豆科牧草生物固氮20101017

8.5 豆科牧草—根瘤菌的共生固氮

玉永雄1何庆元2

1西南大学2安徽科技学院

20世纪以来，单位面积上粮食产量的增加很大程度上归功于化肥的施用。近年来氮肥的施用量越来越大，但肥料的利用率却在不断下降，大部分进入地下水，使江河湖泊富营养化。大量施用氮肥，致使土壤板结，降低了土壤的蓄水保墒能力。并且工业氮肥是在高温高压下生产的，消耗大量石油、煤炭等不可再生的能源，同时造成对环境的污染。生物固氮是固氮微生物在常温常压下利用可再生能源（太阳光）固定空气中的氮素，使之能直接被生物吸收利用的过程。生物固氮固氮量大，是工业固氮的三倍，不但可以使农作物增产而且也不会出现对环境的任何污染，同时改善土壤，降解土壤中的毒素，是可持续农业发展的重要措施。因此，加强固氮微生物活动，利用生物固氮获得氮肥，是今后氮素肥料研究的主要方向之一。而共生固氮是生物固氮中最重要的固氮形式，其固氮量占整个生物固氮的一半以上。

8.5.1 共生固氮的概念

共生固氮是指植物和微生物相互作用，形成共生体系，在这个体系中微生物（小共生体）发挥其固氮活性，使大气中的游离的氮气转化为生物可利用的化合态氮的过程，而植物（大共生体）在此过程中为微生物提供固氮所需的场所、环境和能源，并促进微生物发挥固氮作用。

8.5.1.1 共生固氮的类型

固氮生物多种多样，除了少数蓝藻外，大多是一些简单最原始的生物。固氮生物一般分为非共生固氮和共生固氮两大类。其中共生固氮是最重要的固氮方式，迄今为止，发现的共生固氮类型大致可分为以下五类：

1）豆科共生固氮型：固氮菌为生活在豆科植物根内的细菌，如苜蓿根瘤菌，有近900个种。2）非豆科共生固氮型：生活在非豆科植物根上和根内的菌，如与杨梅、木麻黄等近120种非豆科植物共生的固氮菌，多数为放线菌，也有真菌、蓝藻、细菌、分枝杆菌等。

3）联合固氮型：植物根际上的联合固氮微生物进行生物固氮，如生活在植物（水稻、小麦、玉米等）根表和根际的极毛杆菌、酵母、细菌等。

4）叶瘤和叶面微生物固氮型：生活在某些植物叶中的细菌（如杆菌、分枝杆菌、蓝藻等）和叶面的固氮菌（如极毛杆菌、酵母、细菌等）进行生物固氮。

5) 其他：如菌根（小球菌和放线菌），地衣（多种蓝藻），绿萍（念珠菌）等。

8.5.1.2 共生固氮研究的历史回顾和展望

1) 生物固氮研究的起步阶段

对生物固氮的认识和研究最先是从豆科植物共生固氮开始的。在人们对生物固氮概念尚未明确之前，我国劳动人们在生产活动中，就知道豆科植物能够肥田。公元前三世纪的西晋《广志》中就有利用苕子和水稻轮作增产的记载。最先从科学上证明生物固氮的是1883年法国农业化学家J.B.Bousinggault根据田间试验和化学分析的结果指出，豆科植物可以从空气中取得氮素营养。1866年俄国学者沃罗宁（M.C.Bopo）最先发现豆科植物根瘤中含有微生物，并指出根瘤的形成是微生物侵染的结果，但他没有把根瘤的形成和豆科植物的固氮作用联系起来，直到1886-1888年德国学者H.Hellreigel等用砂培试验证明，豆科植物只有形成根瘤时，才能固定空气中的氮素。1888年，荷兰学者M.W.Beijerinck证明了豆科植物根

瘤是由细菌引起的，并分离纯化获得了根瘤菌纯培养物。接着，波兰学者Prazmowski用根瘤菌纯培养物接种豆科植物，形成了根瘤。

2) 生物固氮研究的飞跃发展阶段

从20世纪20年代起，生物固氮研究偏重于描述各种生物固氮的类型、形态、分类和固氮菌的生理生态方面。40年代后，则集中在生理和生物化学方面，人们对生物固氮的了解只停留在整体细胞水平上。直至1952年，Stone和Wilson得到固氮菌的无细胞提取液，将研究推进到细胞水平，成为固氮生化的转折点。1974年，英国Beringer等学者发现的R6845质粒在根瘤菌之间推动染色体基因的转移，进一步将根瘤菌的研究推进到共生固氮基因的水平上。20世纪末的几十年中，由于分子生物学和生物化学飞速发展，尤其是酶学在固氮以外的其他方面所积累的大量知识，以及近代物理、化学技术的广泛应用，在固氮酶的分离、纯化、结晶、结构与功能、生物固氮的能量来源、酶促反应及催化机理、电子传递和防氧机制、化学模拟生物固氮等进行了深入的研究，取得了突破性的进展。而20世纪以来，固氮的研究从微观上进一步深入到了分子水平，对固氮基因、结瘤基因以及固氮基因组和竞争结瘤等方面都做了大量的工作，也取得了阶段性的成绩。从宏观上，进一步从生态的角度研究固氮作用，并且加强了对植物与固氮微生物相互关系的研究，植物光能利用率和固氮的关系将作为进一步研究的内容。

3) 共生固氮的研究方向和展望

目前的共生固氮研究，正围绕着如下几个方面的问题进行：

固氮生物资源的进一步开拓利用，固氮微生物的系统分类和遗传地位，现有固氮生物固氮能力的提高，寻找更高效的固氮微生物；固氮微生物的逆境生理，在环境条件胁迫下寻找高效的固氮菌；固氮遗传和遗传工程的研究，利用生物技术改造菌株，提高菌株的固氮能力；其他，如光合固氮及其与氢代谢的关系以及植物固氮相关基因的定位和克隆等。

这些研究中，学者们正期待能够实现下面一些美好的愿望：

进一步增加已知的植物——微生物系统所得固氮量。

建立更好的甚至是新的植物——微生物共生关系，特别是将根瘤菌转移到其他非豆科植物上，实现固氮作用；将固氮基因转移到不固氮的植物上，使这类植物自己利用大气中的氮自己解决氮素营养问题；发展在常温常压下合成氨等。

8.5.2 根瘤的形成、结构与功能

豆科植物固氮是豆科植物和根瘤菌相互作用，形成根瘤，由根瘤菌在根瘤内提供固氮活性酶，植物提供固氮所需的环境和能源的相互协作的过程。因此，根瘤菌、植物及其相互作用都能影响共生固氮。根瘤菌和植物的相互识别、相互作用是一个非常复杂的生理、生化过程，涉及到植物和根瘤菌的各个方面。

8.5.2.1 根瘤的形成过程

豆科植物根瘤的形成是根瘤菌和植物之间对抗和协调的统一，最终成为相互有利的共生关系。但在某些情况下，协调关系不能完全建立，如根瘤菌对豆科植物只是单纯寄生。根瘤形成过程大体上可分为感染，根瘤的发生和根瘤的发育三个阶段。从起源划分，根瘤又分为外生型和内生型两种。外生型的感染局限于皮层的薄壁组织，除维管束以外，根的中柱组织和根瘤的形成无关。内生型根瘤的组织完全是由中柱鞘的再生分化而形成的。

1）感染和侵染过程

根瘤菌一般通过豆科植物的根毛对植物根部进行感染，也有直接通过细胞壁感染。还有一些植物是由侧根穿过表皮的裂隙部位侵染植物组织内部。而水生的豆科植物则是从表皮层细胞侵染根部。感染形成的根瘤一般有两种类型，一种无限生长型根瘤（如：三叶草、苜蓿、豌豆等），具有顶端分生组织，在根瘤成熟后能继续生长，使根瘤体积增大，以致分叉。另

一种是在有限生长型根瘤，没有分生组织，生长发育一段时间后，各部分同时分化成熟，根瘤体积不再增大（如大豆、豇豆、山麻黄、花生等），如图8-1。

无限型根瘤有限型根瘤

图8-1 无限型根瘤和有限型根瘤

（（引自李阜棣，2000）

根瘤菌和豆科植物相互作用时，首先是豆科植物根系在土壤中生长，刺激相应的根瘤菌向根际移动并大量繁殖。根的这种影响甚至可以达到2-3厘米远的距离。这时，许多根瘤菌吸附在根的表面。这种吸附不是简单的物理过程，而是豆科植物与相应的根瘤菌之间的特定识别作用。其基本过程为：1）植物分泌特异的黄酮或类黄酮物质；2）根瘤菌合成和释放类似几丁质的寡聚多糖（胞外多糖）；被称之为结瘤因子；都含有3～5个糖苷基单位组成的 -1,4-N乙酰葡萄糖胺骨架；在非还原段C-2位上有一脂肪酸链；因菌种不同，两端的其它碳位上具有不同基团，它们决定结瘤作用的特异性；3）如果结瘤因子能够正确识别出黄酮或类黄酮物质，就会激活其它的nod基因，然后这些基因的编码蛋白共同形成结瘤因子；4）植物再识别并确认正确的结瘤因子，这样，结瘤因子就启动了结瘤的早期过程；5）除结瘤因子之外，根瘤菌的胞外多糖可能在以后结瘤过程中(细菌侵染植物细胞)起到重要的识别作用。

根瘤菌进入根毛细胞的部位，根毛细胞壁内陷，并开始分泌一种含纤维质的物质，将根瘤菌包围起来，随着根瘤菌向前推进，形成一条管状的分枝或不分枝的纤维素鞘，称着侵染线。在显微镜上可看到根瘤菌在卷曲的根毛壁上形成一个明显的点，并不断膨大。侵染线不断延伸，直到根的内皮层。在适宜的寄主细胞中，侵染线细胞破裂，细菌释放到寄主细胞的细胞质中，然后，每个细菌由寄主植物产生膜包围起来，膜和膜之间留有空隙，可以让植物细胞内氧、氢和二氧化碳等气体，有时包括氨气体通过，以适应生物固氮的需要。根瘤菌侵染线形成和发展过程中，根毛细胞核具有十分重要的作用，如果最初侵染点上没有细胞核，侵染线就不能发育而造成其凋亡。侵染线使根毛生长速率减少7-10 μm h-1。McCoy’s (1932)对紫花苜蓿的研究表明，侵染线在化学结构上与根毛壁是相似的。侵染线的形成频率相当低，在这些侵染线中，根瘤菌分开被包围在一种尚未成型的结构中。这种结构由细菌外多糖和植物糖蛋白组成。侵染线的尖端是开放的。侵染线尖端的封闭会导致其不能形成。Vance (1983)认为，侵染线的根毛细胞壁对试图穿透或机械伤害产生应答性生长，这与对疾病的抵抗反应是类似的。根瘤菌在侵染线内不断繁殖，侵染线也就不断伸长，向根毛基部和表皮细胞推进。每小时约可前进5-8μm，1-2天内到达表皮细胞。通常每条根毛有一根或几根侵染线，但只

有个别侵染线能够持续发展。当侵染线到达根毛细胞基部的细胞壁时，侵染线壁同细胞壁联接起来，穿过表皮细胞壁向根内推进。侵染线到达根的皮层后就分枝发育，侵染线侵入根的皮层组织的深度随植物种类和入侵位置而异。在大豆主根中，侵染线只能达到皮层第5-6层薄壁细胞；在侧根中，由于皮层细胞的抵抗力较弱，侵染线可直达到中柱鞘细胞层。

