细菌生物被膜
细菌生物被膜（或称细菌生物膜Bacterial biofilm，BF），根据《Annu Rev Microbiol》等权威期刊所归纳发表的定义，生物薄膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。多糖基质通常是指多糖蛋白复合物，也包括由周边沉淀的有机物和无生物被膜是微生物为适应自然环境而形成的。例如：河流中的微生物就能吸附在岩石表面，这种吸附作用更有利于自身的生存。对于细菌来说，它可以分泌多糖蛋白复合物(glycocalyx)将自身粘附于各种物体的表面，细菌在所吸附的物体表面不断分裂就形成了细菌生物被膜。使病原菌可以在体内插管表面及粘膜表面形成生物被膜［1］。
三、细菌生物被膜的致病特点
一般来说细菌生物被膜导致的难治性细菌感染性疾病有以下特点：
1.病灶局部的炎症反应不很强烈，感染有相互转化的静止期和发作期；
2.抗菌药物治疗起初可能有效，但以后治疗常常失败；
3.致病菌主要是来自皮肤和周围环境中的致病菌如铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌［1］。
铜绿假单胞菌是慢性呼吸道感染的重要致病菌之一，它的粘液型菌株可以产生藻酸盐，而非粘液型菌株可以产生其它种类的多糖蛋白复合物形成细菌生物被膜。比较典型的病例是肺囊性纤维化合并肺部感染，虽然抗菌药物有一定的临床疗效，但是铜绿假单胞菌总是难以彻底清除，电镜观察可见病变部位有细菌生物被膜形成。其中藻酸盐是重要的组成成分，它可以使细菌牢固地粘附于肺上皮表面形成生物被膜，一方面可以抵御单核-巨噬细胞的吞噬作用，另一方面可以抵制抗菌药物的杀灭作用。进一步的研究表明，铜绿假单胞菌藻酸盐的合成是由细菌alC和alD基因控制的。有实验表明，铜绿假单胞菌和硅胶膜表面接触后，可以激活控制藻酸盐合成的基因组，促使细菌合成大量的藻酸盐。所以细菌生物被膜的形成是受严密的基因调控的［12］。
1、生物膜的研究历史：
1676 年Antony用自制的显微镜从牙菌斑中观察到了微生物的存在,为生物膜的研究奠定了基础。Bayston 和Penny (1972年) 首先认识到表皮葡萄球菌生物膜形成与其在多聚物表面定植有关。后来,通过扫描电镜发现葡萄球菌在导管表面定植,多层细菌嵌于多糖-蛋白复合物(Glycocalyx) 中形成生物膜。1978 年Costerton 首先开始了对细菌生物膜的研究并提出生物膜理论。生物膜研究涉及微生物学、免疫学、分子生物学、材料科学和数学等多学科,其真正作为一个独立学科发展起来始于20 世纪70 年代末。90 年代后,随着相关学科的发
展及对BF 细菌在医学上重要性的认识,BF研究得到迅速发展。1990年,蒙大拿州立大学建立了世界上第一个生物膜工程中心。
2、生物膜的成份
生物膜中水份含量可高达97 % ,除了水和细菌外,生物膜还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。因此, 生物膜中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂和磷脂等物质
3、生物膜的特性
BF是细菌在表面生活时采取的一种生长方式，它是细菌的一种本能，任何细菌均能形成BF。但当细菌发生遗传改变时，则可影响其形成BF的能力。具体到某一菌株能否形成BF，是与其所处的环境密切相关的，如环境中的营养成分、温度、渗透压、pH、铁离子浓度和氧化还原电位等因素，其中，营养成分对BF的形成具有重要作用。此外，BF可由纯菌种形成，也可以由多菌种组成。
细菌的生物膜与浮游细胞在生长过程中具有本质的区别，在细菌的生物膜的不同区域，细菌的生理状态和基因表达不同，并且生物膜可以形成运输营养和代谢产物的孔道，细菌生物膜的这种复杂的结构和代谢方式与高等生物的组织相似。
4、生物膜形成过程
细菌生物膜的形成需要胞间信号的相互传递和一系列有别于游走态细胞的遗传物质的活动。首先,游动细胞接受环境中的营养信号,通过鞭毛或纤毛等附着结构粘附于表面;附着于表面后,进行生长、分裂、繁殖,同时其他游走细胞继续附着,最终导致该附着位点的细菌生长环境极度拥挤,有毒代谢产物积累,许多细菌得不到营养物质;在这种竞争压力下,细菌启动胞间信号系统,产生胞间信号;在胞间信号系统的调节下,细菌一边分泌胞外多糖,一边从附着的表面轻轻移动,最后形成蘑菇样或柱样亚单位,多个单位形成具有三维立体结构的成熟细
菌生物膜。当生物膜内环境不适应时,细菌可分泌胞外水解酶水解胞外多糖,膜内细菌脱离( detached) 生物膜,成为游走态细胞。脱离生物膜的游走细胞继续粘附、生长、分裂、分化,形成生物膜。形成游走细胞—细菌生物膜—游走细胞—细菌生物膜的循环往复。
5、生物膜内细菌的分布及信号传导
生物膜内细菌分布并不是简单杂乱无章的。电子显微镜、激光共聚焦显微镜( scanning confocal laser microscopy) 、荧光探针、报告基因技术( reporter gene technology) 等观察分析研究发现,生物膜内环境是不一致的, 通常越接近基质, 氧的浓度和pH 值越低。在同种细菌组成的生物膜内,细菌通过调整
基因的表达来达到最大限度地适应其生存的特殊环境。在自然条件下所形成的多菌混合型生物膜内,细菌除调整自身以适应所处的生物膜微环境外,还要根据种间的共生关系调整自身,以使其达到最适生存条件。因此,无论是单菌种还是多菌种组成的生物膜内,细菌都不是随机分布的,而是按各自的最适生存需求所组成。只有在生物膜表面的细菌才具有旺盛代谢活动,接近基质的细菌处于缓慢生长或不生长状态。在生物膜内,细菌之间通过细菌的产物来实现信息传递。高丝氨酸内酯是已被证实了的在天然或培养条件下,生物膜内细胞间的信号传递分子。在单菌种组成的生物膜中,高丝氨酸内酯在形成和维持生物膜的三维空间结构中起着关键作用,不产高丝氨酸内酯的缺陷型菌株紧紧包裹在一起的细胞,极易被十二烷基硫酸钠所破坏。Davies 等研究证实,铜绿假单胞菌生物膜形成过程中,细胞间信号传导系统(LasR～LasI 信号系统) 起着关键作用。该系统能自身调节且
高度感应和应答(quorum sensing and response) 。lasI基因的产物调节弥散性胞外信号物质32氧十二酰-L-高丝氨酸内酯(3OC1-2HSL) 的合成,3OC1-2SHL 积累到一定量即启动lasR 基因, lasR 基因产物是转录调节因子, 该因子反过来促进lasI 基因表达
3OC1-2HSL 。发生LasR～LasI 信号系统突变的铜绿假单胞
菌,仍可产生相同量的胞外多糖,可粘附和繁殖,但不能形成成熟生物膜的复杂结构。这说明LasR～LasI系统主要参与细菌生物膜的分化,可以肯定,还有其他胞间信号参与了生物膜的形成。多菌组成的生物膜胞间信号的作用知道不多,但它与在单菌组成的生物膜的情况有明显差异。信号分子对细菌定植在已形成菌落或定植在竞争十分剧烈的环境表面起着十分重要的作用。这些信号分子包括细菌代谢产物如细菌素、高丝氨酸内酯、分泌蛋白,甚至于包括RNA 和DNA 在内的遗传物质和还未被发现的细菌产物。这些信号分子可以改变生物膜内的种群分布,改变相邻细胞蛋白的表达,将某些遗传特性(如抗药性) 传递给邻近细胞。因此,在多菌组成生物膜内,细胞间的信号传递对于膜内细菌的定植和分布起着关键作用。生物膜内细菌分裂受到周围多糖的限制。在一个成熟的生物膜内,细胞很少发生分裂,大部分能量用于合成胞外多糖。当细菌处于饥饿或其他不利条件下,细菌能分泌胞外多糖水解酶,将胞外多糖水解,从生物膜内游离出来,寻求更适宜的生存环境。
6、细菌生物膜相关感染
近年来,随着抗菌药物不断问世,感染性疾病的防治有了很大的改善,然而一些难治性感染,即使使用药敏试验确定有效的抗生素,短暂临床缓解,但感染反复
恶化。此外,随着现代医学高科技的发展,新型生物材料的应用日益增多,生物材料相关感染发生逐年上升。根据流行病学调查,导尿管相关泌尿系统感染发生率
为92 %～93 % ,约占院内感染的40 %;心脏外科生物材料植入术合并感染发生率为
3313 %;99 %的机械通气患者气管插管处有细菌定植并反复发生感染;大静脉导管,伤口引流管,人工关节置入等相关感染的发生率也很高。Rontery 总结了生物医学材料与生物膜相关感染的细菌,主要包括革兰氏阳性的肠球菌、葡萄球菌、链球菌和革兰氏阴性的大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形菌和铜绿假单胞菌等。近年来大量的研究证实,人类的许多慢性和难治性感染如慢性呼吸道感染、慢性泌尿系统感染、骨髓炎、心内膜炎、中耳炎、前列腺
