分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识
分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。
外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。
一、基因工程的常用工具
（一）载体
载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。
质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。
常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。
（二）工具酶
工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。
限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分，Ⅱ型能严格识别核酸序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口分开端和粘端，产生3′－OH和5′－P末端。内切酶品种多，使用时应注意温度、缓冲液用量（一般1μg DNA/2-5单位酶）等反应条件。
连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最适温度37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度，一般平端连接用20-25℃，粘端连接用12℃左右。
聚合酶有DNA聚合酶（以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌体DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA为模板合成R NA，T7或T3噬菌体RNA聚合酶）；逆转录酶（以RNA为模板合成DNA，除RNA病毒中发现外，发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性）。
大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA
聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译（Nick translation）法标记核酸，也可用于DNA序列测定，修补DNA链等。
核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等，可水解相应的DNA和RNA，核酸酶S1可降解单链DNA 和RNA，用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。
末端转移酶在Mg2+存在下，选择3′－OH端单链DNA为引物加成核苷酸，在Co2+存在下，选择3′－OH端双链DNA为引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾（连接器）。
碱性磷酸酶去除5′－P，可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍，影响DNA分子之间的连接，一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团，在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接，再通过复制修复另一条链，使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率（图18-1）。
图18-1经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接
二、目的基因
常把需研究的基因称为目的基因，需分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法得到。简短的目的基因可在了解一级结构或通过了解多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列基础上人工合成。但多数的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反转录DNA）得到。CDNA通过各种方式与载体连接，克隆可得到全长cDNA或片段，用于探针制备、序列分析、基因表达等研究。因此以cDNA为研究材料反映了mRNA的转录及对以后翻译的影响情况，即反映某一基因（DNA）外显子的情况。（图18-2）
图18-2目的基因cDNA的合成
三、基因库的建立
建立基因库的目的是为了便于目的基因的保存、扩增和纯化。基因库是利用工具酶，通过基因重组技术和转化、筛选而建立，也是基因克隆的过程。实际上是利用低等生物如细菌、病毒、噬菌体等生长快，繁殖力强的特点，而作为一种核酸扩增筛选的载体，把人类等高等生物的基因或其片段用工具酶插入，重组于其中，经筛选，克隆得到目的基因与载体重组的重组基因，成为便于保存，取用方便的基因库。基因库交流是研究室之间交流目的基因的常用方式。
（一）基因重组
