对基于克隆选择和小种群粒子群算法的混杂算法的实证研究【精品文档】(完整版)

对基于克隆选择和小种群粒子群算法的混杂算法的实证研究

Pinaki Mitra, 学生会员, IEEE, Ganesh K. Venayagamoorthy, 资深会员, IEEE

摘要—本文提出了一种混合算法，基于对克隆选择算法（CSA）和小种群中的粒子群优化（SPPSO）于对克隆选择算法（CSA）和引入小种群粒子群算法，本文

CS P SO）是观察四家已知的基准函数。提出了一种混合算法。演出这种新算法（22

该SPPSO是一个传统PSO的变种（CPSO），是由本文的第二作者提出，初始粒子选择极小数目，经过几次迭代，最好是保留，而且其余颗粒取而代之的是相同的再生粒子数。另一方面，克隆选择算法属于人工免疫系统（AIS）家庭。它是一种进化算法，其中，在进化过程中的抗体能够识别通过克隆增殖的抗原。通过两种算法的混杂，CPSO优化能力得到大幅提升。用较少的内存需求和CSA的概念提高寻优能力和减少收敛到局部最小的可能性使SPPSO概念有助于找到最优解，试CS P SO表现比CPSO和SPPSO在求解Rosenbrock's，Rastrigin's 验结果表明：22

和Griewank's函数时表现更好。

1.引言

粒子群优化（PSO）已被证明有解决单一和多目标的忧化问题巨大潜力 [1]。这是一个简单，灵活和平衡算法为了进行局部和全局搜索过程。在这里，一组的粒子，称为群，在多维空间移动搜索，以找出全局最优解。随着粒子数的大群增加，到一个全局最优解越来越得到更多的保障。原因是越大的搜索空间的探索需要更高的粒子数。但是，正如粒子数的增加，为了运算内存要求也增加了，随着该算法在现实世界实时数字信号处理器或微控制器等应用这常常是不允许的，同样地，如果在首次的几个迭代，一粒子动作非常接近局部极小和没有一个是接近全全局最优解，那儿有一个可能，整个群是被误导收敛到本地极小。

投稿日期2008年6月15日。这项工作是支持的一部分美国国家科学基金会，美国国家科学基金会就业资助下＃ECCS的0348221。

Pinaki Mitra是实时的电源与智能系统实验室，欧洲经委会系，美国密苏里大学和科学技术，罗拉，莫65401，美国（电话：609-384-1302，电子邮件：pm33d@https://www.docsj.com/doc/804037793.html,）。

Ganesh K. Venayagamoorthy与实时功率和智能系统实验室，欧洲经委会系，美国密苏里大学和科学技术，罗拉，莫65401，美国（电子邮件：gkumar@https://www.docsj.com/doc/804037793.html,）。

这种情况经常发生在有大量局部极小值的功能函数。为了摆脱这两个问题，SPPSO算法提出了在[2]和[3]。该SPPSO概念是开始几次迭代后用少量的粒子数更换所有的粒子除了全球最佳相同数的再生粒子。在这种方法以来，PSO算法的运

行的只须极少数的粒子，内存要求也减少了很多。此外，由于经过几个迭代一套新的粒子被引进，在固定的机会下一个局部极小值减小。

为了进一步提高寻优能力SPPSO算法，有多个紧紧接近局部极小值的函数是非常必要的，这里提出了一种结合修改后的版本的SPPSO与克隆选择算法（CSA）。克隆选择算法属于对人工免疫系统（AIS）的家庭。 AIS是一计算智能范式的自然灵感人体免疫系统[4]。克隆和基因突变是克隆选择算法的两个最重要的步骤，这使CSA的寻优潜力非常高。研究人员做了少许尝试已经取得了PSO与CSA的合并。在[4]，CSA正被使用的许多年来全球最好的颗粒一定数量存储在内存中。因此，这个过程还需要一个大的内存。在[5]，一个以突变为目标的导向被提出了，这种突变的过程像PSO的速度更新方程。这过程是相当一个CSA的转化与种群智能技术是不直接相关的。在[6]，混合算法提出了那里的一半种群经历了这个位置，这样的速度更新过程像PSO和剩下的一半以下的种群同时进行克隆选择算法。但是，在本文中，CSA被使用在改进SPPSO算法的再生过程的时候。随着这个应用中，内存要求以及收敛到局部极小的机会减少到一个很大程度。该算法被作者称为22