炎、牙周炎以及某些肾结石的形成等大都与细菌生物膜有关,据美国疾病预防与控制中心(CDC)专家估计, 65 %以上的人类细菌感染与生物膜有关。
6、细菌生物膜耐药
某些与生物膜相关的感染性疾病生物膜内的细菌表现出的这种极强耐药性的机制目前还不十分清楚,有渗透限制(penet ration limitation) 、营养限制( nutrient limitation) 和表型(phenotype) 推断三种学说。渗透限制学说认为,生物膜内的细菌对抗菌剂的不敏感性是由于生物膜内细菌分泌的胞外多聚物被膜所形成的屏障,阻止了抗生素的穿入。这一假说被许多研究者所接受,并被一些研究所证实。但正如Stewart 所指出,对多数抗生素来说,渗透限制还不足以解释生物膜内细菌的耐药性。营养限制学说认为,生物膜内细胞,至少是部分细胞,由于受到营养供给的限制,处于缓慢生长或饥饿状态,这种状态的细胞对抗生素不敏感,或者使对只杀伤处于分裂状态的细胞的抗生素难以发挥作用。研究表明,生物膜内细胞的确存在明显的空间不均一性( spatial heterogeneity) ,只有位于生物膜顶部的细胞具有代谢活性。但Karen 认为,该假说还不能对生物膜引起的顽固性难治感染做出满意的解释,如果该假说成立,那末生物膜顶部具有代谢活性的细胞就能被杀菌剂所杀死,之后,原来位于次层的受到营养限制处于缓慢生长或不生长的细胞,就成为生物膜顶部细胞,重新具有代谢活性,可被杀菌剂杀死。这样生物膜内层细胞就会逐步被消灭,最终细胞全部被消灭,生物膜消失。显然,这与实际情况不符。表型推断学说认为,细菌生物膜表现出的抗药性可能是生物膜内细胞,至少某些细胞采用一种与游走态细胞不同的有保护作用的生物膜表型( a distinct and protected biofilm phenotype) ,这种表型不是对营养限制的一种反应,而是细菌附着在表面的一种生物学反应,细菌的一些新基因表达产物对生物膜的抗药性起着关键作用。表型推断学说从基因一表型角度来解释其抗药性,涉及到细菌生物膜抗药性的实质,并被一定的试验所证实。此外,在生物膜这种非常有利的内环境中,可以加速遗传物质在细胞间的平行转移,
可使某些细菌获得耐药性、毒力因子和环境生存的能力,成为新的病原菌。对于细菌已形成稳态的生物膜,则需用能透过生物膜的抗菌药物来治疗。一些专家认为,必须研制针对细菌生物膜特异性的抗生素,目前已发现了一种新的氟喹诺酮抗生素,它能破坏导尿管上的细菌生物膜,消灭细菌。此外,联合应用利福平和米诺环素处理导管,可使导管的污染从30 %下降到9 % ,感染从4 %下降到0 。氟喹诺酮类药物可以穿透胞外多糖,对生长缓慢的细菌有一定的杀菌作用,但不能完全消除生物膜内细菌。大环内酯类药物与氟喹诺酮类药物联合应用可抑制导管表面生物膜内的细菌。从而提高氟喹诺酮类药物对生物膜内细菌的活性。在近期研究表明,哌拉西林与妥布霉素或亚胺培南与环丙沙星联合用药,对已形成稳态生物膜的铜绿假单胞菌有一定疗效。
7、细菌生物膜感染对患者的免疫损害
藻酸盐具有抗原性,能刺激机体产生抗体。支气管扩张症及DPB (弥漫性泛细支气管炎) 的患者中,血清抗藻酸盐抗体明显增高, 尤其是痰菌阳性患者的抗体增高水平更为明显。这种抗原抗体反应究竟对机体有害还是有益, 最初尚不清楚。现在已证明这是一种对机体有害的免疫反应。在此仅举一动物实验为例对其免疫病理详细说明。小鼠经藻酸盐免疫后, 用易形成菌膜的粘液型绿脓杆菌喷雾感染(其他菌种也可) , 1 至2 日后,可见小鼠气管周围的淋巴细胞明显聚集, 这是藻酸盐介导的抗原- 抗体反应的肺组织变化。当然这并不是藻酸盐引起的特异性的肺组织变化, 免疫性的肺疾患, 如过敏性肺炎、衣原体肺炎、由某些药物导致的药物性肺炎等, 均呈相同的病理变化。菌膜病的特征是抗原过剩。若给小鼠反复绿脓杆菌喷雾感染, 肺组织中可见肉芽及淋巴滤泡, 坚硬的结节使末梢气道闭锁, 气道内腔聚集大量的中性白细胞, 这已是非可逆性的病理改变,病态在恶化,因此我们说由藻酸盐引起的免疫反应是有害的变态反应。由于抗原—藻酸盐过剩,形成免疫复合物,更重要的是,藻酸盐形成的免疫复合物与症状有关。免疫复合物量多的患者,症状非常严重,量少的患者, 疾病处于
静止状态。研究曾经一直认为慢性支气管炎等疾患其症状与细菌有关,实际上,已证明这些疾病的症状与免疫复合物的相关性更强。免疫复合物可沉着于肺组织, 使肺组织破坏。其机制是: 免疫复合物FC 端与中性白细胞结合,使白细胞溶解,其释放物质造成肺组织破坏。现以呼吸道菌膜病为例进一步加以说明: 呼吸道的菌膜疾病的元凶常常是粘液型细菌, 粘液性细菌产生的藻酸盐使细菌形成菌膜在机体局部长期滞留, 这种情况在MRSA感染时常有发生。机体对菌膜的主要成分—藻酸盐产生抗体,引起抗原抗体反应,这种反应反复进行。同时, 抗原过剩形成免疫复合物, 沉积于肺组织, 使中性白细胞趋化聚集, 并与免疫复合物的FC 端结合,白细胞溶解,其各种释放物质溶解破坏肺组织。由此可见,慢性感染决非急性感染的反复,慢性感染有其特征性的病态。同样被我们称之为慢性感染的疾患中, 有郭霍氏三原则无法解释的病例。有趣的是从内科医师的立场来看,迄今为止,病因不明的一些疾患如胶原病、结节病、衣原体性动脉硬化症、传染性神经变性疾患等均有可能与病理过程有关
8、展望
与生物膜相关的细菌感染性疾病的防治是临床上亟待解决的问题之一。人类对单一细菌所引起的感染的研究已经很深入,但对细菌生物膜的了解才刚刚开始,还有许多有关细菌生物膜的基础问题有待解决,尤其需要弄清楚细菌生物膜形成的遗传物质基础及细菌生物膜的耐药机制,寻找其薄弱环节,以便研究出更好
的目前又迫切需要的处理方法。近年来的研究表明,由于细菌生物膜的信号传递系统对生物膜的形成和生物膜结构的稳定起着关键性作用,该信号传递系统被
认为是消灭细菌生物膜最有希望的突破口。
众所周知，铜绿假单胞菌(pseudomonas aerugino sa，PA)的慢性肺部感染是一种最难治疗的感染。它与机体的免疫功能和呼吸道的局部防御功能低下、病原菌对抗菌药的耐药以及细菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)的形成有关。目前的研究认为，PA生物被膜的形成是难治性肺部感染的重要原因，死后肺组织的电子显微分析亦显示PA在患者的肺部形成微菌落。因此，有的学者提出了“呼
吸道生物被膜病(biofilm disease)”概念［1，2］。本文拟就该病有关方面作一综述。
1 细菌生物被膜
BF是指细菌吸附于生物材料或机体腔道表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等，包绕其中形成的膜样物，主要由细菌、高水化的多阴离子基质及被俘获的体外的大分子组成。应用扫描同聚焦激光显微技术观察活的生物被膜，证实了这一点，其中细菌占这些附着结构5%～35%的空间。体外常规培养下细菌生物被膜会消失，电镜标本制作过程又易使这些含水的多糖基质被压缩，故很长时间未被认识。1971年开始有学者报道，1978年Costerton首先对此进行了较详细的描述［3～5］。
1.1生物被膜的生化组成BF确切的生化组成仍不清楚。一些PA的生物被膜主要由乙酰化β-D-甘露糖醛酸和α-L-葡萄糖醛酸(如藻酸)组成，形成胞外粘液多糖(Mucoidexop olysaccharide，MEP)［6］。MEP则是一种易适应的聚合物，与慢性呼吸道感染密切相关。藻酸盐的生成受环境条件的影响，如介质的渗透性和营养物的限制。当铜绿假单胞菌PAO568在增加了NaC1浓度的培养基中培养时，可观察到藻酸盐的产物有所增加。有关其生物合成的遗传规则，近年来有学者认为algR基因产生algD基因，以控制一个关键基因的转录，是控制球状细胞在适应环境压力中的功能的一类转录规则［5］。
1.2生物被膜中细菌的生理机能［4，5］表面的生物被膜菌与浮游细菌相似，易获得养分和氧气，排出代谢产物，代谢活跃，菌体较大。而位于被膜深部的细菌很难获得充足的养分和氧气，代谢低下，分裂迟缓，甚至处于休眠状态，菌体较小，对外界各种刺激不敏感。浮游细菌的代谢产物易扩散至培养液中，虽不会造成代谢产物的堆积，但易受到抗菌素和吞噬细胞攻击而致命。
2 呼吸道的生物被膜病
呼吸道的生物被膜病是指在慢性感染中，由于生物被膜的影响，即使反复应用抗菌药，仍不能彻底清除病原菌，主要为PA和肺炎克雷伯杆菌，导致慢性持续性感染或感染反复发作。电子显微镜可观察到慢性肺部感染患者的气道表面的PA通过产生粘液样的藻酸盐互相聚合，紧密地粘附在气道表面［1，2］。
2.1细菌生物被膜的致病机制
