色谱分析法概论
第17章
色谱分析法概论
思考题
9．试推导有效塔板数与分离度的关系式： 2
2116??
?
??-??ααR n ＝有效
证明：∵ 2
'
2216R t n W ??
? ???
有效＝
(1) 2
2
W W +R2R112(t -t )
R ＝
设W 1=W 2 2
2''
2010212222[()()]2()22R R R R t t t t t t W W W W ----==+R2R112(t -t )R ＝ ''1R t R
-R22t W ＝ (2)
将（2）代入（1）式，得：
'22
'
'2222221
'''221'1
1616()16()11R R R R R R R t t t n R R R t t t t αα???==?? ?--??-有效＝
10. 试推导最小板高的计算式：BC A H 2+＝最小 证明：∵B
H A Cu u
=++ (1) 微分，得
2dH B C du u =-+ 令 0dH
du
=，则
2
0B
C u -
+=
opt u =
(2) 将（2）代入（1），得：
H A =+最小
习题
1.在一根
2.00m 的硅油柱上分析一个混合物得下列数据：苯、甲苯及乙苯的保留时间分别为80s 、122s 、181s ；半峰宽为0.211cm 、0.291cm 及0.409cm(用读数显微镜测得)，已知记录纸速为1200mm/h ，求此色谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板高度。 解：∵2
2
/1)(
54.5W t n R = 注意：分子分母单位应保持一致 mm n L H W t n R 3.28852000,8853600
/120011.28054.554.52
2
2/1＝＝＝）（
＝）（＝苯苯苯
苯苯=
mm n L H W t n R 8.110822000,10823600
/120091.212254.554.52
2
2/1＝＝＝）（
＝）（＝甲苯甲苯甲苯
甲苯甲苯=
mm n L H W t n R 7.112062000,12063600
/120009.418154.554.52
2
2/1＝＝＝）（
＝）（＝乙苯乙苯乙苯
乙苯乙苯=
2.在一根
3.0m 长的色谱柱上分离样品的结果如图17－14所示。
图17－14 一个样品的色谱图
（1）用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H; (2)求调整保留时间t R1’及t R2`;(3)求有效塔板数n 有效及有效塔板高度H 有效；（4）求容量因子k 1及k 2；（5）求使二组分R s 为1.5时的柱长。 解：（1）3222106.4)0
.117
(16)(
162
?=?==w t n R mm n L H 65.0106.430003=?=
= （2）t R1′= t R1-t 0 =14-1.0=13.0min t R2′=t R2-t 0=17-1.0=16.0min (3) 32
22'101.4)0
.10.16(16)(
162
?=?==w t n R 有效 mm n L H 73.0101.430003
=?==有效有效 (4)130.10.130'
11
===t t k R 160
.10
.160'
22===t t k R
(5)假设两组分峰宽相等。
30
.10.1)
1417(2)(21
2112=+-=
+-=
W W t t R R R
21221)(
L L R R =
m R R L L 75.0)3
5
.1(0.3)(221212=?=?=
3.在2.0m 长的某色谱柱上，分析苯（1）与甲苯（2）的混合物。测得死时间为0.20min,甲苯的保留时间为2.10min 及半峰宽为0.285cm,记录纸速为2.00cm/min 。只知苯比甲苯先流出色谱柱，且苯与甲苯的分离度为1.0。求：① 甲苯与苯的分配系数比（α）：（2）苯的容量因子与保留时间；（3）达到R=1.5时，柱长需几米？ 解：(1)1203)2
285.010.2(54.5)(
54.52
22/1=?==甲苯
甲苯甲苯w t n R
5.920
.020
.010.20
'222
=-=
-=
=
t t t t t k R R ,
)1)(1(422
k k n R +-=
αα 127.0)5
.95.91(12030.14)1(4122=+??=+?=-k k n R αα α=1.1 (2) min 73.1,1.120.010.2'
'
'0
''
11
1
21
2==-=
-=
=
R R R R R R t t t t t t t α t R2’ = t R1’+ t 0 = 1.73 + 0.20 = 1.93 min
65.820
.073
.10
'11
==
=
t t k R (3) 21221)(
L L R R =
m R R L L 5.4)0
.15
.1(0.2)(221212=?=?=
4.在一根2.0 m 色谱柱上，用He 为载气，在3种流速下测得结果如表： 甲烷 t R / s 正十八烷 t R / s W /s 18.2 8.0
5.0
2020.0 888.0 558.0
223.0
99.0 68.0
求算：（1）3种流速下的线速度u; （2）3种不同线速度下的n 及H; (3) 计算van Deemter 方程中参数A 、B 、C ；（4）计算H 最小和u 最佳。 解：（1） 0
L
u t =
120011.0/18.2cm u cm s =
= 2200250/8.0
cm
u cm s ==
320040/5.0
cm
u cm s =
= （2）212020.016(
)1313223.0n =?= 2
2888.016()128799.0n =?= 2
3558.016()107768.0n =?=
12000.1521313cm H cm == 22000.1551287cm H cm ==
32000.1861077cm H cm ==
（3）由u 1u 2u 3和H 1H 2H 3可分别建立三个Van Deemter 方程
0.15211.011.0B
A C =+
+? 0.15525.025.0B
A C =++?
