高效液相色谱基本常识

被分离组分在柱中的洗脱原理

Ⅱ基本概念和理论

一、基本概念和术语

1.色谱图和峰参数

⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）.

⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。

⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。

⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。

⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。

⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。

⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。

⊕峰面积（peak area,A）――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h＝2.507σh=1.064Wh/2h

2.定性参数（保留值）

⊕死时间（dead time,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

⊕死体积（dead volume,V0）――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）

⊕保留时间（retention time,tR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。⊕保留体积（retention volume,VR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F*tR .

⊕调整保留时间（adjusted retention time,tR’）--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0

⊕调整保留体积（adjusted retention volume,VR’）--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’

3.柱效参数

⊕理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。

N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：

N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2

W：峰宽；σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。

N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长

为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）

若用调整保留时间（tR’）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）

=16(tR’/W)2

⊕理论塔板高度（theortical plate height,H）每单位柱长的方差。H=。实际应用时往往用

柱长L和理论塔板数计算：H=L/N

4.相平衡参数（distribution coefficient,K）--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K=[xs]/[xm]

Cs-溶质在固定相中的浓度

Cm－溶剂在流动相中的浓度

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为滲透参数。但一般情况可用分配系数来表示。

在条件（流动相、固定相、温度和压力等）一定，样品浓度很低时（Cs 、Cm很小）时，K只

取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减少，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度的增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能较少进样量，使组份在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。

在同一色谱条件下，样品中K值大的组份在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组份则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组份的分配系数相差越大，越容易分离，因此，混合物中各组份的分配系数不同是色谱分离的前提。

在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配

比及PH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。

⊕容量因子（capacity factor,K）--化合物在两相间达到平衡时，在固定相与流动相中的量

之比。K＝（tR-t0）/t0=tR’/t0（或溶质在固定相中的量/溶质在流动相中的量）。因此，容

量因子也称质量分配系数。

｛K=Cs/Cm=K’Vm/Vs k=(tR-t0)/t0=K*Vs/Vm Vs：色谱柱中固定相的体积； Vm：色谱柱中流动相的体积。｝

分配系数、容量因子与保留时间之间有如下关系：k===K=,tR’=kt0。上式说明容量因子的物理意义：表示一个组份在固定相中停留的时间（tR’）是不保留组分保留时间（t0）的几倍。k=0时，化合物全部存在与流动相中，在固定相中不保留，tR’=0;k越大，说明固定相对此组分的

容量越大，出柱慢，保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是：K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度，而与体积Vs、Vm无关；k除了与性质及温度有关外，还与Vs、Vm有关。由于tR’、t0较Vs、Vm易于测定，所以容量因子比分配系数应用更广泛。

⊕选择性因子（selectivity factor,α）--相邻两组份的分配系数或容量因子之比。α＝＝（设k2>k1）。因k=tR’/t0,则α＝k2/k1，所以α又称为相对保留时间（《美国药典》）。

要使两组分得到分离，必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，α的大小表示两组份在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。

5.分离参数

⊕分离度（resolution,R）--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R=（tR2-tR1）/[(W1+W2)/2],当W1=W2时，R=。当R=1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露锋面积为95.4％，内测峰基重叠约2％。R=1.5时，称为6σ分离，

裸露锋面积为99.7％。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。

⊕基本分离方程――分离度与三个色谱基本参数有如下关系：

R=1/4（а-1）×N0.5×［k’/(1+k’)］

其中N称为柱效项，α为柱选择项，k’为柱容量项。柱效项与色谱过程动力学特性有关，后两

项与色谱过程热力学因素有关。

从基本分离方常可看出，提高分离度有三种途径：①增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。②增加选择性。当α＝1时，R=0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a.改变流动相的组成及PH值；b.改变柱温；c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分

离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2 不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2 在1～10范围内，最好为2～5，窄径柱可更小些。

二、塔板理论

1.塔板理论的基本假设

塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为：

1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。

2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。

3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。

4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。

虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。

2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）

根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述；

C=e 或 C=e

由色谱流出曲线方程可知；当t=tR时，浓度C有极大值，Cmax=.Cmax就是色谱峰的峰高。因此上式说明；①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。