2.1.1 生物被膜对抗机体免疫防御的机制［4］一方面，细菌形成微菌落包绕于生物被膜内，能限制抗菌药、噬菌体等接近细菌；另一方面，铜绿假单胞菌产生的胞外粘液多糖能抑制中性粒细胞的趋化作用，并可通过抵抗“次氯酸清除”机制而减弱氧介导的细胞内杀菌作用。这些细菌的生物被膜通常不会引起明显的感染，然而它们确实构成一个感染灶。当机体防御系统不能控制它们时，细菌随时从生物被膜中游出，成为浮游细菌，到达其它部位引起感染。常规剂量的抗菌药虽然可以消灭播散的浮游细菌，控制感染症状，但不足以消灭生物被膜菌，于是形成了一个持续的病灶导致感染的复发。
2.1.2 生物被膜在细菌粘附侵入中的作用［4］BF在细菌的粘附侵入过程中发挥重要作用，主要由细菌的鞭毛及胞外粘液多糖介导。细菌的鞭毛是粘附靶组织受体的特异性介体，但如果粘附的细菌缺乏多糖蛋白复合物，则细菌不足以侵入肺
部，因为多糖蛋白复合物能对抗肺表面活性物质和其它重要的机体防御因素，从而使细菌逐步侵入肺部并持续存在。病原菌较少使用胞外粘液多糖介导的非特异性粘附，但其作用更强，粘附更牢固。
2.1.3 生物被膜介导的免疫复合物损伤机制［2，4］在泛细支气管炎、囊性纤维化基础上并发慢性PA感染中，生物被膜介导的免疫复合物损伤是主要的发病机制。由生物被膜菌或粘液样细菌产生的藻酸盐成分作为抗原，刺激抗体的产生。这些抗体不能渗透生物被膜去除感染，但确实在生物被膜表面形成免疫复合物。中性粒细胞与免疫复合物结合沉积在气道组织内，大量的淋巴细胞浸润在小气道周围，形成慢性炎症反应，导致局部肺组织损伤。在这一过程中，藻酸盐扮演了重要角色。在患者的血中可检测到藻酸盐免疫复合物，其水平高低与临床症状密切相关。
2.2生物被膜病的治疗在BF形成的动力学研究中，发现粘附在固体表面的铜绿假单胞生物被膜菌的数目从第1～5天呈指数地增加，新生物被膜易被抗菌药清除，而老生物被膜难以清除。因此，对于与生物被膜相关的慢性肺部感染，应尽早用药，否则易导致治疗的失败［5，6］。
大量的研究发现生物被膜菌比浮游细菌易对机体产生耐药，现认为与以下几方面有关［4～5，7～10］。(1)生物被膜在细菌表面形成的物理性屏障作用。生物被膜菌产生的多糖物质象离子交换剂那样吸附一部分带电荷的抗生素分子，限制抗菌药渗入生物被膜，致细菌周围药物浓度较低，达不到有效杀菌浓度。(2)多糖蛋白复合物基质可与药物起反应，中和药物的作用。(3)生物被膜菌处于生长不活跃期，分裂迟缓，对抗菌药的通透性及敏感性较差。(4)上述几个因素利于生物被膜启动抗生素耐药基因，如β-内酰胺酶的表达及诱发耐药突变。
由于生物被膜形成的药物渗透屏障是最主要的、最难对付的耐药机制。因此，寻找能有效渗透生物被膜的药物是治疗的关键。体外实验发现鱼精蛋白、磷霉素、克林霉素和14，15环的大环类酯类抗生素可改善生物被膜的渗透性。动物实验及支气管肺泡灌洗液的细胞学分析证实阿奇霉素可使藻酸免疫的小鼠气道周围的淋巴浸润减少。其中磷霉素通过影响细胞壁合成，可改变生物被膜的渗透性；14，15环的大环类酯类抗生素能抑制藻酸生物合成途径中的二磷酸甘露糖尿苷脱氢酶(guanosine diphosphomannose dehydrogenas，GMD)的活性，减少藻酸盐的产生，破坏生物被膜的结构，利于氟喹诺酮类等抗菌药有效渗入被膜内发挥杀菌作用［2，7～9］。此外，国内的研究还发现阿奇霉素能提高氟罗沙星对BF的渗透从而增强其对生物被膜上的PA的抑菌活性［11］。在各种抗菌药中，氟喹诺酮类对生物被膜的渗透性最佳，左旋氧氟沙星能更迅速、广泛地渗入生物被膜，但其作用也是有限的［12］。所以，仅用一种抗菌药难以治愈与生物被膜相关的慢性感染，但联合用药则能有效去除生物被膜菌。在应用抗菌药的基础上，增加相对小的直流电以对抗生物被膜将大大增强灭菌效果［13］。
抗菌药物治疗的失败与剂量不足有关。为此，有人建议其抗菌效率应采用生物被膜去除浓度(biofilm eradicationg concentration，BEC)进行评价，即去除位于被膜深部的老生物被膜菌所需的抗菌药的浓度。合并可能影响生物被膜生理状态的关键生长参数，包括缓慢的生长速率、铁的限制、生物被膜的生长方式，以确定抗菌药的活性是非常重要的。合并了这些参数的体外化学系统已被成功地用于研究生物被膜菌与抗菌药的相互作用，以确定BEC。临床医师将能更精确地估计慢性感染治疗所需的有效抗菌药的浓度，从而确保疗效［7］。■
1.生物被膜（biofilm)无处不在
2.生物被膜形成过程——总共分5部
3.对于医疗来讲，生物被膜不仅仅是引起细菌耐药，而且是持续感染及伤口不愈等等的原因。
4.不同阶段的生物被膜需要，不同的干预治疗措施。
5.对于医疗中生物被膜，不仅仅靠抗菌药物。。还依靠新型材质。。或复合材质等等来预防或治疗。。。
生物膜的研究进展
第7卷第5期1998年10月 环境科学进展 ADVANCESINENVIRONMENTALSCIENCE Vol.7,No.5 Oct.,1999生物膜的研究进展Ξ 王文军1、2 王文华1 黄亚冰1 张学林2 (1中国科学院生态环境研究中心环境水化学国家重点实验室,北京100085) (2中国科学院长春地理研究所,长春130021) 摘 要 本文综述了近年来生物膜研究成果,包括生物膜的发育形成、形态结构、组成、物理-化学特征、抗性等;生物膜在污水处理方面的作用和微生物组织腐蚀性的负效应。 关键词:生物膜 特征 作用 生物膜在天然水环境中和工程处理过程中起着重要的作用[1-3]。在天然水环境中,绝大部分矿物颗粒表面覆盖着有机外壳[4],这些有机外壳由腐殖酸物质和生物膜组成,它们将强烈地改变矿物颗粒的吸附行为,这种表面吸附作用在河水污染物的迁移过程中起着决定性作用。在工业应用中,生物膜的作用表现在废水处理,以及酸性矿物排泄物的生物修复等方面,例如在水和废水处理系统中,生物膜反应器比悬浮生长反应器具有更大的优势,能提高生物量在反应器中的滞留程度,促进对污染物降解效率。生物膜的破坏性作用表现在清洁水系统中,以及微生物诱导的腐蚀等方面[5,6]。随着对生物膜在自然环境(如水、土、生物环境)中和工业应用方面的重要性的不断认识,在过去的二十多年,人们对生物膜的兴趣极大地增加[7]。美国、德国、日本、英国、法国等国家对生物膜进行了大量的研究[1-31],取得了一些初步的研究成果。 一、生物膜的形成及影响因素 生物膜形成于自然环境和人工环境中。在自然环境条件下,生物膜存在于几乎所有暴露于水中的固体表面上,代表了一类微生物群体,其中有各种寄居者如固着细菌、原生动物、真菌和藻类[4-9]。这些微生物细胞及非生物物质镶嵌在微生物分泌的有机聚合物基质(Matrix)中,聚合物基质由细菌胞外聚合物质和腐殖质等其它有机物质组成。即生物膜代表了一种稳定的由微生物细胞组成的复杂混合物的微生态系统,细胞镶嵌在胞外聚合物的基质中,并且附着到固体表面。生物膜发育形成的条件和时间序列大致为[9]: (1)存在着清洁的可用于聚居的固体表面;(2)一种有机分子膜快速形成;(3)聚结的细胞 Ξ1国家自然科学基金资助项目:29777027 2中国科学院武汉水生所淡水生态与生物技术国家重点实验室开放基金资助
细菌生物膜研究进展 (1)
306 中国医学文摘耳鼻咽喉科学 NEWS AND REVIEWS/November 2009, Vol.24, No.6 专题论坛 抗生素的合理应用 EATURE 1 生物膜的概念 细菌生物膜是指在多聚糖、蛋白质和核酸等组成的基质内相互粘连粘附于物体表面的细菌群体[1]。生物膜可以由一种或几种细菌混合生长而成。乳酸乳球菌与萤光假单胞菌混合形成的生物膜就是一个典型的例子。乳酸乳球菌自身不易形成生物膜，但可以提供给萤光假单胞菌乳酸作为养料，而萤光假单胞菌帮助乳酸乳球菌固定在物体表面，并且消耗氧气为乳酸乳球菌这一厌氧菌提供更合适的生长环境[2]。 生物膜的生命周期分为附着、生长和分离3部分。附着阶段，物体表面的血清蛋白和其他物质作为连接物介导细菌的附着；生长阶段，细菌通过分裂并在物体表面定植，生成聚合物基质，使得生物膜形成三维结构，并形成隧道，这些隧道帮助营养物质的交换以及废物的排出，并调节生物膜内的pH 值。生物膜中的细菌对氧气和营养的需要有所减少，废物通过其内的管道得以排出。生物膜内细菌间的紧密接触为携带耐药基因的质粒的交换和对密度感应分子的交流提供了良好环境。生物膜内的细菌间更利于质粒、酶和其他分子的交换，通过化学信号进行交流。生物膜的形成需要细菌间的化学信号进行协调。使得细菌能感知到周围细菌的存在并对环境变化作出相应的反应。这一过程称为密度感应（quorum-sensing ）。虽然不同细菌的生物膜有其特异性，但均具有一些普遍的结构特征。生物膜中细菌形成的微菌落间具有间隙空位（interstitial voids ），液体可在这些间隙中流动，使得营养物质、气体和抗菌药物得以扩散。