0.18640.040.0B
A C =++?
解方程组得：
A=0.0605cm B=0.683cm 2/s C=0.0027s
(4) 0.06050.146H A cm =+=+=最小
15.9/7
opt u cm s =
==
色谱分析法概论习题答案
第十六章色谱分析法概论 思考题和习题 1．在一液液色谱柱上，组分A和B的K分别为10和15，柱的固定相体积为，流动相体积为，流速为min。求A、B的保留时间和保留体积。 2．在一根3m长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min，组分1的保留时间为14min，组分2的保留时间为17min，峰宽为1min。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n及塔板高度H；(2) 求调整 保留时间 ' R1 t 及 ' R2 t ；(3) 用组分2 求n ef及H ef；(4) 求容量因子k1及k2；(5) 求相对保留值1,2 r 和分离度 R。 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为min；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s=。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间：苯、甲苯、乙苯，异丙苯，死时间为。求：(1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比?。 （1） V0=t0×u=×min=10.5cm3 （2） ' R t(苯) =－= , ' R t(甲苯) =－= , ' R t(乙苯) =－= , ' R t(异丙苯) =－= 4．在一根甲基硅橡胶 (OV-1) 色谱柱上，柱温120℃。测得一些纯物质的保留时间：甲烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、苯、3-正己酮、正丁酸乙酯、正己醇及某正构饱和烷烃。(1) 求出后5个化合物的保留指数。未知正构饱和烷烃是何物质？ (2) 解释上述五个六碳化合物的保留指数为何不同。 (3) 说明应如何正确选择正构烷烃物质对，以减小计算误差。 ①根据保留指数的公式和意义，5个化合物的保留指数为： 设某正构烷烃的碳数为x，则 解此方程得x=5, 所以该正构烷烃为正戊烷。 （2）上述五个化合物极性由大到小分别为：正己醇＞正丁酸乙酯＞3-正己酮＞苯＞正戊烷，根据气液色谱固定液的作用原理，在弱极性的OV-1柱上保留能力由强到弱，即保留指数由大至小。 （3）选择正构饱和烷烃物质对的t R值最好与被测物质的t R值相近，以减小测定误差。 5．某色谱柱长100cm，流动相流速为0.1cm/s，已知组分A的洗脱时间为40 min，求组分A在流动相中的时间和保留比R?=t0/t R为多少。， 流动相流过色谱柱所需的时间即死时间t0，即为组分A在流动相中的停留时间： t0=L/u=100/×60)= 组分A的洗脱时间即其保留时间t R 保留比R?=t0/t R=40= 6．某YWG-C18H37 4.6mm×25cm柱，以甲醇－水（80:20）为流动相，测得苯和萘的t R和W1/2分别为和 min, 和 min。求柱效和分离度。
高效液相色谱法操作规程
目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1 ?定义及概述： 1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2. 高效液相色谱仪的使用要求：
2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3. 操作前的准备： 3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45a m。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时, 对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45a m适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3检查上次使用记录和仪器状态:检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4操作： 4.1泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml,设置高流速（9ml/min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP冲洗，关闭排放阀。 4.1.3将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示 应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 4.2.1开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，
第16章高效液相色谱法#(精选.)
