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液相色谱分离蛋白基本原理

HPLC分离模式

正相液相色谱（Normal Phase Liquid Chromatography）：利用不同组分分子极性不同，与极性固定相作用的差异，达到分离鉴定的目的。

反相液相色谱（Reverse Phase Liquid Chromatography ）：利用不同组分分子极性不同，与非极性固定相作用的差异，达到分离鉴定的目的。

?凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatogrephy）：利用某些凝胶对于不同分子大小

的组分阻滞作用的不同。

?离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography）：利用不同组分对离子交换剂结合

能力的不同，使之分离。

?亲和色谱（Affinity Chromatography )利用亲和配体与生物分子之间亲和力的大小，

将生物分子进行分离。

按色谱的使用目的分类

?分析色谱：目的是获得混合物中各组分的信息，要求色谱灵敏度高、分辨率高、快

速、方便和灵活。

?制备色谱：主要是在单位时间内获得一定量的、符合纯度要求的物质，要求进样量

大。可通过加样体积过量，而浓度不变或样品浓度过量，而体积不变两种方式来实现。

各类色谱的基本原理

（一）正相（Normal Phase）色谱

?正相色谱是指固定相为极性物质，流动相为非极性(或弱极性)物质的一种操作模式。

?这是一种根据分子的极性大小将其分离开来的液相色谱技术，因其以吸附效应作为

分离的基础，也有人称其为吸附色谱。

?在正相HPLC中的洗脱顺序:在正相HPLC中，非极性分子先被洗脱，极性分子则

后被洗脱

（二）反相（Reverse Phase）色谱

?反相色谱是以非极性表面的载体为固定相，以比固定相极性更强的溶剂系统为流动

相的一种液相色谱分离形式。

?反相色谱固定相也以硅胶为基质，但通常在其表面键合上疏水基团，样品中的不同

组分和这类疏水基团之间有不同的疏水作用。

?极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的载体的相互作用较弱，因此较快流出，反

之，极其疏水的分子就会和基质有较强的相互作用，在柱内保留的时间较长。

?在反相柱上，混合物中的各个组分是根据其疏水性的差异得以分离。多肽混合物可

行线性梯度洗脱而被分开（双泵系统）。

?反相HPLC也可以运行等度（isocratic）模式进行洗脱。此时，洗脱溶剂是始终不

变的（单泵系统）。

在反相HPLC中的洗脱顺序:在反相HPLC中极性分子先被洗脱，而非极性分子后被洗脱（三）凝胶过滤色谱

凝胶过滤色谱，又称排阻色谱或分子筛色谱。当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。

凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，存在两种运动，即垂直向下的移动和无定向的扩散运动。比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。

（四）离子交换色谱

?是用离子交换剂作为固定相的色谱分离模式，是根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的

?离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团.

?含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，本身带负电；含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-，本身带正电。

根据不同组分在给定的pH条件下，离子荷电情况（荷电性质及数量）的不同将其分离的一种色谱技术。若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。

当物质在树脂上结合的牢固程度即结合力大小有差异时，选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。

（五）亲和色谱

生物体中许多大分子化合物具有和与其结构相应的分子相结合的特性，这种结合称为亲和结合或称为亲和力。这种结合既是特异性的，又是可逆性的。

亲和层析就是利用生物大分子间这种既特异性的又可逆性的亲和吸附和解离特性而设计的纯化生物大分子的层析方法

常见的有专一亲和力的生物分子对有抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。

亲和色谱的特点

?亲和色谱可在温和地条件下进行，过程简单，纯化的倍数可达几千倍级，活性物质

的回收率非常高，对含量极少又不稳定的生物活性物质极为有效。

?亲和色谱必须要有特异的亲和配体，事实上，不是任何生物大分子间都具有特异的

亲和力，有合适当亲和配体；而且，亲和层析针对某一被分离物就要制备一种专门的吸附剂和寻找一种层析条件。因此，其应用受到一定的限制。

常用的液相色谱的实验技术

液相色谱的主要步骤

?色谱介质（固定相）的选择：

?色谱介质的处理：

?装柱：色谱柱的选择

?上样：样品的预处理

?加样

?洗脱：洗脱液的选择

?洗脱方式方法

?样品的收集和鉴定

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。（二）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。二.实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。表1色谱柱测试条件如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。

三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四.实验步骤 1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm；进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。五.实验结果

蛋白质的提取和分离专题训练

蛋白质的提取和分离专题训练一．选择题 1．下列有关蛋白质的提取和分离的操作，其中排序正确的是()。 A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 2．下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作不正确的是()。 A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐 B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面 C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱 3．在蛋白质的提取和分离中，下列对样品处理过程的分析正确的是()。 A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的结果 C．洗涤过程选用质量分数0.1%的NaCl溶液(生理盐水) D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 4．下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是()。 A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞 C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液 5．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列叙述不正确的是()。 A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离 B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质 C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质 D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质 6．凝胶色谱法分离蛋白质时使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(SephadexG—75)，其中G、75的含义分别是()。 A．G表示凝胶的使用量，75表示加75 g水 B．G表示凝胶的交联程度，75表示需加热75 ℃ C．G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7.5 g D．G表示凝胶的膨胀体积，75表示每克凝胶膨胀后体积可达75 cm3 7．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()。 A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快 8．下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是()。 A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心 B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌 C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离 D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h 9．下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的原因的是()。 A．分子带电性质的差异B．分子的大小C．分子的形状D．分子的变性温度10．下列有关提取和分离血红蛋白的程序叙述错误的是()。 A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B．通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 11．下列有关蛋白质提取和分离的叙述中，错误的是()。 A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性 B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来 C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离 D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极移动

蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质的分离纯化和表征第一节蛋白质的酸碱性质各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。第二节蛋白质分子的大小与形状

一、根据化学组成测定最低相对分子质量假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。二、渗透压法测定相对分子质量三、沉降分析法测定相对分子质量

基本原理：（一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。（二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

高效液相色谱法测定甲硝唑的含量

实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含量一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。二、实验原理高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。三、实验内容（一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。（二）实验内容 1、色谱操作条件的制定：色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）；流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80）流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立（1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤

蛋白质纯化的方法选择

蛋白质纯化的方法选择随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。

蛋白质的分离纯化方法(参考资料)

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最

高效液相色谱法测定有机化合物的含量

实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作（1）样品与流动相的处理配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。（2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液洗液一般为：50%的甲醇。

蛋白质的提取与纯化

蛋白质的提取与纯化一，蛋白质的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等

中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。二、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

蛋白质分离与纯化教学设计课题

蛋白质分离与纯化教学设计一、教学背景分析【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。【学情分析】到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。二、教学目标【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。【能力目标】运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。三、教学重难点

【教学重点】从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。【教学难点】样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。四、实验实施准备【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。五、教学方法【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法【学法】自主学习法、合作交流法六、教学媒体黑板、多媒体七、课时安排两个课时（80min）一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法；另一课时用来进行实验。

高效液相色谱原理

高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理 1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法

其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。

HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分

配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。

中图版高中生物选修1 6.1蛋白质的提取和分离_教案设计1

蛋白质的提取和分离【教学目标】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。 3．尝试提取和检测牛奶中的酪蛋白。 4．尝试卵清蛋白的分离。【教学重难点】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。【教学过程】一、蛋白质分离提纯技术 1．将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到高纯度的、甚至是单一种类的蛋白质。 2．蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中，电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。二、电泳技术及分离蛋白质的原理 1．电泳现象：带电粒子在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。电泳常用的支持物是聚丙烯酰胺凝胶，由此而来的技术称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2．电泳技术分离蛋白质的原理：（1）蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。（2）蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，则移动越快。（3）不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。将这些带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中的蛋白质做进一步的分离。如果待测洗脱液不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质。如果待测洗脱液还能再分离，则这个带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。三、血清蛋白的提取和分离 1．新鲜血液在体外凝固后，会析出清亮的淡黄色液体——血清。血清中含有丙种球蛋白、

凝集素等多种蛋白质。 2．过程：（1）点样：取新制血清与蔗糖溶液及溴酚蓝指示剂等体积混匀后，小心加到电泳样品槽的胶面上。（2）电泳。（3）染色：取出凝胶，放入质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液中。染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min。（4）脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液浸泡漂洗数次，每隔1~2h更换脱色液，直至底色脱净，背景清晰。（5）制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3~4h，然后放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳谱带。四、其他蛋白质的提取与分离 1．牛奶中酪蛋白的提取与检测：当pH=4.8时，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。用酒精除去酪蛋白沉淀中的脂肪后，即得到纯的酪蛋白。酪蛋白中含有酪氨酸，能与米伦试剂起颜色反应，首先生成白色沉淀，加热后变成红色。 2．卵清蛋白质的分离：选取鸡、鸭、鹅、鹌鹑等动物的新鲜卵清做实验材料。采用电泳法分离卵清蛋白质。自主思考：可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断早期癌变？提示：可以。只需从早期患者的尿液、血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品，采用蛋白质指纹图谱技术，就可以更加快速、简便、准确地对细胞癌变做出诊断。探究一：蛋白质的分离原理问题导引：为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混在一起。要获得纯净的丙种球蛋白，就必须进行提取和分离。你能提供分离蛋白质的思路吗？提示：可根据蛋白质各种特性的差异，如分子的大小、所带电荷的性质和多少等来分离不同种类的蛋白质。名师精讲：蛋白质的分离方法：

蛋白质的提取与分离

蛋白质提取与制备具体操作方法 1、原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失。 ⑵物理方法主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

高效液相色谱法基本原理

高效液相色谱法基本原理一、实验目的 1. 了解高效液相色谱法分离的基本原理； 2. 了解高效液相色谱仪的基本构造； 3. 了解高效液相色谱仪的基本操作。二、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。高效液相色谱分析原理：（一）高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。（二）高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分Ｂ的分配系数介于Ａ，Ｃ之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。三、系统构成 1.主机：Waters Allance 2695高效液相色谱仪,分为①分离单元Allance2695；②紫外－可见检测器2487；③荧光检测器2474；④示差折光检测器2414。 2.操作控制系统：DELL Dimmsen 4550微机；Waters Millunnium32 V4.0 色谱管理器软件。 3.打印机：HP LaserJet 1000激光打印机。四、实验步骤 1. 系统开机准备

【实验操作】蛋白质的提取和分离实验操作

优选精品资源欢迎下载选用实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。