2）根瘤的发生和发育

当侵染线到皮层3-6层细胞时，位于前方靠近内皮层的细胞受到影响，开始分裂，成为根瘤的分生组织。而寄主根部皮层细胞进一步分裂发育增长形成纤维厚壁组织，在外观上凸出到根的表层上，成为“疙瘩”，即所谓的根瘤。不断长大的根瘤分化为外皮层组织和内部组织，并形成维管束与根的维管束接连起来，建立了共生关系。共生开始后，根瘤菌聚集在寄主细胞的细胞质外围，大量繁殖，变成环带状的肿大类菌体。

在圆球状有限型生长根瘤中，如Lotus, Glycine, Phaseolus 和Vigna，结瘤分生组织在外皮层开始。然后，在内皮层细胞也产生分裂。这些分生组织融合，形成初始根瘤体。通过细胞膨大向四周分裂，产生圆球状根瘤。分生组织仅在根瘤发育的早期发挥短期（8-14天）作用。成熟有限生长型根瘤组织没有分生能力。

相反，在无限生长型的根瘤里，如苜蓿和三叶草，根瘤分生组织发育是在邻接内皮层的内皮部。无限生长型的根瘤发挥数个月的功能，在有些多年生木本植物里甚至长达数年。并且细胞单向分裂，分生组织分化成为一种杆状。细胞分裂后接着进行细胞扩大，导致形成一种长、圆柱型的根瘤。随着根瘤生长，有些根瘤的顶端区域分化十分频繁，导致产生具有分枝、珊瑚状的根瘤。

3）细胞间直接侵染

在许多生长在热带和亚热带豆科植物中，没有观察到侵染线。花生、田皂角属（Aeschynomene）的一些种和某些柱花草属（Stylosanthes）的种，仅在侧根突出处发现长有根瘤。又如在田皂角（Aeschynomene indica）和圆锥田皂角（A.pamiculata）存在茎瘤。研究表明豆科植物中存在另一种感染方式。这种方式表现为根瘤菌能够诱发根毛的卷曲与分枝，但这种方式仅发现于侧根突出处。然而，这种根瘤菌的入侵仅限于通过根毛壁和邻接的表皮和皮层细胞间的空间突出处。并且感染仅发生于根毛有膨大基部细胞处。虽然仅仅是被感染的突出侧生根的皮层细胞发育为根瘤，但最初被根瘤菌入侵的是上述根毛着生的膨大基部细胞。

根瘤菌侵染宿主植物的感染方式取决于寄主植物，而不是由细菌的基因组所决定。

8.5.2.2 根瘤的结构和功能

1）根瘤的结构

根瘤菌在寄主植物中形成的根瘤分为五个部分：1）由小细胞组成的分生组织，这些小细胞不会被根瘤菌侵染，只能促使根瘤的生长。2）侵染线区域：这一区域的细胞增值很快，被根瘤菌侵染，但并不固氮。3）固氮区域：在寄主植物这部分细胞里充满了根瘤菌，菌体外形膨大，呈各种形状，称为类菌体。这种形态的根瘤菌里含有固氮酶，因此能够固定空气中的氮。固氮酶中含有铁和钼，这两种金属在传递电子中具有重要作用。此区域呈红色或粉红色，是细胞内含有豆血红蛋白的缘故。豆血红蛋白是一种将氧传递给类菌体的红色素，保证固氮所需的无氧或低氧环境，又能满足固氮所需的能量。4）退化区域：呈浅绿色，细胞已经退化，不再固氮。5）维管系统：在中柱的导管中形成，用以为根瘤输送营养物质，把固氮所需的碳水化合物输入根瘤，同时把合成的含氮化合物运送到叶中去。

不同类型的根瘤由于生长和发育的方式不一样，其形状和大小不一，无限型根瘤是长、圆柱型的，常象珊瑚状，在根瘤的末端有顶端分生组织。成熟根瘤有三个色区：1）白色区，它包括根瘤分生组织和侵染线区；2）粉红色区，存在有豆血红蛋白，它是有效固氮的部位，含有不同发育阶段的类菌体（有固氮酶活性的细菌）；3）老根瘤的绿色区，预示根瘤基本

衰老。有限型根瘤呈圆形，其单个根瘤内没有太多的分生组织。新形成的小根瘤是白色并含有大量可分裂的细胞，在豆血红蛋白作用下，有的瘤表现出粉红色。衰老的根瘤是绿色或棕色。不同发育时期的根瘤可以在成熟植物任何一个时期内形成。

2）根瘤的功能

根瘤是固氮作用的场所，根据其不同组份的作用可以分为以下三类功能。

第一类是根瘤中固氮作用的能量供应及产物的同化和转运的酶类。根瘤菌的生存、代谢活动和固氮都需要能量。植物地上部分光合作用产物运输到根瘤中，经过代谢产生还原力、ATP和一些代谢产物，供给类菌体中固氮酶进行固氮之用。光合作用每同化100单位碳，就有32单位转运到根瘤中；而类菌体每固定100单位氮，只有6单位保留在根瘤中，绝大部分运送给植物的地上部分，一小部分转送给根系，固氮产物氨输送给植物，为植物合成蛋白质提供原料，同时也防止了氨在根瘤内累积而毒害类菌体中的固氮酶，从而提高了固氮效率。

第二类是根瘤色素。根瘤发育形成一定的结构物质，可使根瘤内环境维持在厌氧状态。有效根瘤由于含有一种豆血红蛋白，呈现红色，豆血红蛋白能够为类菌体提供低浓度和高流量的微环境，在根瘤中起调节氧的缓冲剂作用，把多余的氧气送走。因为固氮酶在氧压较高时失活；而为了提供还原作用的能量，类菌体又需要氧进行氧化磷酸化，这样也为ATP形成创造了条件。

第三类是与根瘤的固氮效率相关酶类。根瘤中进行的固氮作用和豆科植物的整个新陈代谢结合起来，使这种共生体系的固氮效率比自生固氮体系高很多。自生固氮菌每消耗1克碳水化合物固氮约10毫克，肺炎克氏杆菌约为5毫克，而根瘤菌－豌豆共生体系可以达到270毫克。虽然自生固氮菌比活性（即每克细胞蛋白每小时固氮量）比根瘤菌高，但类菌体利用能量的效率高，特别是其固氮周期长，因此，它的总固氮效率显著高于其他固氮体系。

一般认为，影响共生固氮有三个方面的因子：1）根瘤的数目；2）在每个根瘤中含菌组织的容积；3）含菌组织固氮持续的时间。

在固氮效率上，以往的研究表明根瘤菌存在有效菌株和无效菌株。事实上，根瘤菌的有效性和无效性，不仅与菌株的本性有关，而且也与其共生的寄主植物的种类甚至品种有关。

8.5.3 根瘤菌与豆科植物的关系

豆科植物共生固氮占整个生物固氮量的1/2以上，而豆科植物是只有和根瘤菌形成的共生关系后，才能固定大气中的氮。大量的研究表明，豆科植物的固氮效率受到寄主、根瘤菌和两者相互作用三方面的影响。不同的根瘤菌株在不同品种的豆科植物上的固氮能力往往不一致。提高固氮效率的关键在于有一个使高效根瘤菌进入同时又有拒绝土壤中大量无效或低效根瘤菌的分子识别系统。

而与豆科植物－根瘤菌共生固氮有关的基因涉及根瘤菌基因和宿主基因，根瘤菌基因有结瘤基因(nodD、nodABCIJ和hsn基因),根瘤菌细胞表面结构基因(exs、lps和ndv 基因)和固氮基因(nif、fix基因 )和结瘤效率基因（nfe）；宿主基因主要是结瘤素基因(ENOD和NOD基因)。根瘤菌结瘤基因表达后诱导产生结瘤因子，在根瘤发育过程中,这些基因在根瘤菌与植物之间进行着信息交换,并且具有不同表达水平的结瘤因子和植物激素对它们进行着调节。

8.5.3.1 根瘤菌与豆科植物的互接种族关系

根瘤菌的突出特点是能够进入豆科植物的根内，在其中繁殖并形成根瘤，同时能利用分子态氮作为氮素营养。根瘤菌的各个菌株只能感染一定的豆科植物。有的菌株只能感染一种豆科植物；而有的可以感染多种豆科植物。不论是何种根瘤菌，在与豆科植物根系上形成的根瘤上，根瘤菌对寄主植物的感染性具有专一性和有效性。

由于根瘤菌与豆科植物的共生固氮特点以及这种共生关系的重要农业意义，在根瘤菌

的研究中，包括根瘤菌的分类学的研究，始终与研究它们和豆科寄主的关系联系在一起。根瘤菌在豆科植物根上形成根瘤的专一性，构成了“互接种簇”关系。在同一互接种簇内的植物，一般可以为本接种簇内的根瘤菌交叉感染形成根瘤，而不同互接种簇之间，则不能互接形成根瘤。目前对互接种簇的确切概念在看法上也有分歧。尽管如此，下面所列的豆科植物与根瘤菌互接种簇的分类，一般能为人们所接受。

属于快生型根瘤菌类的可分为：

1）紫花苜蓿簇：包括草木樨、紫花苜蓿、胡卢巴属在内。其共生菌为苜蓿根瘤菌；

2）三叶草族：共生菌为三叶草根瘤菌；

3）豌豆族：包括豌豆属，蚕豆属，刀豆属，香豌豆属、鹰咀豆属等；

4）菜豆族：包括菜豆属中的一些种，如菜豆、四季豆、扁豆、赤豆、绿豆、红花菜豆。共生菌为菜豆根瘤菌。

属于慢生型根瘤菌类的可分为：

1）羽扇豆簇：包括羽扇豆和乌足豆族植物。共生菌为羽扇豆根瘤菌；

2）大豆族：大豆属的大豆、青豆。共生菌为大豆根瘤菌；

3）豇豆族：包括豇豆、扁豆、刀豆、山扁豆、山绿豆、木蓝、花生、猪屎豆、赤豆、胡枝子、合欢、含羞草、野百合等植物。共生菌为豇豆根瘤菌；

4）紫云英族：如紫云英属的红花草。共生菌为紫云英根瘤菌。

以上列举的互接族仅仅是豆科植物的一小部分，即使是一小部分也表现出许多例外和交叉互接种现象。

8.5.3.2共生固氮相关的基因与作用

1）与共生固氮有关的根瘤菌基因

在豆科植物－根瘤菌共生固氮体系中，参与根瘤发育的根瘤菌基因可分为以下四类。

第一类是结瘤基因(nod、nol、noe)，其主要功能是共生关系早期信号分子的形成与交换。它们位于根瘤菌的共生质粒(sym plasmid)上，包括3组：调节基因(nodD)，共同结瘤基因(nodABCIJ)和宿主专一性基因(又叫基因hsn)，如nodH。调节基因nodD存在于所有根瘤菌中，一般是组成型表达，其产物可激活其它nod基因的表达，但它的激活又受到宿主植物专一的黄酮类物质的调节。原因是nod蛋白在类黄酮的存在下能够和nodD基因启动子中的30~60bp长的高度保守的核苷酸序列（即nod box）结合。一般认为，nodD是一转录结合物，调节其它nod基因的表达。共同结瘤基因nodABCIJ存在于所有根瘤菌中，具有较高同源性，并且在功能上是互补的，它对豆科植物根毛卷曲和皮层细胞分裂是必须的。宿主专一性基因控制根瘤菌的宿主范围。

第二类是与细菌细胞表面结构有关的基因(exs、lps、ndv) 。根瘤菌的结瘤基因表达后,将合成并分泌一类脂寡糖化合物（即结瘤因子），作为根瘤菌返还给宿主植物的信号分子。所有根瘤菌分泌的结瘤因子都具有相似的骨架结构：一个由3~5个N-乙酰氨基葡萄糖组成的糖骨架和在还原糖末端C2上连的一脂肪酸链构成。但不同根瘤菌来源的结瘤因子在侧链上羟基的取代基团、脂肪酸链的长度和不饱和方面表现出较大的差异，而这些结构的差异是与根瘤菌的宿主范围紧密相关的。与根瘤菌细胞表面结构有关的基因，即与胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)和中性葡聚糖合成有关的基因，分别称exs、lps和ndv基因。它门对建立共生固氮关系是很重要的，这类基因突变导致不能形成侵染线或形成空瘤。