第16章高效液相色谱法 【16-1】从分类原理、仪器构造及应用范围，简述气相色谱及液相色谱的异同点。 答：二者都是根据样品组分与流动相和固定相相互作用力的差别进行分离的。 从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联用。 二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子量大的限制。 【16-2】高效液相色谱仪由几大部分构成？各部分的主要功能是什么？ 答：高效液相色谱仪由高压输液系统，进样系统，分离系统，检测系统和记录系统五大部分组成。高压输液系统：主要是通过高压输液泵将溶剂储存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使试样在色谱柱中完成分离过程。 进样系统：把分析试样有效地送入色谱柱中进行分离。 分离系统：将试样各组分分离开来。 检测系统：对被分离组分的物理或物化特性有响应；对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。记录系统：记录被分离组分随时间变化的信号。 【16-3】液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比其主要区别何在？ 答：液相色谱中引起色谱峰扩展的主要因素为涡流扩散、流动的流动相传质、滞留的流动相传质以及柱外效应。在气相色谱中径向扩散往往比较显著，而液相色谱中径向扩散的影响较弱，往往可以忽略。另外，在液相色谱中还存在比较显著的滞留流动相传质及柱外效应。 【16-4】何谓化学键合相色谱、正相色谱和反相色谱？ 答：化学键合相色谱是指在化学键合固定相上进行物质分离的一种液相色谱法。 正相色谱是采用极性键和固定相流的相用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂。 反相色谱采用非极性键和固定相流的相为强极性的溶剂。 【16-5】何谓化学键合固定相？它的突出优点是什么？ 答：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面形成的固定相称为化学键合固定相。 优点: 固定相表面没有液坑,比一般液体固定相传质快的多；无固定相流失,增加了色谱柱的稳定性及寿命；可以键合不同的官能团,能灵活地改变选择性,可应用与多种色谱类型及样品的分析；有利
17色谱分析法概论
第十七章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．色谱法作为分析方法的最大特点是什么? 2．一个组分的色谱峰可用哪些参数描述？ 这些参数各有何意义？ 3．说明容量因子的物理含义及与分配系数的关系。为什么容量因子 (或分配系数) 不等是分离的前提？ 4．各类基本类型色谱的分离原理有何异同？ 5．说明式（17?18）中K 与V s 在各类色谱法中的含义有何不同？ 6．衡量色谱柱效的指标是什么？衡量色谱系统选择性的指标是什么？ 7．用塔板理论讨论流出曲线，为什么不论在 t ＞t R 或t ＜t R 时，总是C ＜C max ? 塔板理论有哪些优缺点？ 8．简述谱带展宽的原因。 9．下列那些参数可使塔板高度减小? (1) 流动相速度，(2) 固定相颗粒， (3) 组分在固定相中的扩散系数D s ，(4) 柱长， (5) 柱温。 10．什么是分离度？要提高分离度应从哪两方面考虑？ 11．组分在固定相和流动相中的质量为m A 、m B (g)，浓度为C A 、 C B (g/ml)，摩尔数为n A 、n B (mol)，固定相和流动相的体积为V A 、V B (ml)，此组分的容量因子是 ( ) 。 A. m A /m B ； B. (C A V A )/(C B V B ) ； C. n A /n B ； D. C A /C B 。 （A 、B 、C ） 12．在柱色谱法中，可以用分配系数为零的物质来测定色谱柱中 ( ) 。 A. 流动相的体积； B. 填料的体积； C. 填料孔隙的体积； D. 总体积。 （A 、C ） 13．在以硅胶为固定相的吸附色谱中下列叙述中正确的是 ( ) 。 A. 组分的极性越强，吸附作用越强； B. 组分的分子量越大，越有利于吸附； C. 流动相的极性越强，溶质越容易被固定相所吸附； D. 二元混合溶剂中正己烷的含量越大，其洗脱能力越强。 （A ） 14．在离子交换色谱法中，下列措施中能改变保留体积的是( )。 A. 选择交联度大的交换剂； B. 以二价金属盐溶液代替一价金属盐溶液作流动相； C. 降低流动相中盐的浓度； D. 改变流速。 （A 、B 、C ） 15．在空间排阻色谱法中，下列叙述中完全正确的是( )。 A. V R 与K p 成正比； B. 调整流动相的组成能改变V R ； C. 某一凝胶只适于分离一定分子量范围的高分子物质； D. 凝胶孔径越大，其分子量排斥极限越大。 （C 、D ） 16．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为0.5ml ，流动相体积为1.5ml ，流速为0.5ml/min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 （A R t =13min A R V =6.5ml, B R t =18min B R V =9ml ） 17．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。 (1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间
色谱分析法概论习题答案
色谱分析法概论习题答 案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
