冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤
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（1）冰冻切片取出，室温放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10分钟。
（2）切片用0.01MPBS清洗后加入1.2%双氧水作用30分钟，以除去非特异染色。
（3）0.01M PBS清洗，3次×10分钟。
（4）0.3%Triton X-100作用30分钟。
（5）加入以抗体稀释液（含1%BSA的0.01M PBS，pH7.4）稀释至工作浓度的一抗，4℃过夜。
（6）0.01M PBS清洗，3次×10分钟。
（7）加入荧光抗体TRITC-IgG（1：100）或FITC-IgG（1：100），室温孵育2小时。
（8）0.01M PBS清洗，3次×10分钟。
（9）缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。
对照组：采用空白对照：除用0.01MK PBS代替一抗外，其余程序与实验组相同。
载玻片处理步骤：
（1）硫酸浸泡过夜。
（2）自来水冲洗干净后双蒸水冲洗3遍。
（3）晾干后在0.1%明胶中快速浸泡后取出。
室温晾干或37℃烤干备用。
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冰冻切片免疫荧光染色及HE染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时； （7）PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 ` 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。 附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4
（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装 1ml/支－20℃保存 一、操作方法及步骤： ①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 ②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 ③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 二、冰冻切片时的注意事项： ①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 ②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 ③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
免疫荧光双染完整版
免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全 干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按 2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加 用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内 4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在 圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染 液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用 抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330- 380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇 Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程 (表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT； （3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜； （5）PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时； （7）PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项： （1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂 0.3%TrixtonX100。 附注2：所用液体（表面分子染色不用 0.3%TrixtonX100）： （1）pH 7.4
0.01MPBS： 配方为： 0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS配方为： Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2- 7.4 （2）洗涤液： 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4 0.01MPBS，分装 1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－ 0.3%TrixtonX100－pH 7.4
免疫荧光 双标
免疫荧光步骤（双标） 1.冰冻切片制备 将脱水后的脊髓标本放于冰冻托盘上，加OCT使组织被完全包埋，置于冰冻切片机中，调节箱体温度为-22℃，冷冻头温度为-23℃。观察OCT冻成白色固态状时，将其放置于冷冻头，准备切片。设置切片厚度为8µm，必要时用刷子辅助将切好的OCT薄片贴附于载玻片上。室温下晾干载玻片后保存于-20℃冰箱。 2.免疫荧光染色 （1）室温下晾干切片15min，待完全晾干后放置于湿盒内，PBS冲洗浸泡5min/次，3次（以除去OGT）。 （2）抗原修复液(1X)（双蒸水稀释），95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内)。20-30分钟内冷却至室温。PBS冲洗5min/ 次，3次。 （3）用滤纸吸干玻片上残余PBS，用免疫组化笔在标本周围画一适当大小圆圈，避免接触标本，将配置好的封闭液（5%驴血清=920ulPBS+50ul驴血清+30ul 10%trition）加入圆圈内，室温下封闭1h。 （4）用滤纸吸去封闭液，向标本加入相应一抗：（1%BSA） 兔源一标：兔抗IL-33（1：50） 小鼠源二标：小鼠抗NeuN（1：500，神经元） 小鼠抗GFAP（1：300，星形胶质细胞） 小鼠抗OX42（1：100，小胶质细胞） 小鼠抗OLIG2（1: 25，少突胶质细胞） 一抗于4℃静置过夜孵育。 （5）次日，PBS洗去一抗，10min/次，3次，用滤纸吸干PBS，之后操作均需避光，向标本加入相应二抗： Dylight 488标记驴抗兔IgG（1：300）， Dylight 594标记驴抗小鼠IgG（1：300）， 二抗室温静置避光孵育2h。 （6）PBS清洗二抗，10min/次，3次，清洗后晾干后滴加DAPI封片，加盖玻片后于荧光显微镜下拍摄图片并保存。 计划： 1.IL-33组：1）IL-33/NeuN X2个配比浓度 2）IL-33/GFAP X2 3）IL-33/Iba-1 X2 4）只孵二抗X2
免疫荧光双染
精心整理免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫 荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在 圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm， 发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C 孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min。
抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm， 发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2 (1) (2) (3)