CS P SO。

CS P SO建议算法本文的其余部分组织如下：第二节介绍了PSO，SPPSO和22

的细节。第三节说明基准函数在本文的使用。实验设置列于第四节。比较研究这三个算法的性能在第五节，最后得出的结论是在第六节。

2.PSO的三种变异

A．传统的优化粒子群（CPSO）

优化粒子群是一个种群为基础目的是复制羊群运动鸟类和鱼类的搜索算法[7]，[8]。一个种群被认为是是一个粒子，每个粒子的集合，其中一个代表潜在解决问题的方法。粒子改变群内的地位和经验的基础上了解其邻粒子群。它主要搜索空间寻找最优解[8][9]。

最初的种群随机解被考虑进去。随机速度也被分配到每个粒子与他们开始在空间内飞行搜索。此外，每个粒子有一个内存来保持使轨道以往最好的粒子的位置和相应的合适性。以往这个最佳值被称为'pbest'。有另一个值称为'gbest'，这是所有pbest价值群中的最佳值'粒子。最根本的粒子群优化方法的概念是在单位时间间隔这些粒子始终加速接近他们的'pbest'和每个'gbest的位置。图1演示

了算法的概念。

a）

()

id

x k

是第i个粒子的位置在k时刻d的大小。

b）

()1

id

x k+

是第i个粒子的位置在k+1时刻d的大小。

c）

()

id

v k

是第i个粒子的初速度在k时刻d的大小。

d）

()1

id

v k+

是第i个粒子的初速度在k+1时刻d的大小。

e）w为惯性权重代表的倾向粒子以维持其先前的立场。

f）C1是加速常量，为了使粒子的趋势朝着自己'pbest位置。

g）C2是加速粒子群常量的趋势走向'gbest'位置。

速度和粒子位置更新按下列公式。第i个速度d维粒子为：

（1）在d维的第i个粒子的位置向量更新如下：

（2）

图1. 概念改变一个粒子在二维[10]位置

B.小种群中的粒子群优化（SPPSO）

这是一个PSO算法的变种。这不同于CPSO在两个方面。首先，该算法初始极少数相比CPSO人群中的使用。在SPPSO粒子数量可以低于5。其次，经过i次迭代，除非所有的粒子通过被替换的gbest粒子随机生成的新粒子。该pbest位置还保留，并结转到下i次迭代。因为每i次迭代，产生新的一套粒子，该算法作为表现

一个种群众多的PSO良好基础具有非常小内存的要求。

本文介绍了一个对SPPSO的修改概念。如果只有gbest粒子是从一开始i次迭代，对其他粒子具有高潜力适应值将被忽略。为了解决这个问题，而不是只有从一开始采取反复i次迭代gbest粒子，半数的粒子被挑选出基于他们的身体健康并结转到下一个i次迭代。剩下的一半具有较低的适应值被替换为新的随机粒子。

CS P SO）

C. 克隆选择基于SPPSO（22

为了进一步提高SPPSO寻优潜力，使用CSA。克隆选择算法（CSA）是一个AIS 的一个组成部分，它解释了如何将免疫安装时的反应由B细胞确认一个非自体抗原[11]。它是一种进化算法，其中，在进化过程中的抗体，能够识别

通过克隆增殖抗原[12]。术语'健康'是等价于'亲和力'在AIS。

在CSA所涉及的一般步骤如下：

?要创建的随机解的种群P给出的问题。

?要评估各成员适应性。

?由适应性来排列种群。

?当没有达到终止条件：

?要采取优胜劣汰的N种群的成员。

?若要从每个成员的N，其中n是n克隆正比于n的健康成员。

?要评估n个克隆成员健身。

?变异，每个克隆与健康比例成反比。

?由于P和无性系变异，选择最好的P 成员，形成一个新的种群。

CS P SO算法，CSA被应用在第i次迭代后最合适的粒子。如果在本文提出的22

初始的种群规模是P，那么CSA是应用在N = P/2上最合适的颗粒。产生的克隆数是由以下公式：

(3)