生物膜的结构随着外部和内部的改变而持续变化。 2 生物膜与临床 99%的细菌以生物膜的形式生活，美国疾病控制与预防中心估计至少65%的人类细菌感染与生物膜有关[3]。生物膜已经被证实与慢性中耳炎、中耳胆脂瘤、慢性腺样体炎[1]等疾病相关。Pawlowski 等[4]于2005年在耳蜗植入体上发现了细菌生物膜。Cryer 等[5]于2004年发现一些慢性鼻窦炎手术治疗后症状仍持续 细菌生物膜研究进展 郑波 [关键词] 生物膜（Bio ?lms ）；抗药性，细菌（Drug Resistance ，Bacterial ） 郑波 北京大学第一医院临床药理研究所，北京 100034 广东人，副教授，副主任医师，主要从事细菌耐药机制和抗菌药物合理应用的研究工作。Email ：doctorzhengbo@https://www.docsj.com/doc/7612216159.html, 的患者鼻窦中存在生物膜，这些患者主要为铜绿假单胞菌感染。Ramadan 等[6]于2005年对5位慢性鼻窦炎患者进行黏膜活检，对标本进行扫面电镜检查均发现有生物膜的存在。此外，生物膜已被证实与下列感染有关：慢性前列腺炎、导管相关感染、人工关节感染、牙周病、心内膜炎以及囊性纤维化患者的假单胞菌肺炎等。 3 生物膜与抗菌药物耐药 生物膜内细菌对抗菌药物的敏感性较游离状态时显著降低，最低可降低1000倍。其原因包括生物膜的结构阻止了药物的传输或生物膜中的细菌的生理学改变等。以前一直认为生物膜介导的对抗菌药物耐药的原因是抗菌药物难以渗透入生物膜。但一些研究否认了这一假设。研究显示喹诺酮类可以很快的渗透到铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌生物膜的深部[7，8]，四环素可很快的渗透到大肠埃希菌生物膜内，万古霉素可以很快渗透到表皮葡萄球菌生物膜内。目前唯一得到证实的是氨基糖苷类药物，由于生物膜中的基质带负电荷，而氨基糖苷类带有正电荷，因此氨基糖苷类药物难以渗透到生物膜的深部[9]。 生物膜对β内酰胺类耐药性增加的机制之一是细菌产生的β内酰胺酶在生物膜表面基质内聚集，可达到很高的浓度，能迅速的将渗透进生物膜内的β内酰胺类抗生素水解掉，有效保护深部细菌不被β-内酰胺类抗菌药物灭活[10]。有研究证实氨苄西林会被肺炎克雷白杆菌生物膜表层中聚集的β内酰胺酶快速水解。 生物膜造成的缺氧环境也增加了对抗菌药物耐药性。一项在囊性纤维化患者生成的铜绿假单胞菌生物膜的研究显示氧气仅能渗透到生物膜的25%深度。铜绿假单胞菌在厌氧条件下比在有氧条件下对抗菌药物的敏感性明显降低[11]。 由于很多抗菌药物对繁殖期细菌杀伤作用更强大，如青霉素类、头孢菌素类和碳氢霉烯类等。在生物膜深部的细菌受氧气、营养物质缺乏的影响及可能存在的密度感应系统的调控，使得细菌的生长、繁殖速度下降，影响抗菌药物对其作用。因此在抗菌药物作用下，生物膜中相对敏感的细菌会被杀死，但耐药菌会持
DNA使R型细菌转化为S型细菌的原理
DNA使R型细菌转化为S型细菌的原理 实质是基因重组 R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40分钟内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R 型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。当“转化因 子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞，与受体菌染色体组上的同源区段配对，并使受体染色体组的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态）。随着受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化，其实质是基因重组。 转化之所以会发生： 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过分裂生殖形成R型和S型两种后代，不象许多人认为的（R型直接变成S 型）； 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态，保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生：S型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，当然就会有了感受态。
细菌生物膜造模步骤
Polymicrobial infections in mice. Bacterial cultures were grown overnight and then subcultured the following day into fresh media appropriate for each bacterium.Three milliliters of each culture was pelleted and washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) to remove residual medium and toxins. Bacterial suspensions were diluted in PBS to give a final concentration of 2×106 to 3×107 CFU/ml (as determined by serial dilutions and plating of the PBS suspensions of bacteria). The polymicrobial infections for the young and aged diabetic mice were separated into eight experimental groups, as shown in Table2. One hundred-microliter samples of each bacterial suspension (2×105 to 3×106 CFU), singly or in combination, were injected subcutaneously into the inner thighs of the mice, as previously described (7). Each experimental group (Table2) was comprised of 24 mice. At 1, 8, and 22 days postinjection, eight mice from each experimental group were euthanized by cervical dislocation following the induction of deep anesthesia with 100% CO2 gas. Six mice were used for the determination of the number of CFU in the injection area; the remaining two mice were used to assess the pathology of the injection site. Blood from all mice was removed from the caudal vena cava and/or directly from the heart and placed in blood vials containing EDTA. These samples were sent to a reference labo-ratory (Ani Lytics, Inc., Gaithersburg, MD) for determining complete blood cell counts. From six of the mice, the tissue surrounding the area at the site of injection was excised and the spleens were removed. Each sample was homogenized using a tissue homogenizer and resuspended in a final volume of 1 ml of PBS. Appropriate dilutions