大量纯化蛋白的简易步骤

纯化蛋白的简易步骤

纯化

1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220

rpm培养。

2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至

OD600≈0.4-0.5。

3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱

导前对照）。之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。

4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻

存）。

5.配制buffer A，如下

6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl2

1:2000）。1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。

7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。

8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。（一定不要菌体碎片！

取4ul+4ulLB 作为binding前的对照）

9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液

沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。

10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音

混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。

11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer，

放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。

Wash buffer: buffer A+20mM imidazole

12.洗好的beads加入适量（5CV）的elution buffer，放置10min后洗脱。为了确保蛋白全

部洗脱下来，可以边洗脱边用考马斯亮蓝法检测蛋白，当不再变蓝时，就不用再洗脱了。

Elution buffer：buffer A+250mM imidazole (imidazole 浓度高时，用浓HCl调pH值) 11. elution 后的蛋白分装成50-100uL/管，冻于-80℃，避免反复冻融。取5-10uL电泳检测蛋

白表达量。

蛋白浓缩步骤：

将提纯的蛋白加入浓缩管中（10），3000g，4℃，第一次离心10min（用bradford检测废液中是否有蛋白）。边离心边检测，至终体积约为700uL。用200uL枪吸出蛋白，注意不要碰到膜，检测蛋白的终浓度。

FPLC

1、用buffer A 平衡分子筛，flow rate: 0.5; pressure <1.2，时间大约1h。

2、将浓缩好的蛋白离心5min，上清用注射器加入进样孔。

3、收集峰值很好的蛋白，取出跑电泳，染色，检测是否有目的条带，纯度如何。

4、选取纯度最好的蛋白，浓缩后测量浓度，计算得率。

5、若蛋白浓度和纯度达到标准，即可进行结晶实验。

上样：

Pump flow 0.5ml/min insert

Flowpath inject

Alarm alarm pressure <1.5Mpa

Fraction size 0.5ml

End time acu volume 25ml

Execute

A 泵放水中，pump wash pump A insert

DLS（动态光散射）

判断纯化蛋白的分子量大小。

结晶蛋白

TIPS:

1、Lysis buffer 多加一点，50mL/L 菌。

2、离心时间长一点45min 10000rpm

3、5个柱体积洗beads

4、Binding 1h. Binding后先倾斜放，等beads 沉下去后把beads先吸到预装柱里，再把上

清加进去。

5、10个柱体积wash, 注意不要破坏柱床。

6、5个柱体积洗脱。一般第二次最浓，边洗脱边用Bradford检测，不变蓝就不用再洗脱

了。1ml+1ul蛋白变色？

7、浓缩<3000g（千万不要超过），一般用3500rpm 就可以了。

蛋白纯化步骤

蛋白纯化步骤 引言： 蛋白质是生物体内重要的生物大分子，其结构和功能对于维持生命活动至关重要。为了研究蛋白质的性质和功能，科学家们需要将蛋白质从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化是一项复杂而重要的实验步骤，本文将介绍常用的蛋白纯化步骤。 一、细胞裂解和收集 蛋白纯化的第一步是将含有目标蛋白质的细胞裂解，并将目标蛋白质收集起来。常用的细胞裂解方法包括机械破碎、超声波破碎和渗透破碎等。裂解后，通过离心等方法将蛋白质从其他细胞组分中分离出来。 二、沉淀和上清液分离 细胞裂解后蛋白质溶液中可能存在大量杂质，需要通过沉淀与上清液分离的方法去除。常用的方法包括盐析法、有机溶剂沉淀法和凝胶渗析法等。这些方法可以根据蛋白质的特性选择合适的杂质去除方法。 三、蛋白质分子量筛选 蛋白质纯化过程中，通常需要对蛋白质进行分子量筛选。这样可以去除低分子量的杂质和蛋白质降解产物。常用的方法包括凝胶过滤法、凝胶电泳法和离子交换色谱法等。