基因重组方案很多，简单的可用同一种限制性内切酶分别在载体和目的基因切出相对应的切口，便于连接。也可用末端连接酶合成连接器（图18-3）。近年，Okayama方案为实验室普遍采用，该方法可得到全长的cDNA。
（二）转化
转化目的是把有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞（大肠埃希菌），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。实验步骤介绍如下：
图18-3基因重组方案之一
⒈大肠埃希菌的处理（增加细胞膜通透性，便于基因进入细胞）大肠埃希菌（E.Coli cells）接种于L
b agar培养基，37℃培养一晚。挑选3~5个大菌落，接种于50ml LB培养基，37℃，振摇培养一晚后，在A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为细菌对数生长期），野生型（rec＋，5x107cells/ml）为0.2-0. 3，缺陷型（rec-，5x107cells/ml）为0.5-0.6。离心弃去上清液，用20ml，50mmol/L，CaCl2悬浮菌体。冰浴20分钟，低温离心。弃上清液，用2.5ml冰50mmol/l CaCl2悬浮。4℃可保存48小时，用于转化，称competent cells。
⒉质粒（如经基因重组建立的重组质粒，基因库等）的转化将competent cells（以美国BRL公司D H10B菌株为例）置冰水浴。同时将Falcon2059（传热系数稳定）塑料试管置冰水浴。取100μl菌液（D H10B）于2059试管中，加10倍稀释的巯基乙醇1μl，冰浴轻摇2分钟，放置10分钟。取0.1-50ng质粒加入试管，轻轻摇匀，冰浴30分钟。此间备好42℃水浴。并将SOC培养基置42℃备用。将试管置于42℃，轻摇45秒钟，马上置冰浴2分钟。使competent cells热胀冷缩，把质粒导入菌体。加42℃SOC培养基0.9ml于试管，37℃培养1小时。1000rpm离心10分钟，弃上清液，用200μlSOC培养基悬浮菌体。接种于LB-氨芐青霉素（100U/ml）培养皿，37℃培养一晚。已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）。在了解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。并在LB培养液中扩大培养。基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。
LB培养基（1L）：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g NaCl，高压灭菌，pH7.5。
SOB培养基（1L）：20g蛋白胨，5g酵母膏，0.5g NaCl，高压灭菌。另外准备2mol/L镁溶液（1m ol/L氯化镁与1mol/L硫酸镁等量混匀，过滤灭菌），临用前加1ml于100ml培养基。
SOC培养基（100ml）：临用前加入1ml过滤灭菌的2mol/L葡萄糖。
四、核酸的分离与纯化
核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞；多种标本中，如血液、组织、唾液、尿液等其它来源的标本。因此分离方法复杂而多样。又因各种DNA、RNA的丰度差异，各种分析方法对核酸的纯度与量的要求有差异，因此在实验前应对采用的方法有所了解和选择。总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。溶解细胞的方法因标本不同而不同，有用SDS加NaOH，有用蛋白酶，有的用超声波破碎等方法，苯酚提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。实验上生物标本中含量最多的就是蛋白质。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心回收核酸，然后用70％-80％乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。为了得到纯的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用RNA酶除去RNA，得到纯的D NA，用DNA酶除去DNA而获得RNA。目前开发了许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA。其分离原理有的利用核酸的分子量差异，有的利用需分离核酸的特点与其特异性结合达到分离、回收的目的。
（一）质粒的分离与纯化
