中受讲座白^局限性，本ISO11290适用于供给人类消费或作为动物饲料的产品。 2 . 参考标准 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不 包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。IEC和ISO成员保留目前有效的国际标准的注册。 ISO6887: 1983微生物学一微生物检测中稀释液制备的一般导则 150: 1996,食品及动物饲料微生物学一微生物检测通则 3 . 定义 本部分ISO11290提供以下定义： 3.1 单核增生李斯特氏菌：在因体选择性培养基上形成典型菌落，并且当进行鉴定和确认其形态的、生理的和生化特征与本部分ISO11290的描述一致的微生物。 3.2 单核增生李斯特氏菌的检测：依据本部分ISO11290实施细则确定单核增生李斯特氏菌在给定单位质量或 体积的样品中存在与否。 4 .原理 在本部分ISO11290的限定范围内，检测单核增生李斯特氏菌需要四个连续的阶段（见附录A检测程序图）。 注意：1:单核增生李斯特氏菌可能存在量少，并与大量的其它细菌混杂，因此需要选择性增菌。同时必须检测受到损伤的李斯特氏菌，降低添加于初级选择性增菌培养基的抑制剂浓度可以至少部分达到此目的。 4.1 在选择性试剂浓度有所降低的选择性液体增菌培养基（半Fraser肉汤）中进行初级增菌 接种于含有1体积氯化锂、1/2体积的口丫咤黄素和1/2体积的蔡咤酸的半Fraser肉汤培养液，其一可用作检测部分（9.1）的稀释液，30c培养24h。 4.2 应用含全浓度选择性试剂的液体增菌培养基（Fraser培养液）进行二级增菌 把4.1得到的初级培养物接种于高选择性二级液体增菌培养基，35c或37c培养48h。 4.3 筛选、分离和鉴定 把4.1和4.2步的培养物接种到两种因体选择性培养基上a） Oxford （b） PALCAMT 30C、35或37c培养24h后检查，如有必要，继续培养24h后再次检查典型的单核增生李斯特氏菌可疑菌落。