第十六章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为，流动相体积为，流速为min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 ml F t V V V K t t ml F t V V V K t t F V t c RB RB m s B RB c RA RA m s A RA c 0.95.018 min 18)5 .15.0151(3)1(5.65.013 min 13)5 .15 .0101(3)1(min 35.0/5.1/0000=?=?==?+?=+==?=?==?+?=+==== 2．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间 'R 1 t 及 'R 2 t ；(3) 用组分2 求n ef 及H ef ；(4) 求容量因子k 1及 k 2；(5) 求相对保留值 1 ,2r 和分离度R 。 (mm) 0.65 (m) 1065.010 4.63 n L H 104.6) 1 17 (16) t 16( n )1(33 223 22R 22 =?=?==?=?==-W (mm) 0.73 (m) 1073.010 4.13 n H 101.4) 116 (16) 16(n (3)(min) 16117 (min) 13114 (2)33 ef(2)ef(2)3 22 'ef(2)' '2 2 1=?=?==?=?===-==-=-L W t t t R R R 31) 1(3)1 61(2) W () t 2(R 2.1 13 16r )5( 16116k 13113k (4)21''2,10'20'112122 1 =+-?=+-==========W t t t t t t t R R R R R R 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为min ；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s =。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间：苯、甲苯、乙苯，异丙苯，死时间为。求：(1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比?。 （1） V 0=t 0×u=×min=10.5cm 3 （2） 'R t (苯) =－= , 'R t (甲苯) =－= , 'R t (乙苯) =－= , 'R t (异丙苯) =－=
色谱分析法概论习题答案
第十六章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为0.5ml ，流动相体积为1.5ml ，流速为0.5ml/min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 ml F t V V V K t t ml F t V V V K t t F V t c RB RB m s B RB c RA RA m s A RA c 0.95.018 min 18)5.15.0151(3)1(5.65.013 min 13)5 .15.0101(3)1(min 35.0/5.1/0000=?=?==?+?=+==?=?==?+?=+==== 2．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间'R 1t 及'R 2t ；(3) 用组分2 求n ef 及H ef ；(4) 求容量因子k 1及k 2；(5) 求相对保留值 1,2r 和分离度R 。 (mm) 0.65 (m) 1065.010 4.63n L H 104.6) 1 17(16) t 16(n )1(3322322R 22=?=?==?=?==-W (mm) 0.73 (m) 1073.010 4.13n H 101.4) 1 16(16) 16(n (3)(min) 16117 (min) 13114 (2)33ef(2)ef(2)3 22'ef(2)''22 1=?=?==?=?===-==-=-L W t t t R R R 31) 1(3)1 61(2) W () t 2(R 2.1 13 16r )5( 16116k 13113k (4)21''2,10'20'1121221=+-?=+-==========W t t t t t t t R R R R R R 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为43.75ml/min ；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s =14.1ml 。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间：苯1.41min 、甲苯2.67min 、乙苯4.18min ，异丙苯5.34min ，死时间为0.24min 。求：(1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比α。 （1） V 0=t 0×u=0.24×43.75ml/min=10.5cm 3 （2） 'R t (苯) =1.41－0.24=1.17min , 'R t (甲苯) =2.67－0.24=2.43min , 'R t (乙苯) =4.18－0.24=3.94min , 'R t (异丙苯) =5.34－0.24=5.10min 3.19 4.310.5 6.143.294.3 1.217.143.20.161 .145.1025.21K 25.21 24.0 .1050.121 .145.104.16K 4.16 24.0 .9435.71.145.101.10K 1.01 24.0 .4326.31 .145.109.4K 4.9 24.0 17.1/////////0/0/0/0/==========?======?======?======?=====乙苯异丙苯乙苯异丙苯甲苯乙苯甲苯乙苯苯甲苯苯 甲苯异丙苯异丙苯异丙苯异丙苯乙苯乙苯乙苯乙苯甲苯甲苯甲苯甲苯 苯苯苯苯R R R R R R s m R s m R s m R s m R t t t t t t V V k t t k V V k t t k V V k t t k V V k t t k ααα
第16章 气相色谱法