凡

N=被克隆的粒子总数。在克隆选择算法里面是抗体的数量。

B=克隆指数。通过改变此参数，克隆的数量可以进行调整。

i=1为了最高的适应。依据克隆选择算法它是最高的亲和力。第二个最高的亲和力是2等等。

Nc=克隆后的整个种群规模。

这种新设定Nc个克隆抗体的数量，然后新的集合C把这样一种方式，最适合

通过一个突变的过程克隆将有至少突变。下面方程是通过设置一突变率()α

在每

个给定的克隆的公式如下：

exp()

aρ

=-公式 (4)

在那里，ρ是该克隆的亲和力。在这个文件中，目标导向的突变，在[5]描述的通过，这由下列公式表示：

在上面的方程

这些突变克隆形成一套新序列称为集合*c.突变的克隆和应用在最合适的颗粒粒子群优化算法提高了近寻优潜力在优胜劣汰的粒子附近和遥远地区从在搜索空间小于适合粒子。经克隆和变异，采用再生的SPPSO概念。P/2只，随机生成的新现在粒子添加到集合*c的基本原理.首先P/ 2最适合，我在迭代得到颗粒也加入到集合*c.因此，一套C元素的数量成为Nc+P/2+P/2=Nc+P

现在，来自集合*c的Nc+P个元素，为下一组迭代重新选择最合适的P粒子。整个过程是反复进行，直至任何终止条件得到满足。整个流程图过程如图2。

免疫算法的克隆选择过程

免疫算法的克隆选择过程 % 二维人工免疫优化算法 % m--抗体规模 % n--每个抗体二进制字符串长度 % mn--从抗体集合里选择n个具有较高亲和度的最佳个体进行克隆操作 % A--抗体集合(m×n),抗体的个数为m,每个抗体用n个二进制编码(代表参数) % T--临时存放克隆群体的集合,克隆规模是抗原亲和度度量的单调递增函数% FM--每代最大适应度值集合 % FMN--每代平均适应度值集合 % AAS--每个克隆的最终下标位置 % BBS--每代最优克隆的下标位置 % Fit--每代适应度值集合 % tnum--迭代代数 % xymin--自变量下限 % xymax--自变量上限 % pMutate--高频变异概率 % cfactor--克隆(复制)因子 % Affinity--亲和度值大小顺序 %% clear all clc tic; m=65; n=22; mn=60; xmin=0; xmax=8; tnum=100; pMutate=0.2; cfactor=0.1; A=InitializeFun(m,n); %生成抗体集合A,抗体数目为m,每个抗体基因长度为n F='X+10*sin(X.*5)+9*cos(X.*4)'; %目标函数 FM=[]; %存放各代最优值的集合 FMN=[]; %存放各代平均值的集合 t=0; %% while t

整个基因克隆实验流程完整

一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。

常用分子克隆实验方法

常用分子克隆实验方法I 一、植物总DNA的小量提取 方法1：提取吸附法。无须巯基乙醇、氯仿等有毒物质，产物无须Rnase处理。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml溶液 A，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头将所有溶液移至1.5ml离心管 中，55℃水浴30min； (2) 高速离心去杂质。10,000rpm离心5min，取约600ul上清至新1.5ml离心管； (3) 核酸吸附。往上清液中加入1倍的异丙醇，轻轻混匀，再加入总体积1/4已混匀的 溶液B，静置3min; (4) 低速离心沉淀。5000rpm离心1min，轻轻倒掉上清，并用吸水纸轻吸离心管口， 再用移液枪吸走大部分残余液体； (5) 75%乙醇清洗。加入1ml75%乙醇，5000rpm离心30s，轻轻倒掉上清，用吸水纸稍 吸离心管口。重复该步骤一次，再5000rpm离心30s，然后用移液枪吸走管底的残 液，晾干5min； (6) 核酸洗脱。加入约55ul TE（PH8.0）至管底，轻轻重悬硅土，静置3min，10,000rpm 离心1min，用小枪头轻轻吸取出50ul管底溶液，冷藏。 方法2：CTAB法，此为在经典方法基础上，经过摸索改进，提高了得率，减少了污染。 (1)充分研磨。称取约0.2克植物组织，加入液氮充分研磨3-5min，稍后加约1ml CTAB 提取液，继续研磨至略粘稠的组织匀浆，用大口1ml吸头移至1.5ml离心管，65℃ 水浴30-60min。 (2) 氯仿抽提。10,000rpm离心3min，取约600ul上清。加入1倍的氯仿，轻轻混匀， 10,000rpm离心3min，取上清再抽提1遍。 (3) 核酸沉淀。加入预冷的1倍异丙醇或2倍乙醇，轻混匀，6000rpm离心3min，弃 上清。 (4) 清洗沉淀。轻加入1ml 75%乙醇，再吸掉上清，重复一次，倒置于吸水纸或横放于 离心管架上晾干5min。 (5) 溶解DNA。加50ul含Rnase A（约10ug/ml）的TE，常温下放置30min。取约3-5ul 电泳检测后，低温冷藏。