②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。

由曲线方程对V（0～∞）求积分，即得出色谱峰面积A＝×σ×Cmax =C0。可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。把Cmax=h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。

三、速率理论（又称随机模型理论）

1.液相色谱速率方程

1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板理论高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论――速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。

后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H=A+B/u+Cu,后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）：

H＝2λdp++\s\up5(2p+\s\up 5(2p+\s\up 5(2f

2.影响柱效的因素

1)涡流扩散（eddy diffusion）.由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。HPLC常用填料粒度一般为3～10 um，最好3～5um，粒度分布RSD≤5％。但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。总的说来，应采用而均匀的载体，这种有助于提高柱效。毛细管无填料，

A=0。

2）分子扩散（molecular diffusion）.又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2rDm/u.u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。在低流速时，它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm 很小，通常仅为气相的10-4～10-5，因此在HPLC中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。r一般在0.6～0.7左右，毛细管柱的r＝1。

3）传质阻抗（mass transfer resistance）。由于溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。

①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。这是由于在一个流路中硫路中心和边缘的流速

不等所致。靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相迁移，因而产生峰展宽。

②静态流动相传质阻抗Hsmd2pu/Dm,Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。

Hsm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。因此应采用低力度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。

③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df 的平方成正比，在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。

从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。

②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图，则有一最佳线速度uopt,在此线速度时，H最小。一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03～0.1mm/s）在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。⑤较小的检测器死体积。

3.柱外效应、

速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，

即：σ2＝σ2柱内+σ2柱外+σ2器它

柱外效应主要有低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜成流线型，检测器的内腔体积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应

柱外效应的直观标志是容量因子k小的组分（如k<2）峰形拖尾和峰宽增加得更为明显；k大的组分影响不显著。由于HPLC的特殊条件，当柱子本身效率越高（N越大），柱尺寸越小时，柱外效应越显得突出。而在经典LC中则影响相对较小。

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ⅢHPLC系统

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。

最早的液相色谱仪有粗糙的高压泵、低效的柱、固定波长的检测器、绘图仪，绘出的峰是通过手工测量计算峰面积。后来的高压泵精度很高并可编程进行梯度洗脱，柱填料从单一品种发展至几百种类型，检测器从单波长之可变波长检测器、可得三维色谱图的二极管阵列检测器、可确证物质结构的质谱检测器。数据处理不再用绘图仪，逐渐取而代之的是最简单的积分仪、计算机、工作站及网络处理系统。

目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters 公司、Agilent 公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。

一、输液泵

1.泵的构造和性能

输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。砂的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可

靠性。输液泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应〈0.5％，这结定性定量的准确性纛关

重要；②流量范围宽，分析型应在0.1～10ML／MIN范围内连续调，制备型应能达到100ML／

MIN；③输出压力高，一般应能达到150～300KG/CM2：④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐

蚀。

泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞

往复泵和隔往复泵。恒压泵受柱阴影响，流量不稳定；螺旋泵缸体太大，这两种泵己被淘汰目

前应用最多的是柱塞往复泵。

柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ML，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯

度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阴影响；泵压可达400KG/CM2。ADW主

要缺点是输出的脉冲性较大，现多彩采用双泵系统来克服。双泵按连接方式可分为并联式和串

联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（RSD为0.1％左右，串联泵为0.2～0.3％），但出

现故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。

项目 Waters515型 HP1100型 LC-10Atvp型 Elite P200 Ⅱ

型检定要求

流速范围 0.001～10 0.001～10 0.001～9.999 0.01～4.99 调节精度 0.001 0.001 0.001 0.01

流量精密度 RSD0.1％ 0.15％（〈0.3％〉 0.3％ 0.5％

1.5％

流量准确度±2.0％±5.0％±2.0％

最高压力 4000Psi 40MPa 39.2MPa 40.0MPa

密封圈寿命

流动相的脉冲

2.泵的使用和维护注意事项

为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作：

①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和

单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸镏，而常用的

方法是滤过，可采用MILLIPOIPORE滤膜（0.2或0.45）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒

（或片）。输液泵的滤器应经常清洗或更换。

②流动相不应含有任何腐性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在柱内，尤其是在停泵过夜或

更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至兴是由于溶液

的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因

此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱术保存和有利于泵维护的溶剂（对于反

相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇水）。

③泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封

环，最终产生漏液。

④输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

⑤流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性如果有大量气泡，泵就无法正

常工作。

如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障

①没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在

较大流量下运转，将气泡排尽，也可用一个50ML针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能

原因是密封环磨损，需更换。

②压力和流量不稳。原因可能是气泡，须要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，进

入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵

塞，这是，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将纱滤棒浸入稀酸内迅速除去微生物，

或将盐溶解，再立即清洗。

③压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检

查堵塞或泄漏时应逐段进行。

3.梯度洗脱

HPLC有等强度（isocratic）和梯度（gradient）洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期

内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是在一个周期

内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和PH值等，用于分析组分数目多、性质差异罚大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。

梯度洗脱有两种方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。

两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。

在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：

①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相，有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围就不互溶，使用时更要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。

②梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱沧剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。

③混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。例如甲醇和水粘主度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始流动相泫经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

二、进样器

早期使用隔膜和停流进们器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLCfj样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

1.隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用（如10MPA以上）；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1～2％；加之能碉各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。

2.停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。

3.阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀（以美国RHEODYNE公司的7725和7725I型最常见），其关键部件由圆形密封垫子（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积在存在，柱效率低于隔膜进样（约下降5～10％左右），但耐高压（35～40MPA），进样量准确，重复性好（0.5％），操作方便。

六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50％（最多75％），并要求每次进样体积准确、相同。此法进样的准确度和重复性决定于注器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5～10倍9最少3倍），这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。

六通阀使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用0.45UM滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。②转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样吕残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

4.自动进样。用于大量样品的常规分析。

三、色谱柱

色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10UM等，柱效理论值可达5～16万／米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10～30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，不要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

1.柱的构造

色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70KG/CM2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效京，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2-20um(5-10 um),取决于填料粒度,目的是防止填料漏出.

色谱柱按用途分为分析型和制备型两类,尺寸规格也不同:①常规分析柱(常量柱),内径2-

5mm(常量4.6mm,国内又4mm和5mm),柱长10～30CM；②窄径柱（NARROWBORE，又称细管径柱、半微柱SEMI－MICROCOLUMN），内径1～2MM，柱长10～20CM；③毛细管柱（又称微柱MICROCOLUMN），内径0.2～0.5MM；④半制备柱，内径>5MM；⑤实验室制备柱，内径20～

40MM，柱长10～30CM；⑥生产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。

2.柱的发展方向

因强调分析速度而发展出短柱，柱长3～10CM，填料粒径2～3UM。为提高分析灵敏度，与质谱（MS）联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2MM的微径柱（MICROBORE）。细管径柱的优点是：①节省流动相；②灵敏度增加；③样品量少；④能使用长柱达到高分离度；⑤容易控制柱温；⑥易于实现LC－MS联用。

但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出1～100UL/MIHN的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小，要求高灵敏度检测器，电化学检测帮质谱仪在这方面具有突出优点。

3.柱的填充和性能评价

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。在正常条件下，填料粒度>20um 时，干法填充制备柱较为合适；颗粒<20um时，湿法填充较为理想。填充方法一般有四种：①高压匀浆法，多有用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters 专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充的技术性强，大多数实验室使用己填充好的商品柱。

必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的结构是否合理。

无论是自己装填的还是购买的色谱柱,使用前都应对其性能进行考察,使用期间或放置一段时间后也要生意重新检查.柱性能指标包括在一定实验条件下(样品,流动相,流速,温度)下的柱压,理论塔板高度和塔板数,对称因子,容量因子和选择性因子和选择性因子的重复性，或分离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在或以骨。进行柱效比较时，不要注意柱外效应是不有变化。

一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长，内径，填料的种类，粒度，色谱柱的柱效，不对称度和柱压降等。

4.柱的使用和维护注意事项

色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效，缩短使用寿命甚至损坏.在色谱操作过程中,需要注意下列问题,以维护色谱柱．

①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动．温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时讹的转动不能过缓（如前所述）．

②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然．

③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去柱关的杂质．否则反冲会迅速降低柱效．

④选择使用适宜的流动相（尤其是PH），以避免固定相被破坏．有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶＂饱