第三类是固氮基因(nif、fix)，分为固氮酶基因（nif基因）和共生固氮基因（fix基因）。nif基因是固氮微生物所共有的，有高度的保守性，它与肺炎克氏杆菌(K Pneumoniac)有同源性的固氮酶结构或调节基因。其中nifA是转录调节基因，它对其它nif基因和某些基因进行正调控；nifDH是固氮酶的结构基因；nifL是负调节基因。fix基因是只在根瘤菌中发现的、控制共生固氮作用的基因，其中fixABC在电子传递中可能具有作用；已报导fixC对膜嵌入

有一个信号序列；fixLJ对nifA基因转录调节。

第四类是结瘤效率基因（nfe）。这是一个控制竞争结瘤的基因，如nfeA，B，D。在苜蓿根瘤菌的一个隐晦大质粒pRmeGR4b上，发现了约5kb的新的共生片段，该区域的突变导致结瘤的延迟，其结瘤效率较野生型菌株低。nfeC基因的表达需要有功能的nifA基因的存在。

2）与共生固氮有关的植物基因

在根瘤发育的各个阶段，一些植物基因得到特异性表达，这些在根瘤发育中特异表达的植物基因被称为结瘤素(nodulin)基因。通过对根瘤菌发育的不同时期的cDNA文库进行差异筛选，已经从多种植物中分离鉴定出了许多结瘤素基因。在根瘤固氮开始之前，表达的植物基因被叫做早期结瘤素基因(ENOD)，相反在固氮开始时和之后，表达的植物基因则称为晚期结瘤素基因(NOD)。Enod一般在根瘤接种数小时后到根瘤具有固氮能力之前发生作用。而Nod大多数在根瘤有固氮活性后才开始表达，与固氮作用具有密切关系。研究最多的是豆血红蛋白(Lb)。

3）共生固氮各阶段的信息传递和基因表达

豆科植物与根瘤菌共生形成根瘤的过程可分为5个阶段。

第一阶段是根际的殖民化。根瘤菌趋向性地接近根毛细胞，并在植物根际繁殖的过程称根际的殖民化。根瘤菌对豆科植物根际的殖民化是由细菌的趋向性和根分泌物刺激根瘤菌生长的潜力来决定的。豆科植物分泌的黄酮和类黄酮能够特异性识别根瘤菌产生的胞外多糖等物质，导致根瘤菌向根际运动。

第二阶段是根毛细胞变形和卷曲。通过比较接种野生型根瘤菌和nodABC突变体或未接种的根毛细胞mRNA的体外翻译蛋白图谱，发现接种根瘤菌的根毛细胞中，mRNA在根毛发育早期也显示出较高水平，反映根瘤菌能促进根毛细胞发育。结瘤因子的脂肪酸链是其诱导根毛变形所必需的，但脂肪酸的结构并不是很重要。

第三阶段是侵染和侵染线的形成。在根瘤菌的作用下，豆科植物根毛卷曲部位植物细胞壁局部水解，细胞质膜向内生长，同时新的细胞壁物质沉积在内陷的质膜处，形成一种管状结构，即侵染线。细菌就是通过侵染线传递到根内皮层的植物细胞中。随着侵染线向根毛基部生长，在被侵染部位高度液泡化的根皮层细胞被激活，这些活化的细胞进行细胞质重排，形成横跨中央大液泡的辐射状胞质桥，这种胞质桥被认为是为侵染线通过作准备，因而被称为前侵染线。

RNA原位杂交研究表明，寄主的PsENOD12基因特异地在根瘤菌接种后的根毛细胞和含侵染线的根皮层细胞中表达，而PsENOD5基因只在侵染线前部的皮层细胞中表达。而对根瘤菌突变的研究也表明，细菌表面物质在侵染过程中起重要作用。EPS、LPS和葡聚糖是根瘤菌侵染植物的重要物质，其突变体一般不能有效地侵染植物细胞。其中LPS的O-抗原基因对细菌的释放非常重要，其突变体只能形成小的无效根瘤。不能分泌环化葡聚糖的根瘤菌虽诱导植物形成小根瘤，但这种根瘤只有少量侵染细胞。环化葡聚糖可避免植物防卫反应中起作用，并在细菌的渗透适应中起作用，它为细菌创造适当生长环境。

第四阶段是根瘤原基和分生组织的形成。在根瘤菌侵染根毛细胞的同时，根皮层细胞也被激活并开始细胞分裂。皮层细胞分裂，以及形成什么样的根瘤是由宿主植物决定的，而不是由根瘤菌决定的。

在根皮层细胞分裂形成根瘤原基时，一些植物基因得到特异性表达，如早期结瘤基因ENOD12，ENOD40。PsENOD12不仅在含侵染线的细胞中表达，而且也在根瘤原基细胞中表达。PsENOD40的表达模式和PsENOD12相似。这2个基因都不在分生组织中表达，除了在根瘤原基的诱导表达外，PsENOD40也在面对根瘤原基的根中柱鞘细胞中表达，因此该基因有可能控制中柱和根皮层之间的物质运输和信息传递。结瘤因子能够诱导根内皮层，特

别是对着原生木质部的部分，形成根瘤原基。早期结瘤素基因PsENOD12和PsENOD5的表达模式与结瘤因子诱导根瘤原基的形成是一样的。因此，结瘤因子可能是根瘤原基形成和早期结瘤素基因表达所需的唯一的细菌信号分子。

第五阶段是根瘤发育。在根瘤的生活周期中，分生组织连续不断地向基部分化形成中央组织和外周组织。中央组织是被根瘤菌侵染的组织，而外周组织包括根瘤皮层、内皮层和根瘤薄壁组织，是根瘤维管束存在的地方。

分生组织不断地分化形成根瘤组织，其结果中央组织含有处于不同发育时期的细胞，苜蓿根瘤可分为5个区段：顶端分生区、固氮前区、间隔区、固氮区和衰老区。目前为止还未发现在顶端分生组织中特异性表达的基因。PsENOD12只在固氮前区的上部表达，而PsENOD5在所有固氮前区的侵染细胞中表达，且在该区的基部达到最高，而PsENOD40则在整个固氮前区具有相同的表达水平。在固氮前区的上部，根瘤菌nod基因表达了，而在其基部不表达。这表明nod基因在侵染线或刚释放的根瘤菌中是表达了的，进而结瘤因子可能是在根瘤的该区合成的。固氮前区向间隔区的过渡区，其淀粉积累的开始与根瘤菌基因ropA 和几个结瘤素基因表达的急骤下降，及几个晚期结瘤素基因PsENOD6和根瘤菌基因nifH 开始表达。在固氮区，结瘤素基因，如PsENOD6、Lb、根瘤菌基因nifH都在固氮区表达了。在衰老区可能表达其他植物器官衰老相似的基因（如编码水解酶基因）。

大部分结瘤素基因是在根瘤中央组织中表达的，只有2个早期结瘤素基因，即ENOD2和ENOD40在外周组织中表达，其中ENOD2特异地在根瘤薄壁组织中表达。

8.5.4固氮机制

豆科植物－根瘤菌共生体系的生物固氮是生物界重要的生理现象。共生固氮效率是多种因子综合作用的结果。

8.5.4.1 固氮的酶学机制

固氮酶所催化的反应通过两个步骤来完成。组分Ⅰ是一个多聚蛋白，由两个相当分子量各为5.0×104的α亚基和两个相当分子量各为6.0×104的β亚基组成，α和β亚基分别由nifD和nifK基因编码。由于组分Ⅰ含有4个｛4Fe-4S｝连接桥和两个铁-钼辅因子（FeMo-Co）组成，所以称为铁钼蛋白（FeMo-protein）。组分Ⅱ含有两个完全相同、分子量为 3.0×104的亚基，由nifH基因编码。它只有一个｛4Fe-4S｝连接桥，称为铁蛋白，位于两个亚基之间，一次只可送出一个电子，是固氮反应的“瓶颈”，固氮酶的结构如图8-2。

固氮酶（nitrogenase）的有三个活性部位，具有不同的功能：1）铁蛋白，如铁氧还蛋白（ferredoxin）或黄素氧还蛋白（flavodoxin）的还原物，他们是电子携带者。2）电子转移部位，将单一电子从铁蛋白转移到铁钼蛋白，是依赖MgATP过程,，随着2MgATP水解转移一个电子。3）电子转移的受体，其键结合在铁钼蛋白的活性位置，其作用是将将氮气转移至受体。

氮固定的反应式如下：

N2 + 8H+ + 8eˉ + 16MgATP 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi

固氮酶不仅可将氮气分子还原为氨，亦可将氢离子还原为氢气，还可还原不饱和的乙炔、叠氮化物、氰化物等不饱和分子。

图8-2 固氮酶的结构

（引自尤崇杓等，1987）

对于固氮酶的所有底物还原反应来讲，MgATP是不可缺少的重要物质。MgADP既是固氮酶的产物，又是固氮酶的生理抑制剂，能抑制固氮酶的各种底物还原活性。固氮酶的活性受ADP/ATP比例变化调节，当ADP/ATP＝1/2时，则固氮酶活性完全受到抑制。目前认为MgATP的作用主要有：1）ATP提供电子转移时所需的能量（活化电子），作为电子传递的能量供应者；2）移去电子活化中心上的OH-而使之较易变为还原态；3）改变酶蛋白的构型，其功能之一首先是和铁蛋白并使铁蛋白的构型发生特异的变化，从而使其适应底物还原；4）ATP水解供给氮还原所需的质子；5）与钼氧化态作用生成有活性的钼还原态；6）参与形成酶金属－氢化物。并且ATP在生物固氮中的作用是专一的。而MgADP的功能主要是1）使铁蛋白发生限速构象变化，抑制从SO2.-到铁蛋白以及从铁蛋白到铁钼蛋白的电子转移；2）对固氮酶的底物还原活性部位起负的别构调节作用。

8.5.4.2 固氮的基因及其调控

实验已经证明根瘤菌的结瘤、固氮和编码氢化酶的基因都位于根瘤菌质粒上，通过质粒在不同根瘤菌菌系间转移，可以改变根瘤菌的结瘤固氮作用。而根瘤菌的基因中，nifAL基因控制着整个固氮酶系统的表达活性。事实上，nifA和nifL基因产物分别是nif操纵子的正和负调控因子。但细胞内没有NifL蛋白质时，即使在有NH3和O2存在的情况下，nifA基因产物足可激活其他nif基因的表达。并且nifA基因对固氮活性的影响是通过反式作用因子实现的。很多不能固氮的突变体突变位点在nif区以外，因为在nif区外存在氮调控（nitrogen regulation, ntr）位点，而nifA基因产物只有在ntrA、ntrC基因产物的共同作用下才能正常工作，激活nif操纵子群。看起来，ntr系统像一个粗调开关，而nifAL系统则像一个微调开关，两者共同作用，调控nif基因的表达。

8.5.4.3 影响固氮效率的因素

1）土壤因素

通常豆科植物仅依靠共生固氮难达到高产目的，一般仍需要配合施用少量化学氮肥。在苗期施用少量氮肥可加强植株光合作用，促进根系生长，为根瘤菌感染和结瘤创造较好条件。在籽粒形成后期追施少量氮肥有助于维持大豆营养生长和延长根瘤菌固氮作用，促进籽粒形成。另一方面，土壤环境中较高浓度的化合态氮(主要为硝态氮和铵态氮)能影响根瘤菌对根毛的侵染，降低结瘤数量，抑制类菌体固氮酶活，从而对其固氮效率表现出明显抑制作用。