were plated on a selective medium specific for growth of each of the three organisms used. E. coli-containing samples were plated on eosinmethylene blue agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) and incubated aerobically at 37°C overnight. B. fragilis-containing samples were plated on Bacteroides bile esculin agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) and incubated anaerobically at 37°C for approximately 2 days. C. perfringens-containing samples were plated on either tryptose-sulfate cycloserine agar base (EM Science, Gibbstown, NJ) or Shahidi Ferguson Perfringens agar base (Becton Dickinson, Sparks,MD) and incubated anaerobically at 44°C for 8 to 12 h. The remaining two mice were necropsied, and the area of injection and spleens were examined for pathological changes in the infection. Five-micron-thick sections of the abscess area were stained with hematoxylin and eosin and mounted on microscope slides. Experim ental protocols involving mice were examined and approved by the Virginia Tech Institutional Animal Care and Use Committee.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备.
大肠杆菌电转化感受态细胞制备 第一天: 1.将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α置于LB或其他营养丰富的培养基上,在37°C 下过夜培养 2.高温灭菌大的离心瓶(250-500ml以备第二天摇瓶用 3.准备几瓶灭菌水(总量约1.5升,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用 第二天: 4.转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基的1-2升挡板摇瓶中 5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时 6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次 7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时,从摇床中取出摇瓶,置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时 8.细胞在4°C 5000g下离心15分钟,弃上清液(如需要,沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天 9.用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升,然后加水稀释至离心管的2/3体积。 10.照上面步骤重复离心,小心弃去上清液 11.照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞 12.离心,弃上清液
13.用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14.照上面步骤离心,小心弃去上清液(沉淀可能会很松散 15.用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml 16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管,于-80°C保存 转化方法: 1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ,冰上培育约5分钟 2. 添加1-3μl DNA ,冰上培育约5分钟 3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡中 4. 加载P1000,准备好300μl LB 或2xYT 5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏(检查时间常数,应该在3以上 6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中 7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原 8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养 大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素 1、感受态细胞的概念 重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA 分子的转化。
浅谈中药有效成分对细菌生物被膜的影响作用
浅谈中药有效成分对细菌生物被膜的影响作用 摘要：为了了解我国关于中药有效成分对细菌生物被膜的研究，通过阅读大量 的文献，对该方面的研究有了一定的了解。 关键词：细菌，生物被膜，中药，有效成分 （一）前言 细菌生物被膜（或称细菌生物膜Bacterial biofilm，BF），根据《Annu Rev Microbiol》等权威期刊所归纳发表的定义，生物薄膜是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。多糖基质通常是指多糖蛋白复合物，也包括由周边沉淀的有机物和无机物等。除了水和细菌外，生物被膜还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等，大分子多聚物如蛋白质、多糖、D N A、R N A、肽聚糖、脂和磷脂等物质。是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象,由微生物及其分泌物积聚而形成。 在特定的条件下，细菌可以形成生物被膜，包被有生物被膜的细菌称为被膜菌。被膜菌无论其形态结构、生理生化特性、致病性还是对环境因子的敏感性等都与浮游细菌有显著的不同，尤其对抗生素和宿主免疫系统具有很强的抵抗力，从而导致严重的临床问题，引起许多慢性和难治性感染疾病的反复发作。细菌生物被膜粘附在各种医疗器械及导管上极难清除，以至引发大量的医源性感染。 被膜菌的耐药机制是多方面的，并且因微生物个体的不同，其机制也不尽相同。目前关于细菌生物被膜的耐药机制研究比较认同于以下３个解释。 1营养限制学说 营养限制学说，即被膜菌生长速度减慢、生物被膜内营养物质、氧气的消耗以及代谢废物的聚集都可促使细菌进入一种非生长状态，也称为饥饿状态。这种状态下的细菌对抑制其生长的抗生素几乎完全不敏感。但是也有研究表明，在控制微生物生长速度时，处于相同生长速度的被膜菌株和浮游菌株，耐药性仍然有较大的差别，因此单独用被膜菌的生长速度来解释其耐药性，显然还不能得到满意的结论。 2抗生素渗透障碍学说
生物膜耐药机制