四、亲和纯化 亲和纯化是一种常用的蛋白纯化方法，该方法利用蛋白质与亲和基质之间的特异性相互作用进行纯化。亲和基质可以是抗体、金属离子、亲和标签等。通过将亲和基质与目标蛋白质结合，再通过洗脱等步骤将目标蛋白质从杂质中分离出来。 五、离子交换层析 离子交换层析是一种基于蛋白质与离子交换基质之间的静电作用力进行纯化的方法。根据蛋白质的电荷性质，可以选择合适的离子交换基质和缓冲液条件，使目标蛋白质与基质发生相互作用。通过调整离子浓度和pH值，可以实现目标蛋白质与基质的分离。 六、凝胶过滤层析 凝胶过滤层析是一种根据蛋白质的分子量进行纯化的方法。通过选择合适的凝胶基质和孔径，可以使目标蛋白质从较大分子量的杂质中分离出来。这种方法适用于蛋白质的富集和浓缩。 七、逆流层析 逆流层析是一种根据蛋白质的亲和性进行纯化的方法。该方法利用逆流层析柱中填充的亲和基质与目标蛋白质之间的特异性相互作用进行纯化。通过调整流动相的条件，可以实现蛋白质的吸附和洗脱，从而分离目标蛋白质。

蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤: (一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破 碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但 要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子 强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,

抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。 (三)蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法: 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。 (四)样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交

蛋白质纯化常用方法

蛋白质纯化常用方法 蛋白质纯化是一种分离高纯度蛋白质的过程，可用于研究物种的功能和结构。蛋白质纯化可以是一个繁琐的过程，通常需要多步骤的分离和纯化。以下是一些常见的蛋白质纯化方法。 一、离心分离 离心分离是根据蛋白质的分子量和密度差异来分离不同的成分。高速离心法可分离细胞质组分、胞器、膜蛋白和核酸等。低速离心法可从混合物中净化纤维蛋白、酶、酰化酶等。 二、盐析 盐析是将溶液中的蛋白质与一定饱和度的盐混合后，通过离子间作用而使蛋白质发生沉淀的过程。盐的浓度、pH值、离子类型和温度等因素会影响到沉淀的生成和纯度。盐析也可以通过凝胶过滤或离子交换等方法来提高效果和纯度。 三、凝胶柱层析 凝胶柱层析是一种将混合物缓慢地通过一个由多种凝胶材料组成的列的过程。该列可根据蛋白质大小、电荷、亲疏水性等特性进行选择。通过这种方法，可以净化蛋白质并快速消除杂质、缓解蛋白结构等。 四、亲和层析 亲和层析是一种利用配体与蛋白质间的特定的结合进行选择性分离的技术。配体通常被共价结合在凝胶上, 一些常见的配体包括金属离子、抗体和亲和素等。通过这种方法，可以高效且选择性地纯化蛋白质，并减少染料、盐和杂质的存在。 五、电泳 电泳是根据蛋白质的电荷大小将充电的蛋白质分离开的过程。根据电泳类型不同，可以区分不同细胞蛋白、酶、抗体等。蛋白质电泳在生物化学实验室中广泛应用，是一种可视化分离的传统方法。 六、共沉淀 共沉淀是基于化合物的亲和性，在溶液中同时存在的两种蛋白质之间发生非共价结合的过程。通过共沉淀获得的纯化蛋白质收率较高但一般会伴随着蛋白质活性的损失。 总之，纯化蛋白质的过程需要结合样品的特性和分离纯化方式的优点和局限性，选择合适的技术来获得高纯度和活性的蛋白质。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改进) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

蛋白质纯化实验步骤

蛋白质纯化实验步骤 引言: 蛋白质是生物体内重要的基本组成部分，对于深入了解蛋白质的结构和功能具有重要意义。蛋白质纯化是一个关键步骤，可以从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并去除杂质。下面将介绍一种常用的蛋白质纯化实验步骤。 一、样品制备 在开始蛋白质纯化实验之前，首先需要准备样品。样品可以是细胞提取物、培养基中的蛋白质等。样品制备的关键是要保证样品的完整性和纯度，避免蛋白质的降解和杂质的污染。 二、离心 将样品进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等大颗粒物质。离心过程中，可以根据颗粒物质的大小和密度来选择合适的离心条件，如转速、离心时间等。 三、初步分离 将离心后的上清液取出，进行初步分离。可以采用一些常用的分离技术，如离子交换色谱、凝胶过滤等。这些技术可以根据蛋白质的电荷、大小等特性进行分离，从而使目标蛋白质得到部分纯化。 四、亲和层析

亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过利用目标蛋白质与某种亲和剂之间的特异性相互作用来实现纯化。亲和剂可以是金属离子、抗体、配体等，可以根据目标蛋白质的性质和特点来选择合适的亲和剂。 五、凝胶电泳 凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术，通过电场作用使蛋白质在凝胶中迁移，根据蛋白质的大小和电荷来实现分离。凝胶电泳可以用于检测和鉴定目标蛋白质，同时也可以用于纯化蛋白质。 六、柱层析 柱层析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过将样品溶液通过填充在柱子中的吸附剂层析，实现蛋白质的分离和纯化。柱层析可以根据蛋白质的性质和特点来选择合适的吸附剂，如离子交换柱、凝胶过滤柱等。 七、透析 透析是一种常用的蛋白质纯化技术，通过溶液之间的渗透压差来实现目标蛋白质的分离和杂质的去除。透析可以用于去除一些小分子杂质，如盐类、小分子药物等。 八、浓缩 浓缩是一种常用的蛋白质纯化技术，通过去除大量的水分来提高目标蛋白质的浓度。常用的浓缩技术有深度过滤、超滤等，可以根据

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤(待改良) 1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。 2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。 3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA. 4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。 5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。 6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。 7、蛋白的诱导表达。 1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,参加IPTG,浓度梯度从25μM 到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。 2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注:目的蛋白包涵体表达量一般会到达菌体 蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。 3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。 甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。 4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm), 诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中参加1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。2. 保种可以取一局部分成50μl一管,每次用一管,防止反复冻融。 8、包涵体检测。方案见附件2 9、如有上清表达,则扩大摇菌。 1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种 的活性而异,也可过夜摇菌。 2)将上一步中的8ml参加300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约 2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。)注:菌液浓度要适当 的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。 拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。 3)过夜摇菌,使用包涵体检测的温度(18°左右),转速140rpm左右。 4)将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。参加20mM PBS,洗一遍后用平衡缓 冲液重悬。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。可用4支50ml 的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。 10、超声波裂解。 1)用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。 注意:1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比拟大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为:孜孜声,锋利刺耳的声音说明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因,要及时调整。溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠说明裂解完成(后面3000转离心时,如果沉淀少说明裂解的好)。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min(即关闭总电源开关)。 注意:1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂(PMSF),PMSF 工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解 60分钟,60分钟足够裂解。

蛋白质分离纯化步骤

一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。 二、分离纯化蛋白质的一般程序 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提

蛋白质纯化方法

蛋白质纯化方法 蛋白质作为生物体内重要的功能分子之一，其纯化方法的选择对于生物学研究和工业生产中的蛋白质制备具有至关重要的意义。纯化蛋白质能够去除与目标蛋白质无关的其他生物分子，从而提高蛋白质的纯度和活性。在本文中，将介绍几种常用的蛋白质纯化方法。 一、溶液层析 溶液层析是一种常用的蛋白质纯化方法。该方法利用分子大小、电荷和亲水性等差异，将混合物中的蛋白质分离开来。常见的溶液层析方法包括凝胶层析、离子交换层析和亲和层析等。 1. 凝胶层析 凝胶层析是一种基于分子大小的分离方法。常见的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺薄膜和聚糖凝胶等。这些凝胶材料具有不同的孔隙结构，通过选择合适孔径的凝胶材料，可以将目标蛋白质与其他分子分离开来。 2. 离子交换层析 离子交换层析是一种基于分子电荷的分离方法。该方法利用纯化材料表面的离子交换基团与蛋白质间的电荷交互作用，将蛋白质分离开来。阳离子交换材料选择带有阴电荷的材料，而阴离子交换材料选择带有阳电荷的材料。 3. 亲和层析

亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。该方法利用纯化材料表面的特定化合物与目标蛋白质之间的特异性相互作用，将目标蛋白质与其他分子分离开来。常见的亲和层析材料有亲和树脂和亲和薄膜等。 二、电泳分离 电泳分离是一种基于蛋白质电荷和大小的分离方法。常见的电泳分离方法包括SDS-PAGE和等电聚焦。 1. SDS-PAGE SDS-PAGE是一种基于蛋白质分子大小的分离方法。该方法利用十二烷基硫酸钠（SDS）将蛋白质分子包裹成带负电的复合物，使其在凝胶电泳时按照分子大小分离开来。通过引入分子量标记物，可以根据标记物的迁移距离来确定目标蛋白质的分子量。 2. 等电聚焦 等电聚焦是一种基于蛋白质电荷的分离方法。该方法利用胶体颗粒的电动流动使蛋白质在电泳过程中在不同的pH值时停止运动，从而达到分离的目的。等电聚焦在凝胶上形成pH梯度，蛋白质在梯度中由于电荷变化发生位置变化。 三、高效液相色谱 高效液相色谱（HPLC）是一种高效的蛋白质纯化方法。该方法通过利用溶液中蛋白质与色谱填料之间的相互作用，实现目标蛋白质与其他分子的分离。