含质粒的E. Coli cells经LB培养液250ml扩大培养，倒入50ml离心管，4℃，3000rpm，离心15分钟。弃去上清液。（弃去液丢弃前应作消毒处理，以免污染环境）。加lysis buffer(50mmol/L Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris-HCl，pH8.0)1-2ml使之悬浮。放置室温5分钟，加3.5-7ml新配制SDS /NaOH溶液（1mol/l NaOH 8ml，20％SDs 2ml，蒸馏水30ml）上下摇匀，置冰水浴5分钟。禁用混匀器，以免DNA分子断裂），加2.5mol/L醋酸钾缓冲液（pH4.8）2.6-5.2ml，上下摇匀，冰浴5分钟。4℃，3000rpm，离心15分钟。沉淀蛋白质。取上清液，加无水乙醇12-24ml（上清液的二倍）放室温15分钟后，10000rpm离心，弃上清液。加约为沉淀物体积的0.4倍TE（10mmol/l Tris-Hcl pH8.0，10mmol/l EDTA）溶解沉淀后，加0.2倍的7.5mol/L醋酸铵。可用混匀器混匀，置冰浴10分钟。4℃，10000rpm 离心5min，弃上清液。加沉淀物0.4倍的10mmol/l Tris-HCl pH7.5，10mmol/l EDTA缓冲液，1/10体积的5mg/ml RNase，37℃，30分钟保温。加等量的phenol（酚）/CIAA(480ml氯仿，20ml异戊醇)，混匀。4℃，10000rpm，离心5分钟。取上层液加酚/CIAA重复一次。取上层液加1/10体积5mol/l NaCl和2倍无水乙醇，―20℃过夜或―70℃2小时以上。4℃，10000rpm，离心10分钟，弃上清液。加80％乙醇不摇动，直接10000rpm离心，弃上清液，真空干燥。加适量（约200μl）TE溶解。测定含量后备用。
（二）重组质粒中目的基因的分离与纯化
先取少量纯化的重组质粒，用限制性内切酶切出目的基因，经电泳分离，确认。以200μl含2mg DN A（重组质粒）为例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性内切酶，1/10体积缓冲液，1-2小时保温。缓冲液种类和酶反应温度因内切酶种类而异。1/10体积3mol/l NaAc，2倍无水乙醇，－70℃，2小时（－20℃过夜），10000rpm，10分钟离心，弃上清液（乙醇沉淀）。适量TE溶解沉淀（切断的DNA质粒与目的基因混合物），电泳分离（用相应分子量DNA标准同时电泳），在紫外光下观察结果，与标准DNA分子量比较，确认目的基因和内切酶的切割效果。
⒈电泳条件：
X50TAE：Trisma base 54g；乙酸57.1ml；0.5m EDTA pH8.0 20ml；蒸馏水至1000ml。
EB：10mg/ml ethidium bromide。(EB有致癌性，操作应小心)。
经电泳确认后，取适量DNA（重组质粒）同上条件切开，用1.5％低熔点（＜65℃熔解）琼脂糖凝胶，电泳分离。在紫外光下，切出含目的基因区带（凝胶），放入离心管中，提取纯化。
⒉从低熔点凝胶提取，纯化DNA片段加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmo l/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mo l/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。
（三）标本DNA的分离与纯化
用5-10ml 1xNTE(NaCl 100mmol/L ,Tris-HCl 10mmol/l pH7.4，EDTa 1mmol/L pH8.0)调整细胞为2×107个（组织应切碎置液氮冰冻，高速搅切成粉末后，加入缓冲液）。加1/10-1/20体积（V）10mg/ml 蛋白酶（Sigma Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃2小时。加等量酚/3xNTE(3xNTE上封)混匀（至少7分钟）。4℃，3000rpm，10分钟。取上清液，加2ml TE(Tris-HCl 10mmol/L pH7.5，EDTa 1mmol/L pH 8.0)，充分混匀。乙醇沉淀。2mlTE溶解沉淀。加1/30xNTE，蛋白酶K(10mg/ml)代替蛋白酶重复2-4步骤。测定含量。
（四）样品RNA的分离，纯化
含106个细胞液加等量纯化溶液[4mol/L胍基硫氰酸盐，25mmol/L柠檬酸pH7.0，0.5％肌氨酸（sarc osyl），0.1mol/l 2-巯基乙醇]。总体积为细胞沉淀4-5倍，混匀。加0.1体积2ml/L乙酸钠（pH4.1），1体积酚（重蒸水上封），0.2体积CIAA，混匀器剧烈混合10秒钟。冰水浴15分钟。10000xg4℃，20分钟。离心（不用刹车）。小心取出上清液。加等量丙酮（或2倍乙醇），－20℃，60分钟以上。10000xg，4℃，20分钟离心。弃上清液。用1.5ml离心管约加0.3ml纯化溶液，重复3)步骤，离心10分钟，弃上清液。加75％乙醇，10000xg，4℃，10分钟离心。弃上清液。真空干燥15分钟，备用。
五、探针制备
探针制备就是目的基因的标记，核酸标记方法常用的有缺口平移法、随机引物法、末端标记法等。标记物质有放射性元素（如32P等）和非放射性物质（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸标记同位素，被标记的dNTP本身就带有磷酸基团，便于标记，特点是比活性高，可达9000Ci/mmol；发射的β射线能量高，可达1.70MeV，用它标记的探针自显影时间短，灵敏度高。32P的半寿期为14天，应随标随用，一般标记后，在一周内使用，它虽带来不便，但给使用后废弃物处理减轻了压力。使用32P标记物应注意防护，操作时应有1-1.5cm厚聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃隔离保护，避免直接照射。操作人员胸前应佩带个人计量器，定期检测。结束实验后，应用专用探测器（盖革-米勒检测器），检查工作区域、手、衣服等，以免污染发生。其它同位素标记物，同样应注意放射线防护。