细菌生物膜的耐药性机制的研究近况 随着抗生素的广泛应用,细菌对抗生素产生的耐药现象日益加重, 给临床抗感染治疗带来了极大的挑战。近年来细菌对抗生素的耐药现象日益严重, 随着对生物膜研究的深入,发现细菌对抗生素的耐药性不仅与耐药菌株的大量产生有关,亦与致病菌在体内形成生物膜有关。近些年来,对细菌生物膜的基础研究和临床研究成为国内外细菌耐药研究热点,本文在前人的研究基础上,对生物膜的耐药机制作综述,为了更好指导临床治疗方案。 细菌生物膜(Bacterial Biofilm ,BF) 是细菌在生长过程中为适应生存环境而不可逆的粘附于非生物或生物表面形成的一种与浮游细胞(plank tonic cell)相对应的生长方式,由细菌和自身分泌的胞外基质组成。BF的耐药机制不同于浮游菌，有效浓度的抗菌药物能迅速杀死浮游生长的细菌和BF表面的细菌，但对BF深处的细菌却难以有效杀灭。当细菌以BF形式存在时耐药性明显增强(10一1000 倍),抗生素应用不能有效清除BF,还可诱导耐药性产生。BF通过多种机制参与耐药形成, 不同机制间还存在协同作用[1]。 1 抗菌药物渗透障碍 BF中的细菌合成的胞外基质及水不溶性胞外多糖等物质构成的细菌生物膜独特三维结构,是BF 细菌的保护装置,成为抗菌药物向BF 和BF 细菌菌体内渗透的天然屏障。BF的物理性阻碍作用,降低了菌体内抗菌药物的浓度,从而表现出耐药性。改变金黄色葡萄球菌胞外多糖中特定季铵盐疏水键长度,增加其疏水,该菌株的耐药性亦增高;若去除疏水基质,则对多数抗菌药物敏感。此外,胞外多糖所带的负电荷,可与带正电荷的抗菌药物结合,而阻止药物的进一步渗透。氟化喹啉虽易穿透生物膜,但也不能完全清除细菌生物膜内的细菌。这一现象表明,BF 阻止抗菌药物渗透,只是其耐药机制的一个方面[2]。 2 特殊的微环境药物活性调节与生物膜中细胞的生长速度密切相关，抗生素对快速生长细胞更有杀伤力。生物膜中的营养成分、代谢产物浓度、渗透压和氧浓度等，自外向内呈梯度下降。这种特殊微环境和营养条件，使其中的细菌生长速度较游离菌和浮游菌明显缓慢。深层的细菌很难获得养分和氧气，代谢产物难以排出而堆积，因此，这些生物膜菌代谢活性很低，甚至处于休眠状态，菌体较小，不进行频繁的细胞分裂，对各种理化刺激、应激反应及药物均不敏感。Schauder等[3]发现当使用抗生素治疗时，生长快速的外层或表层细菌最敏感，首先被杀死；生长缓慢者敏感性下降，大部分被杀死；而生长停滞者则不敏感，待抗生素治疗停止后，残存细菌利用死亡细菌作为营养源迅速繁殖形成新的生物膜，这使感染反复发作，难以控制。 3 BF特殊的生物膜表型生物膜细菌与浮游菌相比,出现了生物膜环境所特有的基因表达模式,即对生长表面的粘附触发了部分细菌亚群基因表达的变化, 使其生物学行为也随之改变, 这称为生物膜表型。生物膜特有的表型能够激活其耐药机制。目前从mRNA 水平和蛋白水平寻找生物膜状态和浮游状态下基因表达的差别,是生物膜研究的一个热点。白色念珠菌拥有的编码外排泵的MDR 基因和耐药性相关基因——CDR 基因家族, 在生物膜中表达均有增强, 可能引起细胞膜上外排泵数目增多或活性增强, 导致生物膜中的菌株出现耐药性。而人工敲除细菌中的这些耐药性基因, 所培养的浮游菌株耐药性下降, 生物膜菌株耐药性却没有明显下降,表明耐药性并不是单一的耐药性基因所控制的
国内外感染伤口细菌生物膜处理方式的研究进展
国内外感染伤口细菌生物膜处理方式的研究进展 细菌生物膜是感染伤口迁延不愈，手术及局部给药治疗效果不佳的主要原因之一。目前临床上普遍使用的处理伤口细菌生物膜的方法有局部机械清创法、负压疗法、局部药物等，虽具有一定的治疗效果，但细菌生物膜仍是目前临床治疗慢性感染的棘手问题。近年来，国内外学者提出了一些新的治疗方法及理念，如光动力学治疗、低能量光疗、乙酸及抗菌肽等的使用，本文综述了国内外感染伤口细菌生物膜处理的研究进展，以期为目前生物膜的临床治疗与护理带来启发。 Abstract：Bacterial biofilm is one of the main reasons for the unhealing of infection wound，the poor effect of operation and local administration.At present，the methods of treating bacterial biofilm in clinic are local mechanical debridement，negative pressure therapy，local medicine and so on. Although it has certain therapeutic effect，bacterial biofilm is still a thorny problem in clinical treatment of chronic infection.In recent years，scholars at home and abroad have put forward some new treatment methods and ideas，such as photodynamic therapy，low-energy phototherapy，acetic acid and antimicrobial peptides，etc.This article reviews the research progress of bacterial biofilm treatment in infected wounds at home and abroad in order to bring inspiration to the clinical treatment and nursing of biofilm. Key words：Bacterial biofilm；Infected wound；Photodynamic therapy；Low energy phototherapy；Antimicrobial peptide 傷口细菌生物膜（bacterial biofilm）因其独特的组织结构，对抗生素以及其它一些抗菌物质有着极强的耐药性[1]。美国疾控中心数据表明，65%～80%的伤口感染都与细菌生物膜有关[2]。而细菌生物膜也成为了感染伤口迁延不愈，手术及局部给药治疗效果不佳的主要原因之一。目前临床上普遍用来处理伤口细菌生物膜的方法包括局部机械清创法，破坏菌膜、生物工程替代疗法、负压疗法、局部药物等治疗方法，以上方法虽均具有一定的治疗效果，但细菌生物膜仍是目前临床治疗慢性感染的棘手问题。近年来，国内外医学专家通过对细菌生物膜产生的机制和其对伤口愈合的不利影响，以及如何消除伤口生物膜的方法进行了研究，并提出了一些新的治疗方法及理念，这些会对目前生物膜的临床治疗与护理带来启发，现综述如下。 1细菌生物膜产生的机制及特性 细菌生物膜是微生物有组织生长的聚集体，指细菌不可逆的附着于一个惰性或活性的实体表面，进而繁殖、分化，并分泌一些多糖（EPS）基质，将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。单个生物膜可由一种或多种不同的微生物组成，包括细菌，还包括真菌、病毒、蛋白质、细胞外DNA等多种成分[3]。 生物膜的形成是一个动态[4]的过程，主要分以下3个阶段：微生物附着于创面，EPS的分泌和菌落的形成，以及菌落细胞的成熟与传播。当生物膜内环境
支原体生物膜研究进展_叶晓敏
·综述·支原体生物膜研究进展 叶晓敏，陆春 (中山大学附属第三医院皮肤科，广东广州510630) ［摘要］近几年，支原体生物膜研究逐渐受到研究人员的关注。多种支原体都被证实具有生物膜形成 能力，生物膜形成后支原体耐药性增加，研究生物膜对于防治临床支原体感染有着重大意义。本文从 目前报道的几种支原体生物膜的形成及结构、生物膜形成的影响因素、生物膜形成对支原体药物敏感 性的影响及可能机制等几个方面综述了目前对支原体生物膜的研究进展。 ［关键词］支原体;生物膜 ［中图分类号］R759［文献标识码］A［文章编号］1674－8468(2011)01－0060－04 生物膜(Biofilm，BF)是微生物在生长过程中附着于物体表面而形成的由微生物的细胞及其分泌的聚合物等所组成的膜样多细胞复合体［1］。生物膜的存在可以增强病原微生物对宿主免疫攻击及抗菌药物的抵抗力。目前对大量支原体的研究已发现很多支原体都具有形成生物膜的能力。生物膜形成后增强了支原体对环境压力如热、干燥、缺氧、高渗透压等［2-3］及对抗菌药物的抵抗力［4］。本文从支原体生物膜的形成及结构、生物膜形成的影响因素、生物膜形成对支原体药物敏感性的影响及可能机制等几个方面对目前支原体生物膜的研究进展作一综述。 1支原体生物膜的鉴定及其形成和结构 生物膜是微生物细胞不断粘附、聚集，并包裹在自身生成的胞外基质中形成的多聚复合物，体积上15%由细胞组成，85%由胞外基质组成。