基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.docsj.com/doc/804037793.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；

南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白(EGFP)的基因克隆

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。

6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体

三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒

对基于克隆选择和小种群粒子群算法的混杂算法的实证研究【精品文档】(完整版)

对基于克隆选择和小种群粒子群算法的混杂算法的实证研究 Pinaki Mitra, 学生会员, IEEE, Ganesh K. Venayagamoorthy, 资深会员, IEEE 摘要—本文提出了一种混合算法，基于对克隆选择算法（CSA）和小种群中的粒子群优化（SPPSO）于对克隆选择算法（CSA）和引入小种群粒子群算法，本文 CS P SO）是观察四家已知的基准函数。提出了一种混合算法。演出这种新算法（22 该SPPSO是一个传统PSO的变种（CPSO），是由本文的第二作者提出，初始粒子选择极小数目，经过几次迭代，最好是保留，而且其余颗粒取而代之的是相同的再生粒子数。另一方面，克隆选择算法属于人工免疫系统（AIS）家庭。它是一种进化算法，其中，在进化过程中的抗体能够识别通过克隆增殖的抗原。通过两种算法的混杂，CPSO优化能力得到大幅提升。用较少的内存需求和CSA的概念提高寻优能力和减少收敛到局部最小的可能性使SPPSO概念有助于找到最优解，试CS P SO表现比CPSO和SPPSO在求解Rosenbrock's，Rastrigin's 验结果表明：22 和Griewank's函数时表现更好。 1.引言 粒子群优化（PSO）已被证明有解决单一和多目标的忧化问题巨大潜力 [1]。这是一个简单，灵活和平衡算法为了进行局部和全局搜索过程。在这里，一组的粒子，称为群，在多维空间移动搜索，以找出全局最优解。随着粒子数的大群增加，到一个全局最优解越来越得到更多的保障。原因是越大的搜索空间的探索需要更高的粒子数。但是，正如粒子数的增加，为了运算内存要求也增加了，随着该算法在现实世界实时数字信号处理器或微控制器等应用这常常是不允许的，同样地，如果在首次的几个迭代，一粒子动作非常接近局部极小和没有一个是接近全全局最优解，那儿有一个可能，整个群是被误导收敛到本地极小。 投稿日期2008年6月15日。这项工作是支持的一部分美国国家科学基金会，美国国家科学基金会就业资助下＃ECCS的0348221。 Pinaki Mitra是实时的电源与智能系统实验室，欧洲经委会系，美国密苏里大学和科学技术，罗拉，莫65401，美国（电话：609-384-1302，电子邮件：pm33d@https://www.docsj.com/doc/804037793.html,）。 Ganesh K. Venayagamoorthy与实时功率和智能系统实验室，欧洲经委会系，美国密苏里大学和科学技术，罗拉，莫65401，美国（电子邮件：gkumar@https://www.docsj.com/doc/804037793.html,）。 这种情况经常发生在有大量局部极小值的功能函数。为了摆脱这两个问题，SPPSO算法提出了在[2]和[3]。该SPPSO概念是开始几次迭代后用少量的粒子数更换所有的粒子除了全球最佳相同数的再生粒子。在这种方法以来，PSO算法的运