土壤pH对接种根瘤菌的共生固氮效率也有明显影响。研究结果表明，pH对根瘤菌生长的影响是一个相对渐进的过程，并依据其受影响程度不同可分为酸敏感型和酸耐受型两大类，随着土壤的酸化，根瘤菌结瘤和植物生长均会受到不同程度的抑制。

除土壤理化因子外，生物因素如土壤微生物(特别是土著根瘤菌)、噬菌体、菌根等也会影响根瘤菌的占瘤率，从而影响其共生固氮效应。

2）宿主植物

已有的研究表明，要获得固氮作用的根瘤，至少有100个宿主植物的基因在起作用。其

中已经从11种豆科植物中鉴定了60个基因，这些基因的突变表现出四种表现型：1）不结瘤（抑制侵染、侵染发生但不形成瘤）；2)不固氮的瘤，瘤内只有很少的细菌；3)瘤内有细菌，但早期衰老的无效瘤；4)在使用氮肥时超结瘤。

在根瘤菌的作用下，豆科植物至少有20多种多肽特异性表达，这些蛋白质统称为根瘤素。根据其生理功能分为3类：1)根瘤的结构蛋白；2)将类菌体固定的氮素同化并转移到植物体内的酶系统；3）维持类菌体功能所必需的蛋白质。豆血红蛋白（leghemoglobin, Lb）属于第三类根瘤素。

豆血红蛋白在体内的主要功能是调节根瘤细胞氧含量，但其血红素辅基可能是细菌编码。固氮酶在高氧压下钝化或失活，但固氮作用需要能量，这种能量有类菌体中的有氧呼吸提供，豆血红蛋白对氧的高亲和力能解决这一矛盾。但目前豆血红蛋白在根瘤中的位置还不清楚，有人认为是存在于根瘤细胞与类菌体之间的质膜包处，也有人认为是位于寄主原生质体中。

植物的其它基因也能控制固氮效率，例如提高植物光合效率或采用高光合效率的品种能加强固氮过程的碳源和能源供应，从而提高根瘤菌的共生固氮效率。

3）根瘤菌

a. 四碳二羧酸转移酶基因dct

苹果酸和琥珀酸等四碳二羧酸是植物供给类菌体以支持共生固氮所需要的直接碳源及能源，加强四碳二羧酸转移酶基因(dctABD)的表达可以加强光合产物向类菌体的传递，以充分满足其固氮作用和氨同化吸收过程对能量及碳源的需求，从而提高其共生固氮效率。dct 基因能明显地影响根瘤菌的固氮效率和植物生长。在受体根瘤菌中导入dct基因可显著提高受体菌的共生固氮效率。

b. 固氮酶正调节基因nifA

nifA除了作为固氮酶的正调节基因外，还与根瘤发育、类菌体分化及竞争结瘤有关。加强nifA的表达水平也是提高根瘤菌共生固氮效率和结瘤能力的途径之一。把含有nifA基因的质粒导入到根瘤菌中，固氮能量增强。

c. 吸氢酶基因hup

研究表明若能利用部分根瘤菌所具有的吸氢酶基因hup来循环利用固氮酶还原H＋放出的H2，则有可能因减少能量损失而提高固氮效率。hup基因定位于共生质粒上，它可以随质粒共转化。

8.5.5 生物技术在改良豆科牧草共生固氮上的应用

现代生物生物技术的飞速发展，使通过基因的改良提高固氮能力成为可能。这些研究已经在许多豆科牧草上得到了相应的应用。

要提高豆科牧草的固氮能力，首先要有高效和强竞争结瘤能力的根瘤菌菌株。一个优良共生体的建立需要适应环境条件的宿主品种和与之相匹配的根瘤菌菌株。人们正在努力通过生物技术的改良来找到更加匹配的组合。

8.5.5.1 豆科牧草的改良

目前国内外已经利用杂交及染色体工程、细胞及组织培养、基因工程等技术应用于豆科牧草的遗传改良上。

1972年美国率先开始了对苜蓿花药和组织培养技术的研究。与此同时，前苏联也进行了类似的研究，并进行百脉根、红三叶、红豆草的花药培养、组织培养和细胞培养技术的研究。加拿大等国还研究了紫花苜蓿原生质体培养技术。70年代末到80年代初，美国等又开始了牧草基因工程的研究，并取得了突破，1991年转基因苜蓿植株已移至田间种植。我国牧草生物技术的研究是在70年代末开始起步的，一个重要标志是：1970-1980年黑龙江

畜牧研究所和中国农业科学院草原研究所分别运用花药培养获得了紫花苜蓿再生植株。

随着现代数量遗传学和分子标记技术的发展，将复杂的数量性状进行QTL定位研究，将使育种家可以直接选择和操作数量象征的基因型，是挖掘和利用新资源的一种非常有效的方法；也是进行图位克隆的基础。以往的研究已经表明固氮相关性状是受多基因控制的数量性状，构建豆科牧草的作图群体，特别是构建次级群体，减少其他遗传背景的干扰，如利用回交和自交结合分子标记技术构建染色体代换系，将为精细定位固氮相关性状的主效QTL，认识豆科植物中固氮的必须和高效固氮的基因，为分子标记辅助选择高效固氮豆科牧草，乃至克隆相关的结瘤和固氮基因，为共生固氮向非豆科植物转移奠定坚实的基础。

苜蓿中已构建了不同的作图群体，但是因为紫花苜蓿为同源四倍体，其遗传基础复杂，四倍体栽培苜蓿中控制许多性状的基因具有不同于二倍体的效应，数量性状在不同倍性水平表现不同。1992年Wu K.K.等提出利用单剂量位点（single dose alleles, SDAs）检测和估计分子标记的连锁距离，为同源多倍体作图提供了理论依据。目前在NCBI（美国国立生物技术信息中心）上有一张公共苜蓿图谱，已经将四倍体苜蓿整合为8个连锁群，但其标记的密度很低，需要进一步完善和发展。要想利用正向遗传学途径精细定位和图位克隆与紫花苜蓿相关的固氮基因，将是未来苜蓿固氮研究，乃至对豆科植物来说都是一个相当艰巨的工作。

8.5.5.2 根瘤菌的改良

目前对许多重要的根瘤菌的基因组序列已经进行了测定。豆科植物的大多数结瘤、固氮基因都位于质粒上，可以通过质粒在菌株间转化，使基因得到交换，而改变了许多菌株的结瘤固氮能力。

近几年来，分子生物学技术也已成功应用于根瘤菌的研究，通过原位杂交，差别显示技术研究了根瘤菌的分子信号物质和固氮作用需要的基因。分子标记技术也已成功应用于根瘤菌的系统发育和遗传地位的研究，为筛选高效强竞争结瘤能力的菌株提供了新的强有力的支持。

现在人们又在致力于根瘤菌的蛋白质组学的研究，已期待能够改变根瘤菌的寄主范围。通过蛋白质的双向电泳技术，找到不同根瘤菌之间蛋白质的差异，从而发现结瘤的信号物质和固氮过程中发挥作用的蛋白质。

8.5.5.3 固氮技术在豆科牧草中的应用

1) 根瘤菌剂的生产

选择高效强竞争结瘤能力的菌株后，一般用液体摇床通气法或发酵装置得到大量的根瘤菌液体培养物，这种液体培养物可直接作为接种剂，也可进一步和磨得很细的草碳（pH6.5左右）混合，其它一些物质（如：堆肥、糖的下脚料等）可代替草碳。混合前，为更好的保护根瘤菌和使根瘤菌充分吸附到这些物质上，一般在120斤吸附剂中加糖100克，磷酸二氢钾4克，过磷酸钙100克和2毫升微量元素（硼酸5克、钼酸钠5克、1000毫升水），再加25斤的菌液，充分拌匀，晾干，即成为固体接种剂。

2) 接种技术

根瘤菌的接种方法很多，按接种方式可分为直接接种和间接接种。现在很多牧草采用了种子包衣技术的直接接种方法，这种方法有利于高效菌株的推广，使农民在购买牧草种子时，同时得到了高效的根瘤菌菌株。但是，已有的研究表明，种子包衣接种往往使接种根瘤菌不在最佳的结瘤位点，导致其竞争不过低效甚至无效的土著根瘤菌，使接种不易成功。而间接接种的方法是将接种物与种子分开播种，对于化学处理的种子更必须如此。但是接种物应置于种子附近，以便让胚根和根瘤菌接触。液态接种物置于水中呈悬浊液，每公顷用量150升以上，可以通过设计一种分洒器或改装某种农药喷雾器来实现。颗粒接种物可与种子一同播入垄沟中，可设计一种附带的播种装置，达到不与种子混合而能同时播种。播种时，切记接种物中含有活的有机物，要防止高温干燥及与化学品接触。还可将液体接种剂先同土壤混

合后，播种到垄沟，这样有利于接种根瘤菌同土著根瘤菌竞争。

生物固氮原理、应用和研究进展

生物固氮的原理、应用及研究进展 摘要：生物固氮是自然生态系统中氮的主要来源全球生物固氮的量是巨大的，海洋生态系统每年生物固氮量在四百万吨到两千万吨，陆地生态系统生物固氮量在九百万吨到一千三百万吨，而工业固氮量在世纪年代中期每年约为一千三百万吨。可见，生物固氮在农林业生产和氮素生态系统平衡中的作用很大我国农民利用豆科植物固氮肥田历史悠长，直至现在仍保留着豆科植物和非豆科植物轮作套作和间作等耕作制度国外也十分重视固氮生物在农业中的作用。 关键词：生物固氮；联合固氮菌；自生固氮菌 一、生物固氮的原理 1982年，Postage 以肺炎克氏菌为例提出一个固氮酶催化机理模式，至今 仍被广泛采用其总反应式为：N 2 + 6H+ + nMg-ATP +6e-(酶)→2NH 3 +nMg-ADP+nPi 固氮微生物的固氮过程是在细胞内固氮酶的催化作用下进行的不同固氮微生物的固氮酶，其催化作用的情况基本相同在固氮酶将还原成的过程中，需要e和H+，还需要ATP提供能量生物固氮的过程十分复杂[1]，简单地说，即在ATP提供 能量的情况下，e和H+通过固氮酶传递给N 2，使它们还原成NH 3 ，而乙炔和N 2 具 有类似的接受e还原成乙烯的能力。 二、固氮微生物的种类 固氮微生物多种多样，不同的划分标准满足了不同的要求。从它们的生物固氮形式来分，有自生固氮、联合固氮、和共生固氮3种。 ①自生固氮微生物是指能够在自由生活状态下固氮的微生物总称。在自然界，自生固氮微生物种类很多，分散地分布在细菌和蓝细菌的不同科、属和不同的生理群中；并大致可以分为光合细菌和非光合细菌两类。前者如红螺菌、红硫细菌和绿硫细菌等，其中的某些种类可与其它微生物联合而相互有利；后者的种类很多。根据非光合细菌的自生固氮菌对氧的需求，可以分为厌氧的细菌如梭状芽胞杆菌[2]；需氧细菌如自生固氮菌、贝捷林克氏固氮菌、固氮螺菌等；以及兼性细菌如多粘芽胞杆菌、克鲁伯氏杆菌、肠杆菌等。自生固氮微生物中的某些种类，在有些情况下可以与植物进行联合固氮。 一般地，自生固氮微生物固定的氮素满足本身生长繁殖需要以后就不再固氮了，多余的氮反过来会抑制它们自身的固氮系统。同时，它们固氮效率也比较低。

高三生物教案：2、生物固氮(选修第一册)