非放射性标记有酶标和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似，只是被标记的核酸代替了被标记的抗体，事实上被标记的抗体也称为探针，阅读文献时应加以注意。现有许多商品是生物素（biotin）、地高辛标记的，如生物素-dUTP、生物素-dATP、地高辛-dUTP等。血凝素（avidin）与生物素有非常高的亲和性，当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶（血凝素-酶），经杂交反应最终形成：探针-生物素-血凝素-酶复合物（ABC法）。酶催化底物显色，观察结果。与一般的酶反应底物不同，ABC法底物显色后为不溶物，以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差、成本高，但便于运输保存，灵敏度与放射物标记相当。化学物标记有的也是利用相应酶标抗体形成特异复合物，与上述方法相当，有的则可自发光。化学标记法简单、成本低，但灵敏度相对较低。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验指
DNA分离 核酸包括DNA、RNA两种分子在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在。真核生物的染色体DNA为双链线性分子；原核生物的"染色体"、质粒及真核细胞器DNA为双链环状分子；有些噬菌体DNA有时为单链环状分子；RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核自由RNA分子多数在3'端带有ploy(A)结构。至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。 95%的真核生物DNA主要存在于细胞核内，其它5%为细胞器DNA，如线粒体、叶绿体等。RNA分子主要存在于细胞质中，约占75%，另有10%在细胞核内，15%在细胞器中。RNA以rRNA 的数量最多(80%~85%),tRNA及核内小分子RNA占10%~15%，而mRNA分子只占1%~5%，mRNA分子大小不一,序列各异。总的来说，DNA分子的总长度一般随着生物的进化程度而增大，而mRNA 的分子量与生物进化无明显关系。 分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求,因为遗传信息全部贮存在一级结构之内。核
酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。 核酸的纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时,应去除RNA分子，反之亦然。 实验过程中注意事宜: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行；③减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。机械剪切力包括强力高速的溶液震荡、搅拌,使溶液快速地通过狭长的孔道；细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式的破裂以及DNA样品的反复冻贮。这些操作细节在实验操作中应备加注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA。对分子量小的环状DNA分子，如质粒DNA及RNA分子,威胁相对小一些。高温,如长时间的煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的有些化学键也有破坏作用。核酸提取过程中,常规操作温度为0~4℃,此温度环境降低核酸酶的活性与反应速率,减少对核酸的生
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
分子生物学基础知识要点
Northern blot：是DNA/RNA的杂交，它是一项用于检测特异性RNA的技术，RNA混合物首先按照它们的大小和相对分子量通过变性琼脂糖凝胶电泳加以分离，凝胶分离后的RNA 通过southern印迹转移到尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与标记的探针进行杂交反应，通过杂交结果分析可以对转录表达进行定量或定性。它是研究基因表达的有效手段。与Southern blot 相比，它的条件更严格些，特别是RNA容易降解，前期制备和转膜要防止Rnase的污染。实验步骤：1.用具的准备2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染3．制胶4. RNA样品的制备5.电泳6.转膜7.探针的制备8.探针的纯化及比活性测定9．预杂交10．探针变性11．杂交12．洗膜13．曝光14．去除膜上的探针15．杂交结果 半定量PCR要求比普通PCR更严格一些，另外往往通过转膜后的同位素杂交检测或凝胶成像后的灰度测定比较样品间的差异。 半定量RT-PCR一般是在没有条件做实时PCR 的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因（如β-actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个β-actin的内参照对照。 