第16章Gas chromatography 16. 1 内容提要 16.1.1 基本概念 气相色谱法(GC)──是以气体为流动相的色谱分析法。 气液色谱法(GLC)──以气体为流动相，液体为固定相的色谱法。 气固色谱法(GSC)──以气体为流动相，固体为固定相(一般指吸附剂)的色谱法。 填充柱气相色谱法──使用填充色谱柱的气相色谱法。 毛细管柱气相色谱法──使用毛细管柱的气相色谱法。 程序升温气相色谱法──将色谱柱按照预定的程序连续地或分阶段地进行升温的气相色谱法。 多维气相色谱法──将两个或更多个色谱柱组合，通过切换，可对组分进行正吹、反吹或切割等操作的气相色谱法。 全二维气相色谱法(GC×GC)──把两个分离机理不同又互相独立的色谱柱串联结合，两柱间装有调制毛细管接口，由第一根色谱柱分离后的每一个馏分，经调制毛细管聚焦后在以脉冲方式送入第二根色谱柱进行进一步分离，最后得到以柱1的保留时间为x轴，柱2的保留时间为y轴，信号强度为z轴的三维立体色谱图，这种色谱法称为全二维气相色谱法。 气相色谱仪──以气体为流动相而设计的色谱分析仪。主要有气路系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理记录系统、温度控制系统等组成。 载气──用作流动相的气体。常用的载气有N2，H2，He，Ar等。 载体──承载固定液的惰性固体，又称担体。 固定液──指涂渍在载体或色谱柱内壁表面上起分离作用的物质。 填充柱──填充了固定相的色谱柱。 毛细管柱──内径为0.1～0.5mm 的色谱柱，一般指管内壁附有固定相的空心柱，又称开管柱(open tubular column)。 壁涂毛细管柱(WCOT)──内壁上直接涂渍固定液的毛细管柱。
色谱分析法概论
第17章 色谱分析法概论 思考题 9．试推导有效塔板数与分离度的关系式： 2 2116?? ? ??-??ααR n ＝有效 证明：∵ 2 ' 2216R t n W ?? ? ??? 有效＝ (1) 2 2 W W +R2R112(t -t ) R ＝ 设W 1=W 2 2 2'' 2010212222[()()]2()22R R R R t t t t t t W W W W ----==+R2R112(t -t )R ＝ ''1R t R -R22t W ＝ (2) 将（2）代入（1）式，得： '22 ' '2222221 '''221'1 1616()16()11R R R R R R R t t t n R R R t t t t αα???==?? ?--??-有效＝ 10. 试推导最小板高的计算式：BC A H 2+＝最小 证明：∵B H A Cu u =++ (1) 微分，得 2dH B C du u =-+ 令 0dH du =，则 2 0B C u - += opt u = 将（2）代入（1），得： H A =+最小
习题 1.在一根 2.00m 的硅油柱上分析一个混合物得下列数据：苯、甲苯及乙苯的保留时间分别为80s 、122s 、181s ；半峰宽为0.211cm 、0.291cm 及0.409cm(用读数显微镜测得)，已知记录纸速为1200mm/h ，求此色谱柱对每种组分的理论塔板数及塔板高度。 解：∵2 2 /1)( 54.5W t n R = 注意：分子分母单位应保持一致 mm n L H W t n R 3.28852000,8853600 /120011.28054.554.52 2 2/1＝＝＝）（ ＝）（＝苯苯苯 苯苯= mm n L H W t n R 8.110822000,10823600 /120091.212254.554.52 2 2/1＝＝＝）（ ＝）（＝甲苯甲苯甲苯 甲苯甲苯= mm n L H W t n R 7.112062000,12063600 /120009.418154.554.52 2 2/1＝＝＝）（ ＝）（＝乙苯乙苯乙苯 乙苯乙苯= 2.在一根 3.0m 长的色谱柱上分离样品的结果如图17－14所示。 图17－14 一个样品的色谱图 （1）用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H; (2)求调整保留时间t R1’及t R2`;(3)求有效塔板数n 有效及有效塔板高度H 有效；（4）求容量因子k 1及k 2；（5）求使二组分R s 为1.5时的柱长。 解：（1）3222106.4)0 .117 (16)( 162 ?=?==w t n R mm n L H 65.0106.430003=?= = （2）t R1′= t R1-t 0 =14-1.0=13.0min t R2′=t R2-t 0=17-1.0=16.0min (3) 32 22'101.4)0.10.16(16)( 162 ?=?==w t n R 有效 mm n L H 73.0101.430003 =?==有效 有效 (4)130.10.130' 11 ===t t k R 160 .10 .160' 22===t t k R (5)假设两组分峰宽相等。 30 .10.1) 1417(2)(21 2112=+-= +-= W W t t R R R
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
色谱分析法概论
色谱分析法概论 1色谱分析法是根据混合物中各组分在两相分配系数的不同进行分离，而后逐个分析。 2色谱过程：组分的分子在流动相和固定相间多次分配的过程。若两个组分的分配系数存在微小的差异，经过反复多次的分配平衡，使微小的差异积累起来，其结果就使分配系数小的组分被先洗脱，从而使两组分得到分离。色谱分离的前提是分配系数或保留因子不等。 3色谱流出曲线是由检测器输出的电信号对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。 4按色谱过程的分离机制分类：分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法。①分配色谱法机制：利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别，即分配系数的差别而实现分离。②吸附色谱法机制：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别，即吸附系数的差别而实现分离。