第二节生物固氮 教学目的 固氮微生物的种类（A :知道）。 生物固氮的基本过程（选学） （A :知道）。 生物固氮的意义（B :识记）。 重点和难点 1 .教学重点 （1） 固氮微生物的种类。 （2） 生物固氮的意义。 2.教学难点 生物固氮的基本过程 教学过程 【板书】 共生固氮微生物 固氮微生物的种类 自生固氮微生物 生物固氮的意义 生物固氮在农业生产中的应用 【注解】 生物固氮：是指固氮微生物将大气中的氮还原成氨的过程 、固氮微生物的种类 （一）共生固氮微生物 1. 概念：是指一些与绿色植物互利共生的固氮微生物 2. 代表生物——根瘤菌 固氮 生物固氮过程简介 生物固氮在农业生产中的应用（ A :知道）。 生物

（1）代谢类型：异养需氧型 （2）共生特性：不同的根瘤菌，各自只能侵入特定种类的豆科植物。（根瘤=根瘤菌+膨大的根部薄壁组织） （3）共生关系表现：豆科植物为根瘤菌提供有机物；根瘤菌为豆科植物提供氨。 （二）自生固氮微生物 1 .概念：是指土壤中能独立进行固氮的微生物 2.代表生物一一圆褐固氮菌 具有一定的固氮能力，并且能够分泌生长素，促进植物的生长和果实的发育 【例析】 1 .自生固氮菌的新陈代谢类型是（） A?自养型、需氧型B.自养型、厌氧型C.异养型、需氧型 D ?异养型、厌氧型 二、生物固氮与氮循环 1.固氮作用： 2?有机氮的合成：光合产物+固氮产物（如NH 3、NO 3-等） 3.氨化作用：含氮有机物—微生物t NH 3 4.硝化作用：NH 3 ------------------------- NO 2 ---------------------------- NO 3 （需氧） 5.反硝化作用：NO 3-TNO2-TNH3 （氧气不足时）

生物固氮研究的前沿介绍(李季伦).

生物固氮研究的前沿介绍（李季伦） 氮是构成生物的主要元素之一，但分子态 N2却不能被生物直接利用，只有氨态氮(NH4+)才能掺入细胞内各种含氮的有机化合物中，其中包括重要的生物大分子——蛋白质和核酸。动植物本身都没有将N2还原成NH3的能力，但是有些原核生物的细 菌和古菌(并非全部)却有这种能力，称为生物固氮。化学合成氨和生物固氮都是将N2还原成 NH3。 由于N2分子之间是三键，即 N≡N，键能高，需要很高的能量才能将N≡N打开，化学合成氨必须在高温(350O C)和高压(500大气压)并以 Fe2+做催化剂时才能将 N2加3H2还原成2NH3，不但消耗大量不可再生的能源，而且要在耐高温高压的设备中进行，成本高；生产过程中排出的大量 CO2，增加了温室效应。此外，农业生产大量施用化学氮肥(铵盐或尿素)会造成土壤板结，且被植物有效利用的还不到40％，其余的有些在土壤中矿化固着，有些被土壤中的硝化细菌氧化成亚硝酸和硝酸，随水流入江河、湖泊和渗入地下水，造成水质污染；或在脱氮反硝化细菌的作用下释放出 N2而回归大气中。生物固氮也要消耗固氮菌氧化碳水化合物所产生的高能化合物，即 ATP，但这种反应是固氮菌细胞内的固氮酶在常温常压下催化完成的，是清洁的天然氮肥厂。固氮菌种类各异，在不同的生态条件下，生活着不同类型的固氮菌。有的可侵入豆科植物或某些非豆科树木的根部形成根瘤，根瘤菌栖居在根瘤内，依靠宿主植物光合作用合成的可再生的能源将 N2固定成氨，随即生成氨基酸，提供宿主植物以有机氮源，两者形成互利的共生关系，称为共生固氮。共生固氮的效率很高，其固氮量可高达10—15公斤氮素／每亩／每年。因此栽培豆科作物只需使用少量种肥，可以节约大量化学氮肥。但是共生固氮的宿主植物范围有限，非豆科的粮食作物(如水稻、小麦、玉米等禾本科植物)、棉花、大多数果树和蔬菜等，都没有与之共生的固氮菌，尽管在土壤中也自由生活着各式各样的固氮菌，但由于受种种因素(如土壤中缺乏可被利用的能源或含氮量较高等)的限制，它们的固氮效率不高，为植物提供的氮素很少，特别是当土壤中含化合态氮(如铵盐或硝酸盐)较高时，自生固氮菌便停止固氮，而利用土壤中存留的氮源进行生长繁殖，并未增加土壤中的含氮量。在原始森林和草原的土壤中和海洋里生活的固氮菌，由于环境中含氮量低，可固定较多的氮素，提供植物生长的需要。 由以上所介绍的生物固氮的知识，我们不禁要问： 第一、为什么只有某些原核的细菌和古菌才能固氮，而真核的真菌和高等动植物都不能固氮?目前己知这是不同生物的遗传性决定的。凡是固氮菌 都有与固氮有关的基因，特别是编 图1 奇形怪状的细菌 图2 银合欢根瘤菌 图3 根瘤菌

(高考生物)生物固氮作用的分子机理研究

（生物科技行业）生物固氮作用的分子机理研究

项目名称：生物固氮作用的分子机理研究首席科学家：王忆平北京大学 起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部

一、研究内容 生物固氮研究的关键科学问题是获得最佳生物固氮体系（包括共生固氮、联合（内生）固氮等）和建立非豆科植物的自主固氮体系，具体包括：（1）阐明根瘤菌共生固氮基因表达调控的网络，根瘤菌识别、传递环境和植物信号，调节自身基因表达的分子机理；（2）揭示固氮及氮代谢基因调控机理，与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制；（3）阐明共生固氮体系中植物与微生物相互作用的机理，如植物与微生物相互识别及分子信号的传导机制，克服宿主特异性，从而扩大根瘤菌的宿主范围；（4）利用单细胞真核生物--酵母菌的线粒体遗传操作系统，探索固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，为固氮基因向高等植物转移，建立非豆科植物自主固氮体系的奠定基础。（5）阐明固氮酶结构、功能和催化机理。 围绕上述提高生物固氮效率、扩大共生固氮植物范围、建立自主固氮体系的关键问题，主要研究内容有： （1）以模式豆科植物共生固氮体系为材料，分离和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传递的调控元件及基因，研究和建立根瘤菌与宿主植物共生关系蛋白相互作用网络；通过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究，揭示非豆科植物中存在哪些与共生相关基因的功能及调控机制，为探索扩大根瘤菌寄主范围和建立非豆科共生固氮途径可能性提供科学资料；分离和鉴定LysR、GntR等家簇转录因子及其靶基因，阐明根瘤菌主代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理；开展根瘤菌群体感应系统、Ⅲ型分泌系统及胞外多糖合成基因表达调节的双组分调控系统的研究，阐明这些代谢系统在不同环境条件下的功能和作用机制，揭示根瘤菌环境适应性与竞争结瘤之间的相关性。 （2）碳代谢与氮代谢是自然界生命活动的两大主要代谢作用。固氮基因调控

生物固氮

第二节 生物固氮 教学内容 生物固氮：是指固氮微生物将大气中的 还原成 的过程 一、固氮微生物的种类 （一）共生固氮微生物 ：代表生物——根瘤菌 （1） 代谢类型： （2） 共生特性：不同的根瘤菌，各自只能侵入特定种类的豆科植物。（根瘤＝根 瘤菌＋膨大的根部薄壁组织） （3） 共生关系表现：豆科植物为根瘤菌提供 ；根瘤菌为豆科植物提 供 。 （二）自生固氮微生物: 代表生物——圆褐固氮菌 具有一定的固氮能力，并且能够分泌 ，促进植物的生长和果实的发育 二、生物固氮与氮循环 １．固氮作用： ２．有机氮的合成：光合产物＋固氮产物（如ＮＨ３、ＮＯ３－等） ３．氨化作用：含氮有机物?? →?微生物ＮＨ３ ４．硝化作用：ＮＨ３???→?亚硝化细菌ＮＯ２－???→?硝化细菌 ＮＯ３－（需氧） ５．反硝化作用：ＮＯ３－→ＮＯ２－ →ＮＨ３（氧气不足时） 三、在农业生产上的应用 （一）土壤获取氮素的两条途径 １．含氮肥料的施用（１／６） ２．生物固氮（５／６） （１）将圆褐固氮菌制成菌剂，施到土壤，可提高农作物的产量 （２）对豆科植物可进行根瘤菌拌种，也能提高豆科植物产量 （３）通过转基因技术，可将固氮基因转到非豆科植物中（此法不仅能明显提高农作物 产量，而且有利于生态环境的保护） 随堂练习 1．豆科植物与根瘤菌的互利共生关系主要体现在 （ ） A ．豆科植物从根瘤菌获得NH 3，根瘤菌从豆科植物获得糖类 B ．豆科植物从根瘤菌获得含氮有机物，根瘤菌从豆科植物获得NH 3 C ．豆科植物从根瘤菌获得N 2，根瘤菌从豆科植物获得有机物 D ．豆科植物从根瘤菌获得NO ，根瘤菌从豆科植物获得NH 3 2．关于根瘤和根瘤菌的说法中，正确的是（ ） A ．根瘤即是根瘤菌 B ．根瘤是根瘤菌的聚合体 C ．根瘤是根瘤菌在其共生的植物体内所形成的癌变 D ．根瘤是根的内皮层的薄壁细胞受根瘤菌分泌物的刺激进行分裂，组织膨大而形成的

浅谈对发酵工程专业的认识

浅谈对发酵工程专业的认识 当今世界是一个快速发展的时代，众所周知，科学技术的进步是经济发展的重要指标。而生物科技是其中的一个重要组成部分。通过微生物的发酵工程构成了生物科技的核心。所谓发酵工程，是以微生物通过上游（分子改造，代谢工程等）、中游（发酵优化，智能控制等）、下游（分离纯化，清洁生产等）各种生物学操作，以得到人们所需要的一系列产品（细胞，代谢产物）的综合性科学。从生物发酵工程角度来说，这一专业的发展与经济全球化存在着相辅相成的关系。即经济的快速发展，推动了发酵工程专业的交流和创新，提供了发酵工程进一步前进的良好平台。发酵工程的应用领域非常广泛，包括农业、工业、医学、药物学、能源、环保、冶金、化工原料、动植物、净化等。它必将对人类社会的政治、经济、军事和生活等方面产生巨大的影响，为世界面临的资源、环境和人类健康等问题的解决提供美好的前景。 1. 发酵工程简介 发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。发酵不仅仅体现在食品领域，还存在于医药品、化妆品、能源、环境等领域。因此，发酵对于我们生活的方方面面都有着重要的影响，有光明的应用前景。 对于发酵工程而言，是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需要的产品过程的理论和工程技术体系，是生物工程与生物技术科学的重要组成部分。发酵工程也称微生物工程，该技术体系主要包括菌种选育和保藏、菌种的扩大生产、微生物代谢产物的发酵生产和分离纯化制备。进一步可以分为上游、中游和下游。 现代发酵工程的发展，是生物科学与数学、物理学、化学等科学之间相互交叉、渗透和相互促进的结果。发酵工程与有关科学的高度的双向渗透和综合，也已经成为当代生物科学的一个显著特点和发展趋势。 2. 上游领域(分子改造，代谢工程等) 发酵工程的上游领域是整个发酵过程的基础，随着近年来分子生物学的蓬勃发展，系统代谢工程定向改造目的产品生产菌株已经成为发酵领域的发展趋势。因此，上游领域主要集中在分子改造和代谢工程等相关方面。