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1．实时荧光定量PCR无需内标 2．内标对实时荧光定量PCR的影响 Sybr green（荧光染料掺入法）和Taqman probe（探针法） 检测两种蛋白质相互作用方法 1共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析 2蛋白质亲和色谱基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。 3免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高4 Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 1.酵母双杂交 2.GSTpull-down实验 3.免疫共沉淀 4.蛋白质细胞内定位 RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法 1.此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有 利用价值的信息 2.节约了实验所花费的经费和时间。 3.只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长 基因特异性引物（GSPs）应该是： 23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 注意事项 1.cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高
分子生物学实验项目三
分子生物学实验项目三
实验三植物基因组DNA的提取 实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。 实验原理 利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。 仪器、材料与试剂 （一）仪器 1低温离心机 2 恒温水浴锅 3 台式离心机 4 琼脂糖凝胶电泳系统 5 微量加样器 （二）材料与试剂 1 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 2 乙二胺四乙酸（EDTA） 3 氯化钠（Nacl） 4 β-巯基乙醇 5 氯化钾（KCl） 6 异丙醇
7 乙醇 8 琼脂糖 9 十二烷基硫酸钠（SDS） 10 50mL离心管 11陶瓷研钵 12 吸头、小指管 13 细胞提取液 100mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 5 mmol/L EDTA(PH 8.0) 500 mmol/L Nacl 1.25% SDS 1 mmol/L β-巯基乙醇 14 5 mol/L KCl 15 TE缓冲液 10 mmol/L Tris.HCl(PH 8.0) 1 mmol/L EDTA(PH 8.0) 16 哥伦比亚野生型拟南芥（Arabidopsis Columbia）三周幼叶。 17 TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）。 实验步骤 一、自配试剂提取步骤
1 取4g新鲜叶片，在液氮中充分研磨成粉末状（越细越好）。 2 将研磨好的粉末转移至50mL的离心管中，加入16mL细胞提取液，充分混匀，65℃水浴保温20min。 3 从水浴中取出离心管，加入5mL5mol/L的KCl溶液，混匀，冰浴20min。 4 4000r/min离心20min。 5 降上清液转移到另一50mL的离心管中。 6 加等体积的酚/氯仿混匀，12000 r/min离心5min，取上清。 7 加等体积氯仿，混匀，12000r/min离心5min，取上清。 8 加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀。 9 离心获得沉淀，加70%乙醇洗涤3次，风干沉淀。 10加入500μLTE缓冲液，溶解DNA。 11取3 mL上清液，琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。 二植物基因组DNA提取试剂盒提取步骤 1、拟南芥基因组DNA的提取 以野生型拟南芥(Arabidopsis Columbia)2周幼叶为材料（称取叶片约100毫克），用TIANGEN基因组DNA提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit）（离心柱型）按以下步骤提取基因组DNA： 1) 取干净幼叶100mg，加入液氮充分研磨。 2) 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴中20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数