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤 冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。 11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。 二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。 4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。 7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。 8. PBS冲洗，2分钟×3次。 9. 显色剂显色（DAB或AEC）。 10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
免疫荧光双染完整版
免疫荧光双染完整版 免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN] 免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全 干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按 2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。 5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加 用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内
4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在 圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染 液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用 抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330- 380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇 Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K 工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按 2:29混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱
免疫荧光双染
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免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定 10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在 圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT) 和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。 8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次 5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。 10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555?nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm） 石蜡切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
免疫荧光染色SOP
免疫荧光染色SOP 肾活检冰冻切片免疫荧光染 色（直接法） 一．试剂 1.冷冻包埋剂OCT 2.荧光抗体：IgG-FITC （1：100），IgA-FITC（1：200），IgM-FITC（1：300）， C3-FITC（1：100）， C1q-FITC（1：150） 3.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 4.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ）二．取材 1.准备液氮罐、冷冻架、塑料小凹、OCT 2.活检标本取出后，立即浸入塑料小凹OCT中，置液氮罐 内冷冻架上速冻约10秒 3.置恒冷切片机内立即行冰冻切片（切片厚度为3um） 三、固定 1.待冰冻切片充分干燥后，立即放入纯丙酮固定7min，吹干，收至低温冰箱保存。 2.固定后的冰冻切片已干燥，可直接染色，如从低温冰箱取出的冰冻切片，须充分吹干，方可染色。 四、抗原抗体反应过程 1. IgG , C3加一抗前用TBS孵育15min， IgA，IgM ，C1q 加一抗前用10%小牛血清封闭15min。（10%小牛血清为PBS稀释） 2. 去除多余液体，加稀释好的抗体，避光，湿盒内室温孵 育40min
3. 流水冲洗，置95%酒精2min，吹干 4. 甘油封片，荧光显微镜观察结果 五、注意事项 1.冷冻标本时间要掌握好，防止过软或碎裂 2.切片温度需适宜，不宜过高或过低 3.染色过程中必须防止切片干燥，严格避光 4.多聚赖氨酸、丙酮、酒精、缓冲液必须及时定期更换 肾活检石蜡切片免疫荧光染 色（间接法） 一、试剂 一抗：IgG（1：50）IgA（1：50）IgM（1：50）C3（1：50）C1q（1：50）以上均为 DAKO公司产品 1.二抗猪抗兔-FITC （ 1：50，DAKO公司） 2.EDTA(PH=8.0) 3.胃蛋白酶（Invitrogen） 4.PBS：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为7.2 ） 5.封片甘油：欧蒙公司试剂盒中附带。（PH值为8.4 ） 二、方法 1.光镜石蜡切片脱蜡、入水 2.用高温高压修复15min(EDTA, PH=8.0)，冷却后水洗 3.胃蛋白酶室温消化5 min，水洗 4.10%小牛血清封闭（10%小牛血清为PBS稀释） 5.去除多余液体，加稀释好的抗体后，避光，室温或4度过 夜 6.PBS冲洗2min。
免疫荧光双染
免疫荧光双染 在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method) 也分为直接法和间接法。 服务说明 冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤 1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固 定10min，待丙酮完全干后于PBS( PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min。 2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈(防止液体流走)，在圈内滴 加蛋 白酶K工作液(蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释)覆盖组织，37度温箱孵育 30min。将玻片置于PBS( PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗 涤 3 次，每次5min。 3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育 20min，将玻片置于PBS( PH 7.4) 中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5min。 4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel 试剂盒内适量试剂
1（TdT和试剂2（dUTP按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆 盖组织，切片平放于湿盒内，37C恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿 度。 5、B SA封闭： 将玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次， 每次5min,在圈内滴加用3%BSA匀匀覆盖组织，室温封闭30min。 6、加一抗： 轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4 ° C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发） 7、x x： 玻片置于PBS（PH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每 次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温 孵育50min。 & DAPI复染细胞核： 切片用PBS（PH 7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。 9、封片： 玻片置于PBS（PH