分子克隆技术试卷

分子克隆技术 一、填空题 1.PCR反应中加入矿物油的作用是___________________________。 2.分子克隆实验中外源DNA和载体片段连接之前，要对载体进行去磷酸化处理，我 们在本次试验中去磷酸化使用的碱性磷酸酶是___________________________。它 的目的是___________________________。 3.用α互补筛选转化子是，带有外源片段的菌落显___________________________色。 4.Southern杂交中进行与杂交的目的是___________________________。 5.凝胶糖凝胶电泳时加入loading buffer作用是___________________________和 ___________________________。 6.影响琼脂糖凝胶电泳的因素主要有___________________________、 ___________________________、___________________________、 ___________________________、___________________________。 二、简答题 1.简述PCR反应体系中都有哪些成分及各成分的作用。 2.为得到质量较好的水稻RNA，抽提前应做如何准备？RNA抽提过程中、RNA的 保存及以后对RNA的操作过程中应特别注意什么？ 3.简述为防止放射性同位素外照射及内照射对人体造成伤害，在操作放射性同位素 时，我们可以采取哪些措施进行防护？ 4.简述影响电转化感受态细胞转化效率的因素有哪些？ 5.质粒抽提时用到的SolutionI，SolutionII，SolutionIII及异丙醇分别起什么作用？操 作时应注意什么？ 三、分析问答题 1.描述并图示pUC19载体DNA及其在HindIII位点克隆了外源DNA片段的质粒DNA 和水稻总DNA及它们的HindIII和BamH1酶切产物在琼脂糖凝胶电泳时的带型。 2.利用质粒载体克隆外源DNA片段主要包括哪些步骤？涉及到哪些工具酶？要获得 理想的结果，各步骤操作中应主要注意哪些事项？ 3.在Southern杂交实验中，同一根杂交管内的膜曝光的····（原卷此处不清晰）冲 洗后，有些组X光片信号很强，有些组信号很弱，有的样品点样孔附近有较强的 信号，但是有的地方信号较弱，请分析造成这种结果的可能原因。 4.下面是本次课生物技术班某组β-active基因RT-PCR（反转录前没有对总RNA进 行去除DNA 的处理）试验的琼脂糖凝胶电泳图，凝胶上共点了6个样，PCR使用 的模板从左至右分别是：该组提取的水稻总DNA，该组提取的水稻总RNA，该组 的4个反转录产物。（原卷本题图不清晰） 请问： 提取的RNA的质量如何？ RT-PCR是否成功？为什么会出现这样的结果？ 有哪些地方需要改进？

抗独特型克隆选择算法_张立宁

ISSN 1000-9825, CODEN RUXUEW E-mail: jos@https://www.docsj.com/doc/804037793.html, Journal of Software, Vol.20, No.5, May 2009, pp.1269?1281 https://www.docsj.com/doc/804037793.html, doi: 10.3724/SP.J.1001.2009.03266 Tel/Fax: +86-10-62562563 ? by Institute of Software, the Chinese Academy of Sciences. All rights reserved. ? 抗独特型克隆选择算法 张立宁1,2+, 公茂果1,2, 焦李成1,2, 马文萍1,2 1(西安电子科技大学智能信息处理研究所,陕西西安 710071) 2(西安电子科技大学智能感知与图像理解教育部重点实验室,陕西西安 710071) Clonal Selection Algorithm Based on Anti-Idiotype ZHANG Li-Ning1,2+, GONG Mao-Guo1,2, JIAO Li-Cheng1,2, MA Wen-Ping1,2 1(Institute of Intelligent Information Processing, Xidian University, Xi’an 710071, China) 2(Key Laboratory of Intelligent Perception and Image Understanding of the Ministry of Education, Xidian University, Xi’an 710071, China) + Corresponding author: E-mail: liningzh@https://www.docsj.com/doc/804037793.html, Zhang LN, Gong MG, Jiao LC, Ma WP. Clonal selection algorithm based on anti-idiotype. Journal of Software, 2009,20(5):1269?1281. https://www.docsj.com/doc/804037793.html,/1000-9825/3266.htm Abstract: Based on the antibody clonal selection theory of immunology, an artificial immune system algorithm, clonal selection algorithm based on anti-idiotype (AICSA), is proposed to deal with complex multi-modal optimization problems by introducing the anti-idiotype. This algorithm evolves and improves the antibody population through clonal proliferation, anti-idiotype mutation, anti-idiotype recombination and clonal selection operation, which can perform global search and local search in many directions rather than one direction around the identical antibody simultaneously. Theoretical analysis proves that AICSA can converge to the global optimum. By introducing the anti-idiotype, AICSA can make the most of the structure information of antibodies, accelerate the convergence, and obtain the global optimization quickly. In experiments, AICSA is tested on four different types of functions and compared with the clonal selection algorithm and other optimization methods. Theoretical analysis and experimental results indicate that AICSA achieves a good performance, and is also an effective and robust technique for optimization. Key words: clonal selection; anti-idiotype; evolutionary algorithm; artificial immune system; numerical optimization 摘要: 基于免疫学中的抗体克隆选择学说,通过引入抗独特型结构,提出了一种用于求解复杂多峰函数优化问 题人工免疫系统算法——抗独特型克隆选择算法.该算法通过克隆增殖操作、抗独特型变异操作、抗独特型重组操 ? Supported by the National Natural Science Foundation of China under Grant No.60703107 (国家自然科学基金); the National High-Tech Research and Development Plan of China under Grant No.2009AA12Z210 (国家高技术研究发展计划(863)); the National Basic Research Program of China under Grant No.2006CB705700 (国家重点基础研究发展计划(973)); the Program for New Century Excellent Talents in University under Grant No.NCET-08-0811 (新世纪优秀人才支持计划); the Program for Cheung Kong Scholars and Innovative Research Team in University of China under Grant No.IRT0645 (长江学者和创新团队发展计划) Received 2007-09-04; Accepted 2008-01-29