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【期末复习总结】基础分子生物学 基础分子生物学 第一章 1. DNA的发现 Avery的肺炎双球菌转化实验 Hershey和Chase的噬菌体侵染细菌试验 2. 基因工程操作的工具 限制性内切酶。DNA连接酶。运载体。 3. 原核生物的基因组和染色体结构都比较简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。 真核生物转录和翻译过程在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。其基因表达调控主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA 剪辑3个方面。 弟一早 1. 原核细胞染色体： 一般只有一条大染色体且大都带有单拷贝基因，除少数基因外（如rRNA基因）。整个染色体DNA儿乎全部由功能基因和调控序列所 组成。 几乎每个基因序列都与它所编码蛋白质序列呈线性对应关系。
2. 真核生物 真核生物染色体中相对分子质量一般大大超过原核生物，并结合有大 量的蛋白质DNA具体组成成分为：组蛋白、非组蛋白、DNAo 其蛋白质与相应DNA的质量之比约为2:lo 5. 组蛋白 组蛋白是染色体的结构蛋白，其与DNA组成核小体。根据其凝胶电泳 性质可将其分为HL H2A、H2B、H3及H4。 6. 组蛋白的特性： 进化上极端保守性。其中H3、H4最保守，H1较不保守。 无组织特异性. 肽链上氨基酸分布的不对称性. 组蛋白的修饰作用。包括甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。 富含赖氨酸的组蛋白H5. 7. 非组蛋白 色体上除了存在大约与DNA等量的组蛋白以外，还存在大量的非组蛋白。 组蛋白的量大约是组蛋白的60%?70%,非组蛋白的组织专一性和种属专一性。 组蛋白包括酶类、骨架蛋白、核孔复合物蛋白以及肌动蛋白、肌球蛋白等。它们也可能是染色质的组成成分。 类常见的非组蛋白： HMC蛋白。一般认为可能与DNA的超螺旋结构有关。
分子生物学知识点归纳
分子生物学 1．DNA的一级结构：指DNA分子中核苷酸的排列顺序。 2．DNA的二级结构：指两条DNA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构以及四股螺旋结构。3．DNA的三级结构：双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超螺旋结构。 4．DNA的甲基化：DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化。甲基化修饰在原核生物DNA中多为对一些酶切位点的修饰，其作用是对自身DNA产生保护作用。真核生物中的DNA甲基化则在基因表达调控中有重要作用。真核生物DNA中，几乎所有的甲基化都发生于二核苷酸序列5’-CG-3’的C上，即5’-mCG-3’. 5．CG岛：基因组DNA中大部分CG二核苷酸是高度甲基化的,但有些成簇的、稳定的非甲基化的CG小片段,称为CG岛,存在于整个基因组中。“CG”岛特点是G+C含量高以及大部分CG二核苷酸缺乏甲基化。 6．DNA双螺旋结构模型要点： （1）DNA是反向平行的互补双链结构。 （2）DNA双链是右手螺旋结构。螺旋每旋转一周包含了10对碱基，螺距为3.4nm. DNA 双链说形成的螺旋直径为2 nm。每个碱基旋转角度为36度。DNA双螺旋分子表面 存在一个大沟和一个小沟，目前认为这些沟状结构与蛋白质和DNA间的识别有关。（3）疏水力和氢键维系DNA双螺旋结构的稳定。DNA双链结构的稳定横向依靠两条链互补碱基间的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持。 7．核小体的组成： 染色质的基本组成单位被称为核小体，由DNA和5种组蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4共同构成。各两分子的H2A,H2B,H3和H4共同构成八聚体的核心组蛋白，DNA双螺旋缠绕在这一核心上形成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠样结构。 8．顺反子（Cistron）：由结构基因转录生成的RNA序列亦称为顺反子。 9．单顺反子（monocistron）：真核生物的一个结构基因与相应的调控区组成一个完整的基因，即一个表达单位，转录物为一个单顺反子。从一条mRNA只能翻译出一条多肽链。10．多顺反子(polycistron): 原核生物具有操纵子结构，几个结构基因转录在一条mRNA 链上，因而转录物为多顺反子。每个顺反子分别翻译出各自的蛋白质。 11．原核生物mRNA结构的特点: (1) 原核生物mRNA往往是多顺反子的，即每分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息。 （2）mRNA 5‘端无帽子结构，3‘端无多聚A尾。 （3）mRNA一般没有修饰碱基。 12．真核生物mRNA结构的特点： （1）5‘端有帽子结构。即7－甲基鸟嘌呤－三磷酸鸟苷m7GpppN。 （2）3‘端大多数带有多聚腺苷酸尾巴。 （3）分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化。 （4）分子中有编码区和非编码区。 14．tRNA的结构特点 （1）tRNA是单链小分子。 （2）tRNA含有很多稀有碱基。 （3）tRNA的5‘端总是磷酸化，5’末端核苷酸往往是pG. （4）tRNA的3‘端是CCA－OH序列。是氨基酸的结合部位。 （5）tRNA的二级结构形状类似于三叶草，含二氢尿嘧啶环（D环）、T环和反密码子环。