和＂，避免分析柱中的硅胶基质被溶解．

⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱骨需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱．保护柱一般是填有固定相的短柱．保护柱可以而且应该经常更换．⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质，在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50-75ｍｌ。

下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：

正相硅胶柱以正已烷（或庚烷）｀二氯甲烷（或氯仿）和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。

反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后一步用水冲洗。一氯甲烷能洗支残留的非极性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混全溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1％）梯度洗能除去蛋白质污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、水依次冲洗。

⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

⑧色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。

高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （ 1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（4 ）页输入后按【Exit 】；在第（ 6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （ 1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

37高效液相色谱法标准操作规程

高效液相色谱法标准操作规程 目的：建立高效液相色谱法标准操作规程。 适用范围：高效液相色谱法。 责任：质检员实施本操作规程，检验室主任负责监督本规程正确执行。 程序： 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1.对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和 1

2 调整。应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 (1) 色谱柱的理论板数（n ） 在选定的条件下；注入供试品对仪器或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R （以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54(t R /（W h/2）计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改普通色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。 (2)分离度 定量分析时，为便于准确测量，要求定时峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： ()21122w w t t R R R +-= 式中 2R t 为相邻两峰中后一峰的保留时间； 1R t 为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1及W 2为此相邻两峰的保留时间； 除另有规定外，分离度应大于1.5。 (3)重复性 取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。 (4)拖尾因子 为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子 拖尾因子公式为： 1 05.02d W T h = 式中W 0.05h 为0.05峰高处的峰宽； d 1为峰极大至峰前沿之前的距离。 除另有规定外，T 应在0.95～1.05之间。 3.测定法

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱(HPLC)基础知识

高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 方法项目 数量 1985年版1990年版1995年版2000年版 HPLC法 鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用

碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色 谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用 液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在 5

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱法操作规程

目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1 ?定义及概述： 1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2. 高效液相色谱仪的使用要求：

2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3. 操作前的准备： 3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45a m。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时, 对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45a m适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3检查上次使用记录和仪器状态:检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4操作： 4.1泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml,设置高流速（9ml/min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP冲洗，关闭排放阀。 4.1.3将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示 应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 4.2.1开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，

高效液相试题及答案

高效液相色谱基础知识测试 一、填空题 1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是：安捷伦1260 。高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。 2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。 3、本公司所用的高效液相，为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化，影响分离效果。一般采用C18（十八烷基硅烷键合硅胶）填料的色谱柱，最高工作压力为400 bar。 4、高效液相根据流动相与固定相极性分为：正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。 5、开机步骤：接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。 6、高效液相的维护：最后一次进样完成后，应用流动相冲洗20分钟，以保证洗脱完全，若流动相中含有无机盐类，应用高纯水冲洗30分钟，。 7、进样器的保养：每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。 8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器，氢火焰检测器，电子捕获检测器和火焰光度检测器。 二、选择题 1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（D ） A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用( A )

A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( B ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是( A ) A.示差折光检测器 B.极谱检测器 C.荧光检测器 D.电化学检测器 5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.Ｕ形柱 D.螺旋形柱 6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是（B ）。(1)光源；(2)气路系统；(3)单色器系统；(4)进样系统；(5)分离系统；(6)吸收系统；(7)电导池；(8)检测系统；(9)记录系统。 A 1-3-6-8-9 B 2-4-5-8-9 C 2-4-5-7-9 D 2-4-6-7-9 7.在气相色谱定性分析中，实验室之间可以通用的定性参数是（ D ）。 A 调整保留时间 B 校正保留时间C保留时间D相对保留值 三、判断题：（正确-----√；错误----×） 1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标（√） 2. 灵敏度是检测器的主要性能指标（√） 3. 检出限与噪音无关（×） 4. 要提高柱的分离效能，可以考虑增加柱长，增加色谱柱选择性，调节流动相的组成等措施（√） 5. 溶解于流动相中的气体在色谱分离的过程中不会影响流动相的流速和检测器的稳定性（×） 6. 分析一个复杂混合物，恒溶剂洗脱是不能令人满意的。可在分离的过程中连续改变流动相的组成，即所谓梯度洗脱( √)