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签

基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

基因克隆步骤

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。

基于克隆选择机制的函数优化免疫算法

人工免疫系统是基于生物免疫系统特性而发展的新兴智能系统。利用免疫系统的克隆选择机制，提出一种用于函数优化的改进免疫算法。其主要特点是采用克隆和自适应变异等操作，提高收敛速度和种群的多样性。仿真程序表明，该算法能以较快速度完成给定范围的搜索和全局优化任务。 在工程实际中，很多问题都可转化为函数优化问题，而对于高维、非凸、且有多个局部极值点的函数优化问题，传统的基于梯度的算法通常不能求得理想解。免疫系统作为一种分布式自学习系统，能自适应地维持群体多样性及具有自我调节功能，导致基于免疫机制的算法具有整体、局部搜索能力强的特点，使得这类算法在函数优化、组合优化、模式识别、数据挖掘及机器学习等方面得到了有效应用。 1 免疫算法原理 免疫算法的灵感来自生物获得性免疫的克隆选择原理。根据该原理，在生物免疫系统中，一旦病原体侵入肌体就被分解为抗原片段，B淋巴细胞能够为产生相应的抗体与抗原结合，同时活化、增殖和分化，产生浆细胞，通过中和、溶解和调理等作用，最终使抗原从体内清除。另有一些B细胞变成了长期存活的记忆细胞，它通过血液、淋巴和组织液循环，为下一次快速、高效的消除相同或者类似抗原引起的感染奠定了基础。 免疫算法采用高变异克隆的单性繁殖搜索方式，避免了遗传算法中的交叉操作引起的模式干扰，同时具有未被激发的细胞消亡及记忆细胞的产生等过程又保证了抗体的多样性。 2 算法描述 克隆选择算法模拟生物免疫系统的克隆选择原理，一般将待优化的目标函数及其约束条件视为抗原，其算法步骤如下： (1)初始化：随机产生N个二进制编码的抗体对应问题的可能解。 (2)评价和选择1：将N个抗体分解成由m和r个抗体组成的两部分Am，Ar，分别表示进入记忆集的抗体和剩下的部分，其中进入记忆集的都是亲和度较高的抗体。 (3)克隆：在亲和度最高的抗体中选择k个进行克隆，克隆的数量与其亲和度成正比。 (4)变异：模拟生物克隆选择中的超变异过程，对克隆后的抗体执行变异操作，变异按某一变异概率以一定规模随机进行。 (5)评价和选择2：重新计算变异后的抗体的亲和度，若克隆变异后的抗体中亲和度最高的抗体比父代抗体的亲和度还要高，就用该抗体替换原抗体，形成薪的记忆集。 (6)消亡：模拟生物克隆选择中5％的B细胞自然消亡的过程，在Ar中选择d个亲和度最低的抗体重新初始化，以保证抗体的多样性。