目前生物膜的培养多以玻片、细胞爬片、滤膜为载体，可在液体中或固体培养基表面培养，依靠扫描电镜或共聚焦显微镜观察，通常认为观察到多层复合结构即为生物膜结构［5-6］。 生物膜的形成是一个动态过程，先后包括5个步骤［7］:可逆性粘附、不可逆性粘附、早期形成阶段、成熟及消散阶段。虽然很多研究认为支原体培养24小时生物膜即已形成，并以此期生物膜为对象研究其对抗菌素等的抵抗力。但Laura McAuliff等［2］在研究了牛支原体生物膜时有不同的发现。作者利用共聚交显微镜结合SYTO9/PI 荧光探针对牛支原体生物膜形成的动态过程进行观测，发现形成的24及48小时大部分细胞是活的，而通过共聚交显微镜的观察及三维重构发现牛支原体生物膜在最初的24小时仅有一层细胞粘附，48小时才发展成一个非匀质的框架结构，有近20um高，还有通道样结构，此时的生物膜才趋于成熟，同时研究发现培养24小时的牛支原体生物膜对达氟沙星，恩氟沙星，土霉素与游离状态的细胞同样敏感，证明牛支原体培养24小时尚未形成成熟生物膜。可见不同微生物生物膜成熟的时间是存在差异的，在对生物膜特性进行研究之前因先确定其成熟时间点。 支原体生物膜形态与其他微生物相似，可呈网络样、蜂窝状、柱状、蘑菇样、塔样，其间可见水通道，同一种微生物可形成不同结构的生物膜。如肺炎支原体的生物膜最初可形成蜂窝状的区域，在此基础上向外生长成蘑菇状或塔状，塔的直接从小的10um到大于50um，并在塔结构内可见到通道。随着生物膜生长时间的延长，蜂窝状结构中的空洞减少而塔的直径增加，生物膜的形成逐渐趋于成熟［8］。生物膜在不断成熟、丰厚的过程中对内层细胞保护作用不断增强，但由于其深部的细胞营养物质及氧份缺乏也会抑制其生长，正如Laura McAuliff的研究发现培养72小时的生物膜中近70%的细胞都死亡了，活的细胞主要位于生物膜中心。 2影响支原体生物膜形成的因素 生物膜的形成过程中粘附是第一步也是最关键的一步，某些胞外多糖及蛋白质物质是介导粘附的重要基质。如大肠杆菌的表多糖［9］，铜绿假单胞菌的藻酸盐［10］等都可促进生物膜的形成。有关支原体的研究也发现支原体的生物膜形成也与某些多糖及蛋白质物质有关。 2．1多糖与生物膜形成 野生型的肺炎支原体可形成一种胞外多糖，即表多糖(exopolysaccharide，EPS)-Ⅰ，它是由当量克分子的葡萄糖
R型细菌如何转化成S型细菌
R型细菌如何转化成S型细菌 R型活肺炎双球菌（受体菌）在对数期后期（生长后期）约40分钟内处于“感受态”，吸收外源DNA的能力比其他时期大1000倍。此时，R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面有30-80个“感受态因子”位点。感受态因子是一种胞外蛋白，它可以催化外来DNA片段的吸收或降解细胞表面某种成分，从而使细胞表面的DNA受体显露出来（也可能是一种自溶酶，可特异性地结合双链DNA）。被加热杀死的S型肺炎双球菌（供体菌）自溶，释放出自身的DNA片段（已经失活，但双链结构尚存在，分子量小于1×107，约含15个基因），称为“转化因子”。当“转化因子”遇到感受态的R型活肺炎双球菌（受体菌）时，就有10个左右这样的双链片段与R型活肺炎双球菌（受体菌）细胞膜表面的“感受态因子”位点相结合，在位点上进一步发生酶促分解，形成平均分子量为4-5×106的DNA片段，然后双链拆开，其中一条降解，另一条单链逐步进入细胞，与受体菌DNA的同源区段配对，并使受体DNA的相应单链片段被切除，从而将其替换，于是形成一个杂种DNA区段（它们间不一定互补，故可呈杂合状态）。随着受体菌DNA进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此DNA发生分离，于是就由R型肺炎双球菌产生出S型肺炎双球菌的后代。这个过程称为原核生物的转化，其实质是基因重组。 转化之所以会发生： 一、因为R型与S型的DNA可以同源区段配对，形成杂合细菌，通过分裂生殖形成R型和S型两种后代，不象许多人认为的（R型直接变成S型）； 二、无荚膜的R型有非常重要的感受态，保证了S型的DNA可以进入。反之则不会发生：S型有荚膜，无感受态，不能作为受体菌，若人为除去荚膜，培养出无荚膜的后代，它就同时丧失了毒性，变成R型，当然就会有了感受态。 三、真核生物的细胞膜表面结构与原核生物的大不相同，不会发生转化（转化本身只发生在同种菌株间或近缘菌株间）。我们可以放心去吃想吃的东西，包括被加热杀死的S型肺炎双球菌。 四、S型可以变成R型吗？当然可以！产荚膜细菌由于有黏液物质，菌落表面湿润、有光泽、黏液状，称光滑型—S型（smooth）；无荚膜细菌由于无黏液物质，菌落表面干燥、粗糙，称粗糙型—R型（rough）。自然状态下通过基因突变来完成，不是转化。人工方法是诱变，物理、化学方法都行，变过来的还能再变回。
生物膜
生物膜 介绍：本文介绍了什么是生物膜以及它们在阻碍伤口愈合过程中所起到的重要作用。此外，还探讨了可能的干预方法，旨在清除或减少生物膜，并预防其在伤口再次形成。 什么是生物膜： 生物膜是一种微生物群落复合体，由细菌和真菌组成。微生物能合成并分泌一种保护性基质，通过它将生物膜牢固的附着在活体或非活体表面。 生物膜是一种动态的异种群落复合体，处于不断变化的状态，它们可能由单一种群细菌或真菌组成，大多数情况下，由多种群组成，比如包含多种多样的菌群。基本上，可将生物膜描述成细菌隐藏在一层厚厚的黏滑的保护层中，保护层由糖类和蛋白质组成。生物膜保护层可保护微生物免受来自外界的危害。 生物膜与伤口有什么联系？ 一直以来都认为生物膜可在医疗器械表面形成，例如导尿管、气管插管、鼓膜通气管、骨科与胸部植入物、角膜接触镜、子宫内避孕器（IUDs）以及缝合线。它们是导致潜在的细菌感染和慢性炎症的主要原因，如牙周炎、囊性纤维化、慢性痤疮以及骨髓炎。 生物膜还常见于伤口，并在某种程度上会延迟伤口愈合进程。通过电子显微镜对慢性伤口与急性伤口的活组织检查发现，60%的慢性伤口含有生物膜结构，而急性伤口只有6%含有生物膜结构。据报道，生物膜是导致多种慢性炎症性疾病的主要因素，那么极有可能几乎所有的慢性伤口上至少有部分创面含有生物膜菌群。 生物膜是如何形成的？ 阶段一：可逆的表面粘附 微生物通常被认为处于孤立的自由漂浮状态（如浮游型）。然而，在自然条件下，大部分微生物倾向于粘附在物体表面上，并最终形成生物膜。最初的粘附是可逆的。 阶段二：永久性表面粘附 随着细菌的繁殖，它们粘附的更加牢固（定植），发生变异，改变基因表达模式以提高生存能力。这通常是一种被称为细菌群感效应（Quorum sensing）的细菌通讯的结果。 阶段三：黏滑保护性基质/生物膜 一旦牢固地附着在表面上，细菌开始分泌一种包围基质，即细胞外聚合物（EPS）。 这是一种保护性基质或称为“黏质物”。这样，小菌落形成最初的生物膜。 EPS的准确成分因所含的不同微生物而异，但通常由多糖、蛋白质、糖脂和细菌DNA 所组成。一般认为存活的或死去的细菌释放的细菌DNA是构成生物膜细胞外聚合物（EPS）基质的重要组成部分。细菌分泌出各种蛋白质和酶帮助生物膜牢固的粘附在伤口创面上。
结核分枝杆菌生物膜研究进展
Hans Journal of Medicinal Chemistry 药物化学, 2018, 6(3), 78-84 Published Online August 2018 in Hans. https://www.docsj.com/doc/7612216159.html,/journal/hjmce https://https://www.docsj.com/doc/7612216159.html,/10.12677/hjmce.2018.63011 Advances on Research of Mycobacterium tuberculosis Biofilms Menglan Gan, Renfeng Wang, Zaichang Yang* School of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang Guizhou Received: Aug. 1st, 2018; accepted: Aug. 15th, 2018; published: Aug. 22nd, 2018 Abstract Biofilms refer to a microbial community that is surrounded by a self-generated extracellular po-lymer and attached to the cell surface, but the