四种蛋白纯化的有效方法

四种蛋白纯化的有效方法 四种蛋白纯化的有效方法 在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋 白从复杂的混合物中纯化出来。蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标 蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。然而，由于蛋白质的复 杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。 为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。 1. 亲和层析法： 亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的 方法。这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高 亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。在实验中，我们可以将配体 固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的 混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。随后，非特异性蛋白质被 洗脱，而目标蛋白则被保留下来。目标蛋白可以通过改变条件（例如 改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。 亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。然而，由于亲 和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关

键。亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。 2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）： 凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。 凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。 3. 离子交换层析法： 离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。离子交换材料是一种能够与具有相反电荷的蛋白质分子发生相互作用的固相材料。在实验中，当我们将载有目标蛋白的混合物与带有相反电荷的离子交换材料进行接触时，目标蛋白会与离子交换材料发生吸附。之后，我们可以通过改变洗脱条件，例如改变pH值或离子浓度，来使目标蛋白从离子交换材料中洗脱。

大量纯化蛋白的简易步骤

纯化蛋白的简易步骤 纯化 1.配制培养基LB, 挑取菌种至含有抗生素的LB液体培养基中(50ml+1管菌种)，37 ℃ 220 rpm培养。 2.取10mL培养的菌液转接到1000 mL新鲜的LB抗性培养基中，37 ℃220 rpm培养至 OD600≈0.4-0.5。 3.将培养箱温度调至20℃，转速调至180rpm，继续培养约0.5h-1h（取出1mL菌液作为诱 导前对照）。之后加入1 M IPTG至终浓度为0.1-1 mM（本次实验的浓度为0.1mM），继续诱导培养大约9-10小时（取出1mL菌液作为诱导后对照）。 4.4℃，4000rpm离心，15min收集菌体。沉淀可冻于-80℃保存（做蛋白结晶尽量不要冻 存）。 5.配制buffer A，如下 6.加入适当的buffer A （含有100mM PMSF 1：100、10mg/mL Dnase 1: 1000、2M MgCl2 1:2000）。1000mL菌液收的菌，加入30mL即可，太少超声时容易起泡。 7.混匀后冰上放置20Min，期间不时的震荡。混合物使用液压破碎（比超声破碎好）。 8.离心10000rpm，4℃，45min，彻底去除菌体碎片，取上清备用。（一定不要菌体碎片！ 取4ul+4ulLB 作为binding前的对照） 9.Ni beads的预处理：取适量beads，加入适量的buffer A，如800uL beads（1000mL菌液 沉淀）加入1mL buffer A，800rpm，2.5min，洗3次。 10.将步骤6所得的上清与预处理好的beads加入50mL的离心管中，封口膜封口后，静音 混匀器4℃binding1-2h（时间过长蛋白易降解）。 11.将binding后的溶液过柱（取4ul+4ulLB 作为binding后的对照），加入10CV wash buffer， 放置10min后冲洗（取4ul+4ulLB 作为wash后的对照）。