生物固氮及其发展前景

生物固氮及其发展前景 摘要：本论文主要介绍生物固氮概念、固氮微生物及其种类和生物固氮发展前景。 关键词：生物固氮固氮微生物固氮生化机制生物固氮展望 引言：生物固氮是一个具有重大理论意义和实用价值的生化过程。生物固氮反应是一种及其温和及零污染排放的生化反应，它比人类发明的化学固氮有这无比的优越性，因后者需要消耗大量的石油原料和特殊的催化剂，并须要在高温（~300℃）、高压（~300个大气压）下进行。此外，若不合理地使用氮肥，还会降低农产品的质量，破坏土壤结构和降低肥力，以及造成坏境污染（如湖泊的水华和海洋的赤潮）等恶果。我国在近半个世纪当中，化肥产量猛增近6000倍，其有害影响已不断出现。因此，我们应深刻认识到，只有深入研究、开发和利用固氮微生物，才能更好的发展生态农业和达到土地可持续利用的战略目标。如果把光合作用旱作是地球上最重要的生化反应，则生物固氮作用便是地球上仅次于光合作用的生物化学反应，因为它为整个生物圈中一切生物的生存和繁荣发展提供了不可或缺和可持续供应的还原态氮化物的源泉。 内容：⒈生物固氮定义：指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化而还原成氨的过程，生物界中只有原核生物才具有固氮能力。 ⒉固氮微生物的种类 ⒉1 自生固氮菌

⒉⒈1好氧：化能异养、化能自养、光能自养 ⒉⒈2兼性厌氧：化能异养、光能异样 ⒉⒈3厌氧：化能异养、光能自养 ⒉2 共生固氮菌 ⒉⒉1根瘤：豆科植物、非豆科被子植物 ⒉⒉2植物：地衣、满江红 ⒉3 联合固氮菌 ⒉⒊1根际（热带、温带） ⒉⒊2叶面 ⒉⒊3动物肠道 ⒊固氮的生化机制 ⒊1生物固氮反应的6要素 ⒊⒈1ATP的供应由于N≡N分子中存在3个共价键，故要把这种极端的分子打开就得花费巨大能量。固氮过程中把N2还原成2NH3时消耗的大量ATP(N2:ATP=1:(18~24)是由呼吸、厌氧呼吸、发酵或光合磷酸化作用提供的。 ⒊⒈2还原力[H]及其传递载体固氮反应中所需大量的还原力（N2︰[H]=1︰8)必须以NAD（Ｐ）Ｈ＋Ｈ﹢的形成提供。[Ｈ]由低电势的电子载体铁氧还蛋白(ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ，一种硫铁蛋白)或黄素氧还蛋白（Ｆｌｄ，一种黄素蛋白）传递至固氮酶上。 ⒊⒈３固氮酶固氮酶是一种复合蛋白，由固二氮酶还原酶两种相互分离的蛋白构成，它们对氧都高度敏感。固二氮酶是一种含铁

非豆科植物固氮

精品资源 非豆科植物固氮 空气中含有大量的氮素，但并不能直接为高等植物吸收利用，只有在某些土壤微生物与植物共生，通过体内固氮酶的作用，将大气中氮还原成氨等氨化物的过程，植株才能利用大气氮。农业生产中常见的豆科植物根系上着生大量的根瘤菌，可以从空气中吸收和固定大量的氮素，这种作用称为生物固氮作用。大部分农作物由于缺乏共生固氮菌的作用，必须依赖氮肥供应才能生长。 长期以来，生物固氮是世界科学家关心和研究的重点。人们总是期望广大农田的粮食作物中能和豆科作物一样有固氮自肥的能力，以减少对化肥的依赖。所以，科学家最感兴趣的题目，是把豆科植物的根瘤菌奇妙的固氮能力转移给其他非豆科农作物，使之从空气中固定氮素以获取作物高产。 70年代中期，随着遗传工程的兴起，首先实现了细菌之间的固氮基因转移，为人们达到这种梦寐以求的目标展示了美好的前景。固氮遗传工程的主要研究目的是用遗传操作技术，将固氮微生物的固氮基因转移到非固氮微生物或农作物中，以扩大生物固氮的新资源。 80年代后期，美国科学家应用豆科宿主植物的提取物驯化出新根瘤菌转变菌株，用以处理小麦、水稻、高粱等7种非豆科植物能结瘤固氮。这些新菌株已分别命名为小麦根瘤菌、水稻根瘤菌等。 中国和德国的科学家进行合作研究，选用固氮根瘤菌作菌种，通过2，4－D 诱导其在小麦根部结瘤定殖，结果测定出诱发的根瘤有明显固氮酶活性。此后，我国科学家将固氮螺菌导入小麦根部结瘤，也测出固氮酶活性。通过15N同位素稀释法检测盆栽试验中诱发结瘤的麦苗固氮能力，连续4年5次试验测定证明，平均可从空气中固定15％氮素；15N同位素标记法检测证明，所固定的氮素中有1／3左右的氮素已转移到植株茎叶中。这些研究结果证明，目前非豆科作物结瘤固氮研究在结瘤和固氮两大关键技术方面已有全面突破，不仅可将根瘤菌移植到小麦根部结瘤，而且还突破了禾木科植物天然缺乏豆血红蛋白不能和根瘤共生固氮的障碍，终于使人工诱发的非豆科作物根瘤表达固氮能力。 日本国立遗传研究所的科学家成功地将豆类作物固氮基因移植到水稻根际微生物中。这种水稻新品种，约有20％的氮素来自根际微生物的固氮作用。澳大利亚科学家用强力诱变剂处理大豆，培育出一种新型的“超级分枝豆”，其根系固氮能力比普通大豆高出35倍，可以显著地提高土壤肥力，增加大豆产量。生物固氮研究工作一旦有新的突破，农业生产上就可能摆脱对氮肥的依赖并把产量提高到一个新水平。 欢下载

微生物与发酵工程

微生物与发酵工程 13101002 朱梦雪发酵工程是生物工程的重要组成部分,也是现代微生物学的核心内容;任何产品的发酵生产都必须通过微生物发酵或细胞扩大培养才能实现。因此,微生物与发酵是紧紧联系在一起的。微生物发酵工程是加快发酵工程研究成果转化为生产力,取得最佳效益的重要手段。微生物科学工作者应不失时机地积极而科学地运用这种手段为社会社会主义市场经济服务。 根据文献的调查，微生物的发酵工程主要应用于以下几点： 首先是在农业生产上，巴西全国土壤生物研究中心的研究人员发现一种新固氮菌,即固氮醋杆菌(Aeetobaeterdiazotrophyeus)。这是人类发现的第一个有固氮能力的醋杆菌,生活在甘蔗根部,具有很强的抗酸性。由于它的高效固氮能力,可使甘蔗年产量提高2倍(由60吨/公顷提高到180吨/公顷)。在固氮菌的研究方面,我国作物茎瘤固氮根瘤菌的高效固氮活性,以及小麦、玉米、陆生水稻固氮根瘤菌研究取得重要进展;英国诺丁汉大学一个研究小组也获得田著根瘤菌进入小麦、水稻、玉米和油菜等非豆科植物侧根中形成小根瘤,且有固氮作用的类似结果。今年拟在埃及、印度、墨西哥分别进行小麦、水稻、玉米的田间试验。这些非豆科专性共生固氮菌尚处在试验研究阶段。而我国联合固氮微生物早已产业化生产,其产品推广应用于农业生产实践,获得了增产的效果。近又发现一些新的联合固氮菌如产酸克氏杆菌、植皮克氏杆菌(Klebsiellaplantieola)等,为扩大联合固

氮菌AIJ新品种的研制做出了新贡献。 其次是在生物材料方面。有很多生物材料都是应用微生物发酵来生产的。我了解到的有生物可降塑料、建筑用生物材料和壳聚糖材料。 生物可降解塑料:微生物合成塑料物质:加拿大蒙特利尔生物技 术研究所以甲醇为原料利用从土壤中选育的嗜甲基细菌生产聚件轻 基丁酸(PHB),在我国,武汉大学生物工程研究中心用圆褐固氮菌发酵生产PHB;中国科学院微生物研究所用真养产碱杆菌生产PHB,在培养基中累积的量达细胞干重的63%(W/W);山东大学微生物研究所用该菌生产PHB的研究取得类似结果。 建筑用生物材料：某些微生物及其代谢产物如橡胶物质、弹力纤维、高分子多糖等作为混凝土添加剂,制造富有弹性的牢固的生物混凝土材料是有可能的,提供生物建筑材料的另一种可能性是某些微生物—蓝细菌或微型藻类,它们有分泌石灰石(碳酸钙)能力。 多用途的壳聚糖材料：壳聚糖又叫脱乙酞基多糖,用途极其广泛,几乎各个行业都用得着它。从微生物发酵生产,如真菌细胞壁含几丁质成分20%一22%,毛霉细胞壁中几丁质含量高达30写一40%,利用黑曲霉或其他真菌来生产壳聚糖是完全可能的。 还有就是利用微生物发酵生产两类重要有机酸这里着重介绍两 类重要有机酸,都有可能通过微生物发酵途径索取。 衣康酸(itaconicac记)进人规模生产:衣康酸又称甲叉丁二酸,系一种不饱和的二梭酸,用途广、需求量大,它是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、表面活性剂、去垢剂、润滑油添加剂等的原料,

四微生物与发酵工程能力测试题样本

四微生物与发酵工程能力测试题 考纲要求: ( 1) 微生物的类群 细菌、病毒的结构和繁殖 ( 2) 微生物的营养 微生物需要的营养物质及功能; 培养基的配制原则; 培养基的种类( 3) 微生物的代谢 微生物的代谢产物; 微生物代谢的调节; 微生物代谢的人工控制 ( 4) 微生物的生长 微生物群体的生长规律; 影响微生物生长的环境因素 ( 5) 发酵工程简介 应用发酵工程的生产实例; 发酵工程的概念和内容; 发酵工程的应用 一、选择题: ( 每个小题只有一个正确选项) 1．控制细菌合成抗生素的基因、控制放线菌主要性状的基因、控制病毒抗原特异性的基因依次在( ) ①拟核大型环状DNA上②质粒上③细胞染色体上④衣壳内的核酸上 A．①③④ B．①②④ C．②①③ D．②①④2、 3月24日是世界结核病防治日。下列关于结核杆菌的描述正确的是: ( ) A．高倍镜下可观察到该菌的遗传物质分布于细胞核内 B．该菌是好氧菌, 其生命活动所需要能量主要由线粒体提供 C．该菌感染机体后能快速繁殖, 表明其可抵抗溶酶体的消化降解

D．该菌的蛋白质在核糖体合成、内质网加工后由高尔基体分泌运输到相应部位 3、下列哪项是禽流感病毒和”SARS”病毒的共同特征( ) A．基本组成物质都有蛋白质和核酸 B．体内仅有核糖体一种细胞器 C．都能独立地进行各种生命活动 D．同时具备DNA和RNA两种核酸, 变异频率高 4、下列有关微生物营养物质的叙述中, 正确的是( ) A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源 B．凡是碳源都能提供能量C．除水以外的无机物仅提供无机盐 D．无机氮源也可提供能量 5、要从多种细菌中分离某种细菌, 培养基要用 ( ) A.加入青霉素的培养基 B．加入高浓度食盐的培养基 C．固体培养基 D．液体培养基 6、用蔗糖、奶粉和经蛋白酶水解后的玉米胚芽液, 经过乳酸菌发酵可生产新型酸奶, 下列相关叙述错误的是( ) A.蔗糖消耗量与乳酸生成量呈正相关 B.酸奶出现明显气泡说明有杂菌污染 C.应选择处于对数期的乳酸菌接种 D.只有奶粉为乳酸菌发酵提供氮源 7、下列所述环境条件下的微生物, 能正常生长繁殖的是( ) A．在缺乏生长素的无氮培养基中的圆褐固氮菌 B．在人体表皮擦伤部位的破伤风杆菌 C．在新配制的植物矿质营养液中的酵母菌