常见化合物的吸附能力顺序：烷烃＜烯烃＜卤代烃＜醚＜硝基化合物＜叔胺＜酯＜酮＜醛＜酰胺＜醇＜酚＜伯胺＜羧酸③离子交换色谱法机制：利用分离组分离子交换能力的差别即选择性系数的差别而实现分离。④分子排阻色谱法：根据被分离组分分子的线团尺寸，即渗透系数的差别而进行分离。 5流动相线速对塔板高度的影响：在较低线速度时，纵向扩散起主要作用，线速度升高，塔板高度降低，柱效升高；在较高线速度时，传质阻抗起主要作用，线速度升高，塔板高度增高，柱效降低。 6说明保留因子的物理含意及与分配系数的关系。为什么保留因子（或分配系数）不等是分离的前提？ 答：保留因子k是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比，故又称为质量分配系数。而分配系数K是组分在固定相和流动相中的浓度之比。二者的关系是k=KV s／／V m，可见保留因子除与固定相、流动相、组分三者的性质有关外，还与固定相和流动相的体积之比有关。保留因子越大的组分在色谱柱中的保留越强，t R =t0 （1+k）或t＇R =kt0 ，由于在一定色谱条件下t0为定值，如果两组分的k相等，则他们的t＇R一定相等，t R相等，即不能分离。要使两组分分离，即t R或t＇R不等，则它们的k（或K）必须不等，即保留因子（或分配系数）不等是分离的前提。 7根据分离度的定义，哪些色谱参数与分离度有关？可从哪两方面改善色谱分离度？如何在色谱图上测定这些参数？ 答：分离度的定义式为R=2（t R2 -t R1）／（W1 +W2 ),由此可见色谱峰的区域宽度和保留时间与分离度有关。为改善色谱分离度，一方面应增加两组分保留时间之差，即保留因子或分配系数之差，另一方面减小峰宽，即提高柱效使色谱峰变锐。保留时间是从进样到色谱峰峰顶的时间间隔；峰宽是在色谱峰两侧拐点作切线到基线上所截得的距离。 8什么是最佳流速？实际操作中是否一定要选择最佳流速？为什么？ 答：柱效最高时（n最大或H最小）的流动相流速叫最佳流速。实验中要根据具体情况选择流速，如果分离不好，尽量选最佳流速，如果速度太慢而分离很好，则可选远于最佳值的流速。 9色谱定性是根据保留值，定量的依据是峰面积和峰高。 气相色谱法 1气相色谱法的特点：分离效能高、高灵敏度、高选择性、简单快速、应用广泛。 2气相色谱仪的组成：①气路系统②进样系统③色谱柱系统④检测和记录系统⑤控制系统3对固定液的要求：①在操作温度下蒸气压低于10Pa，否则固定液易流失。每一固定液有一
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC） 一、方法原理 1、液相色谱法概述 高效液相色谱分析法
其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构 2、高效液相色谱法的特点（HPLC） 与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分
配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。 由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。 特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。 高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。 高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。 如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。 3、高效液相色谱法的固定相和流动相 （1）固定相 表面多孔型和全多孔型两大类。 （2）流动相（淋洗液） 流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。 从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求： ①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。 ②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱 性能的改变。 ③与所用的检测器相匹配。 ④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏 度。 ⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱 效）和适当低的沸点。
色谱分析法概论习题答案
第十六章 色谱分析法概论 思考题和习题 1在一液液色谱柱上，组分 A 和 B 勺K 分别为10和15,柱的固定相体积为0.5ml ，流动相体积为1.5ml ，流速 为0.5ml/min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 t V o /F c 1.5/0.5 3min t RA t o (1 K A V S ) V m 3 (1 10 1.5 13min V RA t RA F c 13 0.5 6.5ml t RB t °(1 V s 心亠) V m 3 (1 15 骑 1.5 18min V RB t RB F c 18 0.5 9.0ml 2. 在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为 1min ,组分1的保留时间为14min ，组分2的 保留时间为17min ，峰宽为1min 。(1)用组分2计算色谱柱的理论塔板数 n 及塔板高度H; (2)求调整保留时 3. 一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为 43.75ml/min ;由固定液的涂量及固定液在柱温下 的密度计算得V S =14.1ml 。分离一个含四组分的试样， 测得这些组分的保留时间： 苯1.41min 、甲苯2.67min 、 乙苯4.18min ，异丙苯5.34min ，死时间为0.24min 。