蛋白质提取纯化的基本流程

蛋白质是生物体内一类非常重要的大分子有机化合物，承担着多种生物学功能。为了进行蛋白质的研究、分析或应用，科学家们需要从复杂的生物体系中提取和纯化目标蛋白质。蛋白质提取纯化的基本流程通常包括样品制备、裂解、离心、层析、电泳等步骤。下面是关于蛋白质提取纯化的基本流程的详细解释： ### **1. 样品制备：** 蛋白质提取纯化的第一步是样品的制备。这涉及到从生物体（细胞、组织等）中获得样品。样品的制备过程中要注意避免蛋白质的降解和损失。常见的样品包括细胞总蛋白、细胞膜蛋白、细胞器蛋白等。制备好的样品需要储存在低温下以防止蛋白质的降解。 ### **2. 裂解（细胞破碎）：** 样品制备完成后，下一步是裂解，也就是将生物体内的细胞或组织破碎，释放蛋白质。裂解可以通过机械破碎、超声波破碎、高压破碎等方法实现。同时，可以添加裂解缓冲液，其中可能包含蛋白酶抑制剂、还原剂等，以维持蛋白质的稳定性。 ### **3. 离心：** 裂解后的混合物通过离心可以分离成上清液和沉淀。离心是利用离心机产生的离心力，使样品中的颗粒沉降，从而实现液体和颗粒的分离。上清液中包含了可溶性的蛋白质，而沉淀中则包含了细胞核、细胞壁等。 ### **4. 层析（柱层析或凝胶层析）：** 层析是蛋白质提取纯化中的关键步骤之一。这一步旨在根据蛋白质的性质，通过将混合物在柱上或凝胶中进行分离。常见的层析方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性有选择性地分离目标蛋白质。 ### **5. 电泳：** 电泳是蛋白质分离和分析的重要手段。在电场作用下，蛋白质根据其电荷和大小在凝胶中迁移。蛋白质电泳分离可以用于检测样品的纯度、确定分子量等。常见的电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。 ### **6. 检测和分析：** 在蛋白质提取纯化的过程中，需要对提取得到的蛋白质样品进行检测和分析。常用的方法包括蛋白质定量、Western blotting等。这些方法可以用于确定提取得到的蛋白质是否符合预期，以及蛋白质的纯度和浓度等。 ### **7. 保存和存储：** 最后一步是保存和存储提取纯化得到的蛋白质样品。蛋白质样品应该以适当的方式存储，通常是在低温下。此外，还要考虑使用适当的缓冲液来保护蛋白质免受冻融等因素的影响。 ### **总结：** 蛋白质提取纯化是蛋白质学研究中至关重要的步骤之一。通过以上基本流程，科学家们可以从复杂的生物样品中高效、精确地提取和纯化目标蛋白质，为蛋白质研究提供了坚实的基础。在实际操作中，可以根据样品的来源、所需蛋白质的性质以及实验目的的不同，选择合适的方法和技术进行蛋白质提取纯化。

蛋白质分离纯化步骤

蛋白质分离纯化步骤 一、蛋白质分离纯化的一般原则 大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。 蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。 二、分离纯化蛋白质的一般程序 分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法

简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂

动物疫苗蛋白纯化方法

动物疫苗蛋白纯化方法 引言： 动物疫苗的研制和生产对于保护动物健康和人类食品安全具有重要意义。其中，疫苗蛋白的纯化是制备高质量疫苗的关键步骤之一。本文将介绍一些常用的动物疫苗蛋白纯化方法，包括离子交换层析、亲和层析、透析和凝胶过滤等。 一、离子交换层析法 离子交换层析法是一种常用的蛋白纯化方法，其基本原理是利用蛋白与离子交换树脂之间的电荷相互作用来分离和纯化蛋白。具体步骤包括样品预处理、样品加载、洗脱和洗脱物收集等。该方法适用于对蛋白表面电荷性质较为敏感的疫苗蛋白纯化。 二、亲和层析法 亲和层析法是利用蛋白与亲和基质之间的特异性相互作用来实现蛋白的分离和纯化。亲和基质可以选择与目标蛋白的特定结构域或标签结合的配体。例如，可以利用His标签与镍离子螯合树脂相互作用来纯化含有His标签的疫苗蛋白。亲和层析法具有高选择性和高纯化效率的优点，但需要提前对目标蛋白进行改造或标记。 三、透析法 透析法是一种通过溶液的渗透压差实现蛋白的分离和纯化的方法。该方法适用于分子量较大的疫苗蛋白，通过选择合适的膜孔径和透

析液浓度，可以使目标蛋白从混合溶液中被透析出来。透析法操作简单，适用范围广，但纯化效果较差，通常需要与其他纯化方法结合使用。 四、凝胶过滤法 凝胶过滤法是一种基于蛋白分子大小差异进行纯化的方法。通过将混合溶液通过合适孔径的凝胶过滤膜，可使较大分子的蛋白被滞留在膜上，而较小分子则通过膜孔。该方法适用于分子量较大的疫苗蛋白的初步纯化，但纯化效果有限，通常需要与其他纯化方法结合使用。 五、其他方法 除了上述常用的纯化方法外，还可以根据疫苗蛋白的特性选择其他适用的纯化方法，如亲水色谱层析、逆流层析、电泳等。这些方法在特定情况下能够发挥其优势，提高纯化效果。 结论： 动物疫苗蛋白的纯化是制备高质量疫苗的关键步骤之一。离子交换层析、亲和层析、透析和凝胶过滤等是常用的动物疫苗蛋白纯化方法。每种纯化方法都有其特点和适用范围，研究人员可以根据具体情况选择合适的方法或结合多种方法进行纯化，以获得高纯度的疫苗蛋白。通过不断改进和创新纯化方法，将有助于提高动物疫苗的质量和效果，为保护动物健康和人类食品安全做出贡献。

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，