physiology and genetics definition of the M. tuber-culosis biofilm have not yet been described. Because of its unique physiological state, M. tuberculo-sis biofilms limit the therapeutic effect of anti-tuberculosis drugs, prolong the cycle of tuberculosis treatment, and seriously endanger human health. This article reviewed the formation mechanism, structural composition and related functions and quantitative methods of M. tuberculosis biofilms, and discussed the research ideas of using M. tuberculosis biofilms as novel anti-tuberculosis drugs to shorten the treatment of tuberculosis and provide a new direction for improving the therapeu-tic effect of tuberculosis. Keywords Mycobacterium tuberculosis, Biofilms, Tolerance 结核分枝杆菌生物膜研究进展 甘梦兰，王仁凤，杨再昌* 贵州大学药学院，贵州贵阳 收稿日期：2018年8月1日；录用日期：2018年8月15日；发布日期：2018年8月22日 摘要 生物膜是指被自我产生的细胞外聚合物包裹，并附着在细胞表面的微生物群落，但结核分枝杆菌生物膜*通讯作者。
2008-植物相关细菌生物膜研究进展
收稿日期：２００８－０４－２９ 基金项目：江苏省农科院院基金（６２１０７３０） 作者简介：杨敬辉（１９７３－），男，云南丽江人，助理研究员，从事植物病害生物防治工作。 河北农业科学，２００８，１２（９）：１－３ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ 责任编辑李布青 在自然环境中生存的细菌结合于固体、液体介质表面或与别的微生物细胞密切接触，以多细胞形式聚集在一起称作生物膜［１］。细菌粘附于寄主表面，彼此间由１个结构复杂的基质包裹，基质通常由不同的胞外多聚物，包括多聚糖、蛋白和ＤＮＡ等组成。生物膜的构型排列很复杂，有些是表面平坦无特征的膜，有些则是由多层细胞聚集形成形状各异的膜，如塔型和彩带型等。 生长于生物膜内的细菌所表现的细胞生理学，与其 分散生长于组织内时所表现的生理学不同［２］。在生物膜 内，细菌能对营养、代谢排泄物的浓度和细菌群体密度作出反应，调节新陈代谢，并能与邻近细胞相接触，参与细胞之间的交流。细菌形成生物膜后增强了对抗生素的忍耐力。生物膜所具有的有益和有害的活性，使其在工业、医药和设施农业上具有重要意义。 虽然许多关于微生物生物膜形成的基础研究大多集中在无生命物质的表面，但很明显在寄主植物与细菌互作过程中，细菌可在生物体表面上形成生物膜。粘附于植物表面的多细胞聚集体被描述为微菌落、聚集体或细 胞簇［３］ 。综述了有关生物膜结构、形成和微生物与陆生 植物结合所形成生物膜特性等方面的研究进展。 １细菌生物膜形成的影响因子 １．１复杂而动态的植物表面环境影响生物膜的形成 陆地环境中蕴藏着丰富而多样的微生物群落，这些 微生物群落能参与资源库的竞争和修整。在复杂而竞争的环境中，植物提供微生物赖以生存的环境。细菌定殖于植物的叶面、根、种子和内部脉管系统，这些类型的组织有特殊的化学和物理特性，这些特性影响了微生物的定殖机会和挑战能力。 陆生环境中水的可利用程度及其饱和水平是多样的，植物与细菌的互作大多经历不同水平的水合作用。此外还依赖于定殖位点、气侯条件和适宜的土壤组成等。植物的叶表面相对干燥，但能被雨水和露水淋湿。植物根围和土壤中种子表面含水量则更依赖于土壤中水的饱和度。水的限制作用能极大的影响生物膜的结构。 因此，特定环境和特定组织内水的饱和水平将极大 的影响生物膜的形成［３］ 。而在每个大的组织类型中又有 不同的微环境，如：植物根的不同部位表现出不同的小生境，生长活跃的根组织在土壤中的分泌率较高，而处 于生长点的根冠细胞则不断脱落［４］ 。不同场所释放的营 养和渗出物质能在很大程度上影响生物膜的产生。植物叶面组织经常含有一腊质层，其在叶片上表面和下表面分布不同。韧皮部和木质部导管在脉管系统中是不同的组织类型，在叶、茎干和根中的韧皮部及木质部组织，其流动性组成，体系结构和空间排列上均不相同。细菌能适应各种小环境，因此，生物膜的形成反映了其定殖场所的自然状态。 １．２细菌在植物表面主动和被动的沉积作用对生物膜形成的影响 微生物沉积作用的被动机制在整个陆生环境中较为常见，如风、雨的飞溅和根围的水流。而趋化性和运动 性是细菌形成生物膜的主动性机制［５］。不同假单胞菌的 植物相关细菌生物膜研究进展 杨敬辉１，文平兰２，陈宏州１，朱桂梅１，潘以楼１ （１．镇江农科所，江苏句容２１２４００；２．句容市农技推广中心，江苏句容２１２４００） 摘要：介绍了不同类型的植物相关细菌生物膜，综述了有关生物膜结构、形成和微生物与陆生植物结合所形成生物膜的特性等方面的研究进展，阐述了植物表面环境、细菌在植物表面主动和被动的沉积作用等对生物膜形成的影响。关键词：微生物；生物膜；群体感应中图分类号：Ｑ９２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－１６３１（２００８）０９－０００１－０３ ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎＢｉｏｆｉｌｍＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔ!ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＢａｃｔｅｒｉａ ＹＡＮＧＪｉｎｇ!ｈｕｉ１，ＷＥＮＰｉｎｇ!ｌａｎ２，ＣＨＥＮＨｏｎｇ!ｚｈｏｕ１，ＺＨＵＧｕｉ!ｍｅｉ１，ＰＡＮＹｉ!ｌｏｕ１（１．ＺｈｅｎｊｉａｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｊｕｒｏｎｇ２１２４００，Ｃｈｉｎａ；２．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＥｘｔｅｎｓｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＪｕｒｏｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｊｕｒｏｎｇ２１２４００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｅｖｅｒａｌｔｙｐｅｓｏｆｐｌａｎｔ!ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｂｉｏ－ｆｉｌｍｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｏｒ－ｍａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｂｉｏｆｉｌｍｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆｐｌａｎｔｓｕｒｆａｃｅａｎｄｔｈｅａｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔ!ａｓ－ｓｏｃｉａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｈｏｓｔｔｉｓｓｕｅｓｕｒｆａｃｅｓｄｕｒｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｓｙｍｂｉｏｓｉｓｏｎｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｅｒｅｅｌａｂｏ－ｒａｔｅｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；Ｂｉｏｆｉｌｍ；Ｑｕｏｒｕｍ!ｓｅｎｓｉｎｇ