分子克隆实验标准步骤

分子克隆实验标准步骤 一、 常规分子克隆实验流程： 二、 分子克隆实验标准步骤（含实验编号）： 1. PCR 扩增目的基因（编号Clone SOP-1） 以本实验室常用酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例 体系（50ul ）： 10×KOD buf 5ul dNTP(2mM) 5ul Mg 2+ 3ul Primer1 1ul Primer2 1ul Template50-200ng KOD0.5ul ddH 2O up to 50ul 程序： 95℃2min 98℃10s 58℃30s 35cycle 68℃2kb/min 68℃7min 12℃∞

2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2） 琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三角瓶中，按1%-1.5%的浓度加入相应体积的TBE或TAE缓液，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。 胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾干；②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板，放好梳子。在距离底板上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀 的胶层。④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3.试剂盒回收DNA片段（编号Clone SOP-3） 以本实验室常用DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例 使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。 ①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL， 12,000rpm(~13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子） ②将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中， 称取重量。 ③向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPN 溶液），60℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA 的能力较强。 ④将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000rpm(~13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。 ⑥重复操作步骤⑤。 ⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附 柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 ⑧将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB或 ddH2O，室温放置2min。12,000rpm(~13,400×g)离心2min收集DNA溶液。 4.酶切反应（编号Clone SOP-4） 以本实验室常用酶FastDigest restriction enzymes（Thermo）为例 双酶切体系（若是单酶切则只用加一种酶）： 10×FastDigest? buffer or 10×FastDigest? Green buffer 5ul FastDigest restriction enzyme 1 0.5-1ul FastDigest restriction enzyme 2 0.5-1ul DNAN ddH2Oupto50ul 酶切体系混合均匀后置于37℃条件下反应，反应时间应大于30min，若是载体（2-3ug）至少酶切2小时。 5.酶切产物的回收（编号Clone SOP-5） 以本实验室常用Axygen?AxyPrep?PCRClean-UpKit（Axygen）为例 ①在PCR、酶切、酶标、或测序反应液中，加入3个体积的BufferPCR-A（若BufferPCR-A

植物基因克隆实验指导

植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。

4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。

实验室常用生化试剂配方

实验室常用生化试剂配方 1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版） 抗生素 英文名称及缩写 抗性基因 贮藏液浓度(mg/ml) 100 25(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 35 25(0.15M NaOH配) 50(DMSO配) 50 50 MM 使用终浓度（μg/ml）链霉菌 2CM YEME 大肠杆菌 LA或LB 氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMP Ampicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprim cat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph －* 10 10 2 5 10 5 100 10 －－ 25 25 20 25 10 － 50 －－－－－－ 2.5 － 5 50-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30

注意事项： (1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请 确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装； （2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并 设置阴性对照； （3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio （4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并 分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确 保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水 乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易 挥发，有剧毒； （5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存； （6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整； (7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次 性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂 对自身的损伤及对工作环境的污染。 注意事项： (1)表中所列酶均可以用无菌水配制，也可以用相应的缓冲液配制，缓冲液配制方法 参考《分子克隆实验指南（第3版）》： 蛋白酶 K缓冲液：50 mM Tris（pH 8.0），1.5 mM 乙酸钙； RNase A缓冲液：TE （pH 7.6）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA；溶菌酶缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 8.0）； (2) RNase A配制好后沸水浴处理5 min，取出贮存RNase A后首次使用时也需沸水 浴处理5 min后再使用； （3）制备原生质体时使用的溶菌酶配制时需过滤除菌，其他情况一般无需过滤除菌； （4）所有酶均应在-20℃保存，使用过程中避免反复冻融，配制过程中尽量避免外界 污染。 （1）IPTG用无菌水配制，0.22μm一次性滤膜过滤除菌，分装保存于-20℃；

整个基因克隆实验流程(完整)

整个基因克隆实验流程(完 整) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研 钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置 3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个 新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心 5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室 温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，