氮循环及生物固氮

氮素在自然界中有多种存在形式，其中，数量最多的是大气中的氮气，总量约3.9×10^15 t。除了少数原核生物以外，其他所有的生物都不能直接利用氮气。目前，陆地上生物体内储存的有机氮的总量达1.1×10^10～1.4×10^10 t。这部分氮素的数量尽管不算多，但是能够迅速地再循环，从而可以反复地供植物吸收利用。存在于土壤中的有机氮总量约为 3.0×10^11 t，这部分氮素可以逐年分解成无机态氮供植物吸收利用。海洋中的有机氮约为5.0×10^11 t，这部分氮素可以被海洋生物循环利用。 构成氮循环的主要环节是：生物体内有机氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用。 植物吸收土壤中的铵盐和硝酸盐，进而将这些无机氮同化成植物体内的蛋白质等有机氮。动物直接或间接以植物为食物，将植物体内的有机氮同化成动物体内的有机氮。这一过程叫做生物体内有机氮的合成。动植物的遗体、排出物和残落物中的有机氮被微生物分解后形成氨，这一过程叫做氨化作用。在有氧的条件下，土壤中的氨或铵盐在硝化细菌的 氮循环 作用下最终氧化成硝酸盐，这一过程叫做硝化作用。氨化作用和硝化作用产生的无机氮，都能被植物吸收利用。在氧气不足的条件下，土壤中的硝酸盐被反硝化细菌等多种微生物还原成亚硝酸盐，并且进一步还原成分子态氮，分子态氮则返回到大气中，这一过程叫做反硝化作用。 大气中的分子态氮被还原成氨，这一过程叫做固氮作用。没有固氮作用，大气中的分子态氮就不能被植物吸收利用。地球上固氮作用的途径有三种：生物固氮、工业固氮（用高温、高压和化学催化的方法，将氮转化成氨）和高能固氮（如闪电等高空瞬间放电所产生的高能，可以使空气中的氮与水中的氢结合，形成氨和硝酸，氨和硝酸则由雨水带到地面）。据科学家估算，每年生物固氮的总量占地球上固氮总量的90%左右，可见，生物固氮在地球的氮循环中具有十分重要的作用。

专题四微生物与发酵工程

专题四微生物与发酵工程 一、选择题 1、细菌培养过程中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法可依次用于杀灭哪些部位的杂菌 （） A、接种环、手、培养基 B、高压锅、手、接种环 C、培养基、手、接种环 D、接种环、手、培养基 2、下列关于发酵工程的说法，错误的是 （） A、发酵工程的产品是指微生物的代谢产物和菌体本身 B、可通过人工诱变选育新品种 C、培养基、发酵设备和菌种必须经过严格的灭菌 D、环境条件的变化，不仅会影响菌种的生长繁殖，而且会影响菌体代谢产物的形 成 3、下列措施中能把微生物生长的调整期缩短的是 （） A、接种多种细菌 B、增加培养基的量 C、加大接种的量 D、选用孢子接种 4、下列有关微生物营养物质的叙述中，正确的是 （） A、是碳源的物质不可能同时是氮源 B、凡是碳源都能提供能量 C、有些含氮的无机盐可以是生长因子 D、有些无机氮源也能提供能量 5、科学家通过对黄色短杆菌进行诱变处理，选育了不能合成高丝氨酸脱氢酶的菌种， 从而达到了让黄色短杆菌大量积累赖氨酸的目的，这种人工控制的方法实质上利用了以下哪种调节方式？ （） A、酶合成的调节 B、酶活性的调节 C、二者都有 D、二者都无 6、关于微生物代谢调节说法正确的是 （） A、乳糖诱导大肠杆菌合成分解乳糖的酶属于酶活性的调节 B、酶活性调节是一种快速、精细的调节方式

C、酶合成调节与酶活性调节不是同时存在的 D、微生物的代谢产物与酶结合不会改变酶的结构 7、在培养酵母菌时，培养基中加入什么样的特殊物质，以保证抑制其他杂菌的繁殖（） A、生长因子 B、食盐 C、高浓度蔗糖溶液 D、青霉素 8、分离提纯是制取发酵产品不可缺少的阶段，产品不同，分离提纯的方法不同，对 产品的代谢产物常采用的提取方法是 （） ①蒸馏②萃取③过滤④离子交换⑤沉淀 A、①③⑤ B、①②④ C、①②③ D、③④⑤ 9、下列有关发酵罐中谷氨酸发酵的叙述中，正确的是 （） A、发酵中不断通入纯氧气 B、搅拌的目的只是使空气形成细小气泡，增加培养基中的溶氧量 C、冷却水可使酶的活性下降 D、若培养条件不当就不能得到所需产品 10、发酵工程中培育优良品种的方法有多种，其中能定向培育新品种的方法是（） ①人工诱变②基因移植③细胞杂交 A、① B、①② C、②③ D、①②③ 11、人们常用大肠杆菌作为判断自来水是否被粪便污染的指示菌，我国规定1000mL 自来水中的大肠杆菌数不得超过 （） A、1个 B、3个 C、5个 D、10个 12、下面的资料表明在各种培养基中细菌的生长（S、C、M为简单培养基，U、V、X、Y、Z代表加入培养基的不同物质），问细菌不能合成哪一种物质？（“+”表示生长良好，“－”表示生长不好）

高三生物微生物与发酵工程专题复习

高三生物微生物与发酵工程专题复习【知识框架】 【经典例题】 【例题1】为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制如下培养基 （1）该培养基所含的碳源有，其功能是。 （2）该培养基所含的氮源有，其功能是。 （3）该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质是。（4）该细菌在同化作用上的代谢类型是。

（5）该培养基可用来鉴别哪种细菌（） A.霉菌 B.酵母菌 C.大肠杆菌 D.乳酸菌 【思路分析】对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源，因此蛋白胨既作碳 源又可作氮源。该培养基不需补充生长因子。各类微生物繁殖的最适pH是不同的，大多数细菌、放线菌 适宜在中性至微碱性（pH为7～7.5）中生长，而酵母菌和霉菌则适宜在偏酸性（pH为4.5～6.0）中生 长，在配制培养基时应注意这条原则。 【规范解答】（1）乳糖、蔗糖、蛋白胨，主要用于构成微生物的细胞物质和代谢产物。 （2）蛋白胨主要用于合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物。（3）水、无机盐（或K2HPO4） （4）异养（5）C 【反思点拨】该题主要考查了微生物需要的营养及功能、培养基的种类、配制原则。解此题时要注 意自养和异养微生物在新陈代谢类型上的异同、在营养物质需求上的异同。配制培养基时要综合考虑这 些因素。 【例题2】下面是最早发现抗生素——青霉素的弗莱明先生所进行的探索过程。 提出问题：培养细菌的培养基中，偶然生出青霉菌，在其周围的细菌生长就会受到抑制，为什么会 出现这种现象？ 进行实验：把青霉菌放在培养液中培养后，观察这些培养液对细菌生长的影响。 结果：培养液阻止了细菌的生长和繁殖。 结论：青霉素可产生一种阻止细菌繁殖的物质。 弗莱明在持续的研究中分离出了一种物质，分析出它的特征并将之命名为青霉素。 根据上述探索过程，请回答下列问题： （1）作为这一实验的假设，下列最为恰当的是（） A.青霉素能产生有利于人类的物质 B.青霉菌污染了细菌生长的培养基 C.青霉菌可能产生了有利于细菌繁殖的物质 D.青霉菌可能产生了不利于细菌繁殖的物质 （2）青霉菌和细菌的关系是( ) A.共生 B.竞争 C.捕食 D.寄生 （3）为了证明青霉素确实是由青霉菌产生的而不是培养液和培养基中产生的，则应进一步设计 实验，其实验方法是：。若实验结果为：， 则能充分证明青霉菌确实能产生可阻止细菌繁殖的青霉素。 【思路分析】本题在认真分析实验过程的基础上结合生态学的知识解题是不难的。 （1）青霉菌可产生青霉素，青霉素是抗生素可杀菌。 （2）在同一培养基中青霉菌和细菌为了营养和空间将发生竞争。 （3）在设计实验时为了使结果真实可靠必须只有一个变量，同时应设计对照组。 【规范解答】（1）D (2)B (3)对照配制成分相同的培养基，不加入青霉菌，观察细菌的生长和 繁殖情况细菌正常生长 【反思点拨】本题重点考查的是与实验有关的知识。正确解答此题要复习与对照实验有关的知识： 如何提出假设、如何设计实验、如何设计对照组等。

发酵工程教学大纲

楚雄师范学院化学与生命科学系 生物技术专业《发酵工程》（理论）课程教学大纲 一、课程基本信息 课程代码：031106009 课程中文名称：发酵工程 课程英文名称：Fermentation Engineering 课程性质：共同学科课程选修 使用专业：生物技术、葡萄酒专业 开课学期：第6学期 总学时：36 总学分：2 预修课程：无机及分机化学、有机化学、微生物、分子生物学、生物化学 课程简介：本课程是生物技术专业的必修课。课程系统讲授发酵工程基本概念、基本理论和分析方法，主要内容包括：工业微生物菌种选育、工业发酵培养基设计、发酵工业无菌技术、种子扩大培养、发酵动力学、氧的供需、发酵生理及其过程控制、发酵罐的放大与设计、基因工程菌发酵、发酵产品的提取与精制、发酵工业清洁生产、发酵工厂设计、发酵经济学、发酵产品生产原理与技术应用，以及发酵工程在现代生物化工中的应用等方面。 教材建议：余龙江，《发酵工程原理与技术应用》，北京，化学工业出版社，2006年。 参考书：李艳主编，《发酵工程原理与技术》，高等教育出版社，2007年。 李艳，《发酵工业概论》，中国轻工业出版社，2002年。 姚汝华，《微生物工程工艺原理》，华南理工大学出版社，2005年。 熊宗贵，《发酵工艺原理》，中国医药科技出版社，2000年。 毛忠贵，《生物工业下游技术》，中国轻工业出版社，2002年。 梅乐和等，《生化生产工艺学》，科学出版社，2007年。 俞俊棠等，《生物工艺学》，华东化工大学出版社，1992年。 贺小贤，《生物工艺原理》，化学工业出版社，2003年。 二、课程性质、目的及总体教学要求 课程的基本特性：发酵工程具有涉及领域宽、涵盖范围广、基础性强的特点，就其学科性质而言它又是一门实践性较强的学科。通过本课程的学习，使学生在微生物学、生物化学等课程的基础上，系统的掌握发酵工程的基本理论、基本知识和基本技能，建立较深刻的微生物学观点，形成科学的思维方式。同时要求学生能了解现代发酵工程理论和技术的新发展。

高三生物复习 第41讲 生物固氮

第六部分 生物技术与生命科学新进展 第41讲 生物固氮 一、考点内容全解 （一）本讲考点是什么 2.生物固氮 3.氮的循环 （二）考点例析 [例1]自生和共生固氮微生物可以将 （ ） A ．大气中的N 2转化为NH 3 B ．大气中的N 2转化为NO 3－ C ．土壤中的NH 3转化为NO 3－ D ．土壤中的NO 3－转化为N 2 [解析]本题考查生物固氮的基本概念。生物固氮是指固氮微生物将大气中的氮还原成氨的过程，固氮微生物包括共生固氮微生物和自生固氮微生物两种类型，在固氮酶的催化下，它们均能将大气中的分子态的N 2转化为化合态的NH 3。 [答案]A [例2]固氮酶具有底物多样性的特点，所有的固氮酶除了能催化N 2→NH 3的反应外还能催化： ①NO 2→N2+H 2O ②N 3→N 2+ NH 3 ③C 2H 2→C 2H 4 ④2H +→H 2 请结合上面的生物固氮原理示意图，回答： (1)生物固氮需要的条件有 (2)试概括出生物固氮的反应式： 固氮酶