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项

高效液相色谱仪的操作步骤及注意事项 一、操作步骤： 1.开机前先将流动相过滤和超声：水流动相用混合滤膜（0.2μm）过滤,有机流动相用有机滤膜过滤，之后超声脱气15-20分钟。（过滤的目的是除去流动相里的杂质，以免杂质进入色谱柱堵塞色谱柱；超声的目的是排除流动相里面的气体，以防气体进入色谱柱损害色谱柱，影响柱效能） 注：试验过程中由于只有0.45μm的混合滤膜，第一次使用时感觉效果不好，于是过滤水时同时使用两张混合滤膜过滤水流动相。 2.超声结束后，将流动相放置到规定位置（1号泵接水流动相，2号泵接有机流动相），开机逐个排气（先启动泵，排气结束后再打开检测器）。 3.排气结束后，关闭所有排气阀。先用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，基线走稳之后，再打开水流动相（注意：水流动相和有机流动相流速之和为1ml/min），继续走基线，直到基线平稳。 注意：实验结束后，再用纯有机流动相冲洗色谱柱20-30分钟，冲出色谱柱内残留的样品物质，预防长时间不使用仪器样品的残留物质沉积在色谱柱内，导致下次使用难以冲出，色谱柱柱压偏高，基线不稳，出现大量鬼峰。（不同规格的色谱柱其所允许的最大流速之和不同） 4.走基线时，应将进样阀处于Load状态，用注射器进样时应快速进样，进样后将进样阀立即扳回到Inject状态，此时液相系统开始进入采样状态。采样结束后，可在数据分析里面查看分析结果并可进行编辑，也可以在脱机状态下查看样品的分析结果并编辑。 二、使用中常见的问题及注意事项 1.过滤时有时会出现流动相漏液。可能的原因是滤膜放置不正确（有点偏）和接头有点错位，导致流动相从缝隙中漏出。 注意：操作时，应先向滤瓶内倒入少量流动相，观察是否漏液并开始过滤，若未漏液，再向滤瓶中添加流动相。 2.超声时，瓶外液体的液面应高于瓶内流动相的液面，否则流动相内的气体可能无法排出液体，气体仍然残留在流动相内，以致开机排气时无气泡排出。

最全的液相色谱知识 整理

最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法） HPLC日常维护- 进样阀问题可能原因解决方法 手动进样阀，转动不灵转子密封损坏更换或调整转子密封转子太紧调整转子的松紧度 手动进样阀，载样困难进样阀安装不当重新安装定量环阻塞清洗或更换定量环进样器污染清洗或更换进样器管路阻塞清洗或更换管路 自动进样阀，不能转动无压力（或电源）提供恰当的压力（电源）转子太紧调整转子的松紧度 进样阀安装不当重新安装 自动进样阀，其它问题 阻塞清洗或更换阻塞部件机械故障见随机维修手册控制器故障维修或更换控制器 出现问题可能原因解决方法 保留时间变 化柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱 等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱缓冲液容量不够用>25mmol/L的缓冲液 柱污染每天冲洗柱 柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相 柱快达到寿命采用保护柱 保留时间缩 短流速增加检查泵,重新设定流速 样品超载降低样品量 键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度增加柱恒温 保留时间延 长流速下降管路泄漏,换泵密封圈,排除泵内气泡 硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度降低柱恒温 出现肩峰或 分叉样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂 柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 进样器损坏更换进样器转子 鬼峰进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 样品中未知物处理样品 柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对 色谱)

最新高效液相色谱使用方法

最新高效液相色谱使用方法 一、流动相准备 将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。 二、开机 首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打； 打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。 三、抽气 抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。 抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。 四、调节流动相比例与流速 在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。 五、2410示差检测器的使用 1、打开2410示差检测器开关 2、调整检测器内、外温度 3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。 六、2487紫外检测器的使用 1、打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。 2、设置检测波长 3、预热30分钟左右，即可注样测定。