求：(1)死体积；(2)这些组分的调整保留时间； (3) 它们在此柱温下的分配系数(假定检测器及柱头等体积可以忽略)； (4)相邻两组分的分配系数比 。 (1) V 0=t 0 x u=0.24 x 43.75ml/min=10.5cm 3 I I (2) t R (苯)=1.41 - 0.24=1.17min , t R (甲苯)=2.67 - 0.24=2.43min , I t R (异丙苯)=5.34 - 0.24=5.10min t R 苯 1.17 4.9 K 苯 k 苯 V m 4.9 10.5 3.6 k t 0 0.24 V s 14.1 k 甲苯 t R 甲苯 2.43 10.1 K 甲苯 k 甲苯 V m 10.1 10.5 7.5 t 0.24 V s 14.1 间t R 1及t R 2 ； (3)用组分2求n ef 及H f ; (4)求容量因子 刚及k 2； (5) 求相对保留值^1 和分离度R 。 (1) n 2 H 2 16(區)2 16 (卩)2 W 1 L 3 n 2 4.6 10 3 4.6 10 t R 1 14 1 13 (min) n ef(2) H ef(2) t R 2 2 16(—) 16 W L R 2 n ef(2) t R1 13 ⑷ k 1 F 7 0.65 3 10 (m) 17 1 0.65 (mm) 16 (min) 16 2 (T ) 3 4.1 103 13 4.1 3 10 0.73 10 3 (m) 0.73 (mm) R 2 16 T 16 (5) r 2,1 邑竺1.2 仁 13 R 1 2(t 甩 t R 1) 2 (16 13) R (W 1 W 2 ) 3 (1 1) t R 异丙苯 t 5.10 0.24 10.5 14.1 16.0 t R 甲苯 甲苯/苯 / t R 苯 2.43 1.17 2.1 t R 乙苯 乙苯/甲苯 / t R 甲苯 2.43 异丙苯/乙苯 t R 异丙苯 t R 乙苯 5.10 3.94 1.3 21.25 K 异丙苯 21.25
色谱分析法概论习题答案完整版
色谱分析法概论习题答 案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
第十六章 色谱分析法概论 思 考 题 和 习 题 1．在一液液色谱柱上，组分A 和B 的K 分别为10和15，柱的固定相体积为，流动相体积为，流速为min 。求A 、B 的保留时间和保留体积。 2．在一根3m 长的色谱柱上分离一个试样的结果如下：死时间为1min ，组分1的保留时间为14min ，组分2的保留时间为17min ，峰宽为1min 。(1) 用组分2计算色谱柱的理论塔板数n 及塔板高度H ；(2) 求调整保留时间 'R 1t 及'R 2t ；(3) 用组分2 求n ef 及H ef ；(4) 求容量因子k 1及k 2；(5) 求相对保留值1,2r 和分离度R 。 3．一根分配色谱柱，校正到柱温、柱压下的载气流速为min ；由固定液的涂量及固定液在柱温下的密度计算得V s =。分离一个含四组分的试样，测得这些组分的保留时间： 苯、甲苯、乙苯，异丙苯，死时间为。求：(1) 死体积；(2) 这些组分的调整保留时间；(3) 它们在此柱温下的分配系数（假定检测器及柱头等体积可以忽略）；(4) 相邻两组分的分配系数比?。 （1） V 0=t 0×u=×min=10.5cm 3 （2） 'R t (苯) =－= , ' R t (甲苯) =－= , 'R t (乙苯) =－= , ' R t (异丙苯) =－= 4．在一根甲基硅橡胶 (OV-1) 色谱柱上，柱温120℃。测得一些纯物质的保留时间：甲烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、正壬烷、苯、3-正己酮、正丁酸乙酯、正己醇及某正构饱和烷烃。(1) 求出后5个化合物的保留指数。未知正构饱和烷烃是何物质？ (2) 解释上述五个六碳化合物的保留指数为何不同。(3) 说明应如何正确选择正构烷烃物 ① 根据保留指数的公式和意义，5个化合物的保留指数为： 设某正构烷烃的碳数为x ，则 解此方程得x=5, 所以该正构烷烃为正戊烷。 （2）上述五个化合物极性由大到小分别为：正己醇＞正丁酸乙酯＞3-正己酮＞苯＞正戊烷，根据气液色谱固定液的作用原理，在弱极性的OV-1柱上保留能力由强到弱，即保留指数由大至小。 （3）选择正构饱和烷烃物质对的t R 值最好与被测物质的t R 值相近，以减小测定误差。
第十六章 色谱分析法概论 - 章节小结
一、主要内容 1．基本概念 保留时间t R：从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。 死时间t0：分配系数为零的组分即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。 调整保留时间t R'：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。 相对保留值r2,1：两组分的调整保留值之比。 分配系数K：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相与流动相中的浓度之比。 保留因子k：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比。 分离度R：相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。 分配色谱法：利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别或分配系数的差别而实现分离的色谱法。 吸附色谱法：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别或吸附系数的差别而实现分离的色谱法。 离子交换色谱法：利用被分离组分离子交换能力的差别或选择性系数的差别而实现分离的色谱法。 分子排阻色谱法：根据被分离组分分子的线团尺寸或渗透系数的差别而进行分离的色谱法。 