[解析]不同固氮微生物的固氮催化作用情况基本相同：需要N 2为原料，需要e 、H ＋ ，以及ATP 提供能量来源，还需要固氮酶作为该反应的催化剂。主要产物为NH 3。 [答案](1) N 2、e 、H ＋、ATP 和酶 (2) N 2＋e → NH 3 ＋ADP ＋Pi [同类变式]微生物固氮的反应要求钼铁蛋白和铁蛋白的存在，工业合成氨，也是用含铁的钼盐作催化剂的。下列叙述最能体现这两种固氮方式的区别 （ ） A ．生物固氮是酶促反应，工业固氮是氧化还原反应 B ．固氮微生物为固氮酶的载体 C ．生物固氮与微生物固氮没有本质区别 D ．生物固氮的产物是有机物 [解析]本题主要变化是考查对生物固氮本质的认识。生物固氮是固氮微生物特有的一种 才具有固氮的作用。即： 所以，与工业上从空气中取氮以制造氨，也用含铁的钼盐作催化剂不同的是：在生物体内，含钼和铁的催化剂都是酶蛋白。 [答案]B [解题警示]生物固氮也是氧化还原反应，所以选项A 不能体现这两种固氮方式的本质区别。 [例3] 右图是自然界中的氮以蛋白质的形式在生物体内转化的部分过程示意图。请回答： (1)自然界中将NH 3转化成N03－的生物叫 ，该种生物的同化方式主要通过 作用来完成；自然界 中将NH 3转化成N 2的生物的新陈代谢类型是 。 (2)植物的根从土壤中吸收N03－是通过 完成的，吸收的N03－与有机物合成为植物蛋白质。 (3)图中①、②、酶和血浆蛋白虽都为蛋白质，但功能各 不相同，从分子结构上看，直接原因是 ；而由于血红蛋白质异常的镰刀型细胞贫血症的根本原因是 。 (4)过程⑤是 ；过程⑥是 ；细胞中⑦的合成场所是 ；不含氮部分彻底氧化的场所是 。 [解析]本题以生物体蛋白质代谢为问题切入点，考查氮循环的全过程。构成氮循环的主要环节是：生物体内有机氮的合成（植物吸收土壤中的铵盐和硝酸盐，进而将这些无机氮同化成植物体内的蛋白质等有机氮；动物直接或间接以植物为食物，将植物体内的有机氮同化成动物体内的有机氮）、氨化作用（动植物的遗体、排出物和残落物中的有机氮被微生物分解后形成氨）、硝化作用（在有氧的条件下，土壤中的氨或铵盐在硝化细菌的作用下最终氧化成硝酸盐）、反硝化作用（在氧气不足的条件下，土壤中的硝酸盐被反硝化细菌等多种微生物还原成亚硝酸盐，并且进一步还原成分子态氮，分子态氮则返回到大气中）和固氮作用（大气N 2 6H 2NH

考点18 微生物与发酵工程

温馨提示： 此题库为Word版，请按住Ctrl,滑动鼠标滚轴，调节合适的观看比例，点击右上角的关闭按钮可返回目录。 考点18 微生物与发酵工程 一、选择题 1.(2011·四川高考)下列关于微生物生长曲线的叙述，不正确的是( ) A.在相同培养条件下接种对数期的菌种，调整期将缩短 B.进入对数期的微生物代谢旺盛，形态和生理特性比较稳定 C.进入稳定期后不再产生新细胞，活细胞数目维持相对恒定 D.进入衰亡期后部分细胞解体，可释放出抗生素等代谢产物 【解析】选C。A项，对数期的菌种细胞代谢能力最强，分裂能力强，增长速度快，此时接种，调整期将缩短；B项，对数期的微生物菌体以等比数列形式增加，增长速度快，细胞代谢能力最强，细菌很少死亡或不死亡，微生物内部各成分最为均匀，形态和生理特性比较稳定；C项，进入稳定期后生长速率下降，死亡率上升，细胞数目达到最大值，新生的细胞数和死亡的细胞数相当；D项，进入衰亡期后部分细胞解体，可释放一些对人类有用的抗生素等次级代谢产物。 2.(2011·重庆高考)下列有关细菌培养的叙述，正确的是( ) A.在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌 B.在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长 C.向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长 D.在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动 【解析】选D。A项，在琼脂固体培养基上长出的单个菌落是由一种细菌增殖而

来的；B项，青霉素能破坏细菌等原核生物的细胞壁而抑制细菌的增殖，对真菌没有明显作用；C项，破伤风杆菌是厌氧菌，通入氧气会抑制其生长；D项，半固体培养基中可以观察细菌的运动。 二、非选择题 3．(2011·全国卷) 某同学从温度为55℃～65℃的泉水中筛选出能合成脂肪酶的细菌，并从该细菌中提取了脂肪酶。回答问题： (1)测定脂肪酶活性时，应选择作为该酶作用的物质，反应液中应加入溶液以维持其酸碱度稳定。 (2)要鉴定该酶的化学本质，可将该酶液与双缩脲试剂混合，若反应液呈紫色，则该酶的化学本质为。 (3)根据该细菌的生活环境，简要写出测定该酶催化作用最适温度的实验思路。【解析】本题考查酶催化反应的特点和颜色反应的应用以及依据对照和单因子变量原则进行实验设计的能力。(1)测定脂肪酶的活性，应该让脂肪酶去催化脂肪水解，通过测定反应速率的快慢表示酶活性的高低；为了防止外界因素(如pH)的变化对实验结果的影响，应该在反应液中加入含有缓冲对的缓冲溶液。(2)蛋白质可与双缩脲试剂反应呈紫色。(3)本实验的自变量是温度，围绕着该细菌的生活环境的温度(55℃～65℃)设置一系列的温度梯度(如50℃、55℃、60℃、65℃、70℃等)，分别测定酶活性。酶活性最高时所对应的温度是最适温度。答案：(1)脂肪缓冲 (2)蛋白质 (3)在一定的温度范围(包括55℃～65℃)内设置温度梯度，分别测定酶活性。若所测得的数据出现峰值，则峰值所对应的温度即为该酶催化作用的最适温度。否则，扩大温度范围继续实验，直至出现峰值为止。

生物固氮的研究现状初探

收稿日期：2008-10-18 作者简介：黎林（1980-），男，广西岑溪人，韶关学院生物科学系助教，硕士研究生，主要从事蔬菜分子生物学方面的研究. 摘要：初步探索了生物固氮目前的研究进展，并着重研究了豆科植物根毛与根瘤菌接触到最后形成成熟的可以固氮的根瘤组织的途径，为将来把非豆科植物，特别是禾谷类农作物转变为固氮植物的可行性提供参考. 关键词：生物固氮;根瘤菌;结瘤基因 中图分类号：Q939.11+4文献标识码：A 文章编号：1007-5348（2009）03-0088-04 韶关学院学报·自然科学Journal of Shaoguan University ·Natural Science 2009年3月 第30卷第3期Mar.2009Vol.30No.3 从1862年发现生物固氮现象到目前为止，生物固氮的研究已经有一百四十多年了.期间的研究领域涉及到形态结构、细胞水平、分子水平及遗传等诸多领域.近20年来,随着分子生物学的迅速发展，生物固氮研究在国际上已取得显著进展. 我国在生物固氮研究领域起步较晚.但是近年来,我国科学家在生物固氮领域不断传出好消息.在固氮菌的分类、生物学特性、固氮机理等方面取得了一定的进展.聂延富［1］利用植物生长素2,4-D 处理根系,诱导根瘤菌侵入小麦根部形根瘤的试验获得了成功.1985年,谢应先［2］等采用聚乙酶融合原生质体的方法,将具有光合固氮能力的一种蓝藻引入到烟草、玉米、水稻和小麦白化苗原生质体内等等. 1生物固氮 1.1生物固氮及其分类空气主要由氧气和氮气组成，其中氮气约占4/5.在自然界的千万种生物中，有一些生物能够直接吸收空气中的氮素作为养料，它们将分子态氮先还原成氨，再转化为氨基酸和蛋白质，这就叫生物固氮. 豆科植物等，其根部长有许多小球，它是由根瘤菌共生形成的根瘤，就具有固氮作用；又如稻田中的水生蕨类植物满江红(俗称红萍)，由于叶腔中有固氮鱼腥藻共生而能吸收和利用大气中的氮；以上两种形式称为共生生物固氮.生物固氮的形式除共生生物固氮外，还有细菌自生固氮和联合固氮.联合固氮（又称为半共生固氮）它又分为内生联合固氮和外部联合固氮.目前已发现有固氮能力的微生物有60多属约数百种，包括细菌、放线菌、蓝绿藻等. 1.2根瘤菌固氮在生物固氮中的位置以及研究现状 现在已知的能够固氮的生物存在于100多个属的细菌和古菌中［3,4］,有好氧和厌氧的固氮菌、蓝细菌、与豆科植物共生的根瘤菌和与非豆科木本植物共生的放线菌等等,其中以根瘤菌豆科植物共生体系固氮能力最强(见表1).这些固氮生物在地球表面氮生态中起着非常重要的作用.据估计,当今由生物固定的氮已达2.0亿t/a ,占地表化合态氮的65%～70%,而根瘤菌豆科植物共生体固定的氮又占生物固氮量的65%以上.根瘤菌固氮指的是根瘤菌属（Rhizobium ）的细菌，与豆科植物建立共生关系，它侵染豆科植物的根部，形成一种具有复杂结构和高度分化的特殊的植物器官———根瘤，在根瘤提供的厌氧环境中将分子态氮还原生物固氮的研究现状初探 黎林1，2 （1.西南大学园艺园林学院重庆400716；2.韶关学院生物科学系，广东韶关512005）

生物技术发酵工程实验方案

产蛋白酶菌种的分离筛选及发酵 一、实验流程 二、实验安排 1、2班分为2大组，分别进行平行实验。由各组自行安排实验时间，其中13、14、15三周在指定时间集中实验。几个重要时间节点为：10周正式进入实验程序；第13周获得目标菌株1株；14周完成种子的摇瓶培养；15周分别完成上罐发酵；16周实验收尾工作。 三、发酵工程实验日程表

实验一产蛋白酶微生物菌株的分离 【实验材料】 1、采样样品 食堂泔脚等残存蛋白质丰富的环境周围的土壤或其它蛋白质腐败材料。 2、培养基 （1）增殖培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa，灭菌20min。 （2）分离纯化培养基：酪蛋白10 g/L，Na2HPO4 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH4Cl 1 g/L，FeSO4 0.025 g/L，酵母膏0.2 g/L，MgSO4 0.24 g/L，CaCl2 0.011 g/L，溴百里香酚兰0.05 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa，灭菌20min。 （3）菌种保存培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L， NaCl 5g/L，琼脂 20g/L，pH 7.0～7.2，0.1MPa, 灭菌20min。 （4）无菌水：90 mL无菌水/250 mL三角瓶; 9 mL无菌水/试管6支。 3、实验器材 刮铲、一次性手套、无菌小塑料袋、试管、三角瓶、培养皿、吸管、接种环和涂布棒等。 4、实验设备 涡旋振荡器、超净工作台、高压灭菌锅、振荡培养箱、恒温培养箱、（数码）显微镜。【实验步骤】 1、采样 分别取食堂泔脚池周边土壤，腐烂基质或其它可能含有蛋白酶生产菌的生物制剂10g 装入无菌小塑料袋，在超净工作台上将样品混合均匀从中称取1g作为待增殖的采样样品。 2、增殖培养 1g待增殖的采样样品加入50 mL增殖培养基/250 mL三角瓶中，涡旋振荡器上振荡