试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定 一、样品准备 取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80％甲醇，冰箱冷冻。 二、提取 样品放入预冷研钵，加l0ml 80％的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(0～4℃)冷藏14小时以上。 三、过滤 取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180％甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l0~12min，上清液转入冻干瓶中。 四、浓缩 将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80％的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。 五、萃取 提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。 六、过柱纯化 萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用1~2m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。 七、二次浓缩 液体转入蒸发皿中，60℃蒸干，用lml甲醇洗脱。 八、过滤 0．45um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。 九、测定与计算 用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mg／ml。进样量为20ul。 测定条件：流速为lml／min，柱温设定为35℃，测定波长为260nm，流动相甲醇：3％乙醇＝45：55 计算：通过曲线计算样品中激素浓度。

高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总

高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总 1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。 6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7. 设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9．填写登记本，由负责人签字。 10．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 11．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 12．所有过柱子的液体均需严格的过滤。 13．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。 选择波长要从以下几个方面考虑： 1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。

Water 2695 高效液相色谱仪操作规程

Water 2695 高效液相色谱仪操作规程 1目的 用于规范检验人员正确操作使用Waters 2695 高效液相色谱仪。 2 适用范围 适用于使用Waters 2695高效液相色谱仪检测分析的操作管理。 3 职责 使用Waters 2695高效液相色谱仪进行检验的检验员应对本规程负责，相关项目经理负责监督该操作规程的正确执行。 4仪器组成及原理 4.1仪器组成本仪器由Waters 2695 高效液相色谱仪、检测器(2996型二极管阵列检测器、2487紫外检测器、2489紫外检测器、474型荧光检测器)、Empower色谱作站组成。2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机，可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面等组成。 4.2高效液相色谱法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，经色谱柱进行分离，检测器检测分离后的不同组分，数据处理装置记录色谱图或进行数据处理。 5.仪器的操作 5.1仪器的准备 5.1.1 检查流动相（使用前应首先脱气）、在线清洗溶液（10%甲醇-水溶液seal wash）、进样针清洗溶液（90%甲醇-水溶液injector wash）是否足够。 5.1.2 检查色谱柱的使用是否正确（方向是泵出来进检测器的方向，正常的话是色谱柱上所标示的箭头向上；一般情况下不能将色谱柱反过来用，除非柱子确实无法使用可考虑反方向使用）、连接是否有误，有无漏液，废液瓶的容量是否足够。 5.2开机、自检与仪器预备 5.2.1依次开启不间断稳压电源、开启2695 分离单元电源和计算机电源；仪器开始自检（约5～6min），待仪器操作面板上出现“Idle”字样表示自检成功，仪器进入待命状态。 5.2.2按动仪器面板右下方“Menu/Status”键进入操作状态，按动“Direct Function” 功能键，若仪器是首次使用或溶剂的管路充满空气时，先选择Dry Prime，按动OK，对管路进行排空；此时开启仪器下方purge阀，用专用注射器手工抽出管路内部的空气。（此操作一般情况下不会使用） 5.2.3若非5.2.2 状态时，直接以▼键切换到wet Prime，按动OK，对事先设置好流动相溶剂比例的管路进行相应的流动相灌注。 5.2.4 按动“Direct Function” 功能键，以▼键将仪器切换到purge injector状态，按动OK，对针头进行purge。（此操作是为了避免进样针中有气泡导致进样不平行） 5.2.5 在面板上设置流动相流速（flow），各通道溶剂流动比例以及柱温（col Htr）等参数，然后按动Enter。

HPLC基础知识

第一章 高效液相色谱仪的特点 混合物最有效的分离、分析方法。 俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素， 色谱法是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。 特点：高压、高效、高速、高灵敏 适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 与GC 互补性 三、液相色谱组成： （一）、输液系统 泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站（记录仪） （二）、附件 过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。 （三）、工作程序： 液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器 （四）、泵体组成部分： 电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴 （五）、检测器组成部分： 1、电器部分（变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴） 2、光学部分（氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板） （六）、HPLC的分类 1、吸附色谱Adsorption Chromatography 用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 2、分配色谱Partition Chromatography 用载带在固相基体上的固定液做固定相，以不同极溶剂作流动相。依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。 3、离子色谱Ion Chromatography 用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲液做流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography 用化学惰性的多孔性凝胶做固定相，按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。又分： a、Gel Filtration Chromatography（GFC）以水为流动相的体积排阻色谱 b、Gel Permeation Chromatography（GPC）以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱 5、亲和色谱