涡流扩散：在填充色谱柱中，由于填料粒径大小不等，填充不均匀，使同一个组分的分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱，使色谱峰展宽的现象。 纵向扩散：由于浓度梯度的存在，组分将向区带前、后扩散，造成区带展宽的现象。 传质阻抗：组分在溶解、扩散、转移的传质过程中所受到的阻力称为传质阻抗。 保留指数I：在气相色谱法中，常把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，也就是以正构烷烃系列为组分相对保留值的标准，即用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分的保留，这个相对值称为保留指数，又称Kovats指数。 保留体积V R：是从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。 调整保留体积V R'：是由保留体积扣除死体积后的体积。 保留比R'：设流动相的线速度为u，组分的移行速度为v，将二者之比称为保留比。 2．基本理论 （1）色谱分离的原理：组分在固定相和流动相间进行反复多次 的“分配”，由于分配系数K(或容量因子k)的不同而实现分离。各种色谱
第一章色谱分析法概论
第一章色谱分析法概论 第一节概述 色谱分析法简称色谱法或层析法(chromatography)，是一种物理或物理化学分离分析方法。从本世纪初起，特别是在近50年中，由于气相色谱法、高效液相色谱法及薄层扫描法的飞速发展，而形成一门专门的科学——色谱学。色谱法已广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分析方法，在各学科中起着重要作用。历史上曾有两次诺贝尔化学奖是授予色谱研究工作者的：1948年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研究而获奖，1952年英国的Martin和Synge因发展了分配色谱而获奖；此外在1937～l972年期间有12次诺贝尔奖的研究中，色谱法都起了关键的作用。 色谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相(stationary phase)，冲洗剂称为流动相(mobile phase)。随着其不断发展，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。虽然“色”已失去原有意义，但色谱法名称仍沿用至今。 30与40年代相继出现了薄层色谱法与纸色谱法。50年代气相色谱法兴起，把色谱法提高到分离与“在线”分析的新水平，奠定了现代色谱法的基础，l957年诞生了毛细管色谱分析法。60年代推出了气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)，有效地弥补了色谱法定性特征差的弱点。70年代高效液相色谱法(HPLC)的崛起，为难挥发、热不稳定及高分子样品的分析提供了有力手段。扩大了色谱法的应用范围，把色谱法又推进到一个新的里程碑。80年代初出现了超临界流体色谱法(SFC)，兼有GC与HPLC的某些优点。80年代末飞速发展起来的高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis，HPCE)更令人瞩目，其柱效高，理论塔板数可达l07m-1。该法对于生物大分子的分离具有独特优点。 色谱法的分离原理主要是利用物质在流动相与固定相之间的分配系数差异而实现分离。色谱法与光谱法的主要区别在于色谱法具有分离及分析两种功能，而光谱法不具备分离功能。色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此是分析混合物最有力的手段。这种方法还具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点。 色谱法可从不同的角度进行分类：
高效液相色谱法概述
高效液相色谱法概述 摘要：本文概述了高效液相色谱的产生、发展，分类、应用、存在问题及发展前景。 关键词：高翔液相色谱、分类、应用 高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC) 是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱，按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法。 一、高效液相色谱的产生及发展 在过去三十多年里, HPLC 已经成为一项在化学科学中最有优势的仪器分析方法之一, 1994年, HPLC 的市场销售量是14亿美元, 就是一个较好的证据。现在, HPLC 几乎能够分析所有的有机、高分子及生物试样。、 1941年, 马丁( Matin) 和辛格( Synge) 用一根装满硅胶微粒的色谱柱, 成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分离, 建立了液液分配色谱方法, 他们也因此获得了1952年诺贝尔化学奖。从此开启了色谱技术的发展，紧接其后的塔板理论、速率理论的建立，使得色谱技术和理论得到了迅速的发展。 HPLC 的第一个雏形是由斯坦因( Stein) 和莫尔( Moo re) 于1958年发展起来的氨基酸分析仪( AAA) , 这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析, 由于这种研究的重要性, 别的研究者也被吸引来进行这一方面的重要课题的研究, 最终直接促成了HPLC 方法的建立。在此期间, 哈密顿( Hamiton) 在柱效率和选择性方面的成就而使得他的工作特别有价值。在六十年代早期的相关进展是莫尔( Moo re) 发展起来的凝胶渗透色谱( GPC) 。不久以后, 华特斯(Waters) 有限公司制造了商业GPC 仪, 这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC 分离。在1968～1971年间, 推出了第一台普遍适用的HPLC 商用系统。1971年以后, 对映体( 手性异构体) 和大生物分子如蛋白质的HPLC 分离逐步建立起