分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
基础分子生物学(生物科学专业用)
基础分子生物学 三、选择题 1、RNA 合成的底物是------ ---------。 A dATP, dTTP , dGTP , d CTP BATP, TTP , GTP , CTP C ATP ,GTP, CTP,UTP D 、GTP, CTP,UTP，TTP 2．模板DNA的碱基序列是3′—TGCAGT—5′，其转录出RNA碱基序列是：A．5′—AGGUCA—3′ B．5′—ACGUCA—3′ C．5′—UCGUCU—3′ D．5′—ACGTCA—3′ E．5′—ACGUGT—3′ 3、转录终止必需。 A、终止子 B、ρ因子 C、DNA和RNA的弱相互作用 D上述三种 4、在转录的终止过程中，有时依赖于蛋白辅因子才能实现终止作用，这种蛋白辅因子称为---- -----。 A σ因子 B ρ因子 C θ因子 D IF因子 5．识别RNA转转录终止的因子是： A．α因子 B．β因子 C．σ因子 D．ρ因子 E．γ因子 6．DNA复制和转录过程有许多异同点,下列DNA复制和转录的描述中错误的是： A．在体内以一条DNA链为模板转录，而以两条DNA链为模板复制 B．在这两个过程中合成方向都为5′→3′ C．复制的产物通常情况下大于转录的产物 D．两过程均需RNA引物 E．DNA聚合酶和RNA聚合酶都需要Mg2+ 7、核基因mRNA 的内元拼接点序列为。 A、AG……GU B、GA……UG C、GU……AG D、UG……GA 8、真核生物mRNA分子转录后必须经过加工，切除---------，将分隔开的编码序列连接在一起，使其成为蛋白质翻译的模板，这个过程叫做RNA的拼接。 A 外显子 B 启动子 C 起始因子 D 内含子 9、在真核生物RNA polⅡ的羧基端含有一段7个氨基酸的序列，这个7肽序列为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser ,被称作。 A C末端结构域 B 帽子结构 C Poly(A)尾巴 D 终止子 10．真核生物RNA的拼接需要多种snRNP的协助，其中能识别左端（5’）拼接点共有序列的snRNP 是： A．U1 snRNP B．U2 snRNP C．U5 snRNP E．U2 snRNP+ U5 snRNP 四、是非题 1、所有的启动子都位于转录起始位点的上游。（ X ） 2、RNA分子也能像蛋白酶一样，以其分子的空间构型产生链的断裂和和合成所必须的微环境。（对） 3、真核生物的mRNA中的poly A 尾巴是由DNA编码，经过转录形成的。（ X ） 4、在大肠杆菌RNA聚合酶中，β亚基的主要功能是识别启动子。（ X ） 5、所有起催化作用的酶都是蛋白质。（ X ） 五、问答题
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验基础
分子生物学实验基础 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（transforma tion）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（p lasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。
分子生物学知识点
分子生物学知识点Last revision on 21 December 2020
一、名词解释： 1. 基因：基因是位于染色体上的遗传基本单位，是负载特定遗传信息的DNA片段，编码具有生物功能的产物包括RNA和多肽链。 2. 基因表达：即基因负载遗传信息转变生成具有生物学功能产物的过程，包括基因的激活、转录、翻译以及相关的加工修饰等多个步骤或过程。 3.管家基因：在一个生物个体的几乎所有组织细胞中和所有时间段都持续表达的基因，其表达水平变化很小且较少受环境变化的影响。如GAPDH、β-肌动蛋白基因。 4. 启动子：是指位于基因转录起始位点上游、能够与RNA聚合酶和其他转录因子结合并进而调节其下游目的基因转录起始和转录效率的一段DNA片段。 5.操纵子：是原核生物基因表达的协调控制单位，包括有结构基因、启动序列、操纵序列等。如：乳糖操纵子、色氨酸操纵子等。 6.反式作用因子：指由其他基因表达产生的、能与顺式作用元件直接或间接作用而参与调节靶基因转录的蛋白因子（转录因子）。 7.顺式作用元件：即位于基因附近或内部的能够调节基因自身表达的特定DNA序列。是转录因子的结合位点，通过与转录因子的结合而实现对真核基因转录的精确调控。 8. Ct值：即循环阈值（cycle threshold，Ct），是指在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数。（它与PCR扩增的起始模板量存在线性对数关系，由此可以对扩增样品中的目的基因的模板量进行准确的绝对和（或）相对定量。） 9.核酸分子杂交：是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来源不同但互不配对的核酸单链（包括DNA和DNA，DNA和RNA，RNA和RNA）相互结合形成杂合双链的特