高效液相色谱法操作规程

标准操作规程 目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。 范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。 责任者：QC主任，设备使用人员。 规程： 依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1.定义及概述： 1.1.高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2.高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3.高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2.高效液相色谱仪的使用要求：

2.1.按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705－90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2，仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3.具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3.操作前的准备： 3.1.流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45μm。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2.供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3.检查上次使用记录和仪器状态：检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4.操作： 4.1.泵的操作； 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速（9ml／min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP）冲洗，关闭排放阀。 ，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2.紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 待稳定后，测试参比和样品光路的信号应符合要求，设置吸收度方式和检测响应时间（一般不大于1秒），设置满刻度吸收值（适用于记录仪）。

agilent高效液相色谱仪标准操作程序

Agilent 1200高效液相色谱仪标准操作程序1.目的 使操作人员的操作步骤规范化. 适用范围2. 适用于仪器安装、调试、校准后正常状态下进行的操作. 3.责任者 质控科仪器分析员对此规程负责. 4.规程 4.1清洗液、流动相、封柱液预处理 4.1.1所有清洗液、流动相、封柱液在使用前均需过滤、脱气以及混合均匀. 4.1.2甲醇-水（10：90）、乙腈-水（10：90）、超净水、乙腈均需存放在棕色溶剂瓶中. 4.1.3含有乙腈的溶液以及不含乙腈但含有较高比例的其他有机溶剂的溶液在过滤时需使用有机相微孔滤膜，其它溶液在过滤时需使用水相微孔滤膜. 1 / 8 4.1.4存放清洗液、流动相、封柱液的溶剂瓶在每次装入溶液前需用少量过滤好的该溶液清洗数次. 4.2接通电源,开启连机电脑,再接通仪器电源,仪器自检完毕，处于准备进行状态.双击桌面图标“仪器1联机”，打开Agilent 1200化学工作站，在左上角下拉框中选择“方法与运行控制”界面.显示如下图

标： 注意：一定要先双击“仪器1联机”图标，进入联机状态，方可双击“仪器1脱机”图标，同时进入脱机界面.否则，将无法联机. 4.2泵 4.2.1 准备清洗液并装入溶剂瓶中，将吸滤器放入瓶内.安装所需用柱子. 2 / 8 单击泵图标阀）打开，，4.2.3 将吹扫阀（即“Purge”选择“设置泵”，将“流速”设置为3.00ml/min.选择清洗液所在通道（建议为A通道），单击“确定”，在“系统视图”中单击“启动”运行泵，泵运行10分

钟后，观察压力，应小于10bar，若大于此压力，应更换purge阀滤芯，调节流速1.00ml/min. 4.2.4关闭purge阀，观察柱压是否正常. 4.2.5选择“控制”，在“用于泵密封垫清洗的泵”（Seal Wash）中选择“定期清洗”，“周期”设置为5min，“持续”设置为0.1min，同时观察试剂架中10%异丙醇是否充足，相应的废液瓶是否有充足空间. 4.2.6 根据“柱使用记录中所规定的方法”清洗柱子约30分钟后，在“控制”组中的“泵”选项中选择“待机”，待系统压力降到10bar 以下后，更换流动相，在“控制”组中的“泵”选项中选择“启动”改用流动相平衡柱子，约30分钟后柱子处于平衡状态.设定所需流速，在“停止时间”中设定所需运行时间，在“后运行时间”设定所需后运行时间；选择“溶剂”项，设定各通道比例，单击“确定”. 4.2.6 如进行梯度分析，在“设置泵”组中选择“时间表”，单击“追加”，根据具体方法进行时间和相应的参数设置. 4.3 柱温箱 单击柱温箱图标，4.3.1在系统视图中，并从菜单中选择“设置柱温箱”，设置“温度”选项，单击“确定”. 4.3.2在实验开始时，用清洗液清洗柱子时，应同时开启柱温箱；在3 / 8 实验结束时，用清洗液清洗柱子时，应关闭柱温箱，让柱子随着清洗过程慢慢冷却.要避免到封柱过程结束后才关闭柱温箱，这会导致柱的寿命减短.

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分

离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。