膜片钳实验技术

脑片膜片钳实验方法

文献综述一

1966年，Yamamoto和McIlwain首次在脑片上记录了电生理活动(1966a, b)，证实了脑组织在体外也能存活，并保持很好的活性状态。此后，该方法在生理学研究中的应用越来越广泛，并为中枢神经系统生理和药理学领域突飞猛进的发展奠定了基础。1989年，Blanton将脑片电生理记录与细胞的膜片钳记录结合起来，建立了脑片膜片钳记录技术，这为在细胞水平研究中枢神经系统离子通道或受体在神经环路中的生理和药理学作用及其机制提供了可能性。

在脑片电生理记录中，实验者可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件，如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等；另外，实验者还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极，同时，可借助一些特殊的加药装置，将一定浓度的药物加到整个脑片或是脑片上的特定区域上，研究电信号沿神经环路的传递规律。在电生理学实验结束后，活性较好的脑片还可用于生物化学或解剖学的分析。这些优点使实验者能获得准确的神经生理学的研究结果，也是其应用较在位大脑广泛的原因所在。

海马脑片是中枢神经系统研究中应用最为广泛标本之一。其原因有以下几点：1、海马与脑的其它部位相对隔离，较易剥离，且剥离后受到的损伤较小；2、海马具有高度分化的片层结构，一方面，海马神经环路在片层中的分布有一定的空间规律，如锥体细胞胞体分布在锥体细胞层，而雪氏侧支突触分布于辐射层，且海马中存在一个三突触联系的回路，即穿通纤维-齿状回颗粒细胞层、苔状纤维-CA3区锥体细胞层、雪氏侧支-CA1区锥体细胞层等，因此，在海马中可以较准确地记录到特定神经元或突触的反应；另一方面，这种板层结构有利于解释在某一部位记录到的细胞外场电位的意义。这些都使海马成为电生理学研究的理想标本。本文对海马脑片膜片钳的操作规程及注意事项总结如下。

一、海马脑片的制备

脑片制备中，海马分离应在断头后10分钟内完成，5~6分钟为宜。在分离海马时，还应注意不要扭转或撕扯海马，更不要损伤海马。分离海马的速度和质量是保证海马脑片制备成功的关键所在。

评价脑片活性最简单的方法是记录脑片上的群峰。在一个状态良好的脑片上记录到的群峰在一个很宽的刺激强度范围内始终是单峰的。出现多个群峰往往提示抑制性突触功能已受损，这是脑片最早的病理生理学改变。如果仅存在突触前纤维群峰(Fiber Volley, FV)，或FV峰大于突触后反应，这提示脑片活性极差，有活性的突触已所剩无几，为激发突触反应需要更多的突触前纤维参与，需中止实验。在活性较好的脑片中，FV峰几乎探测不到，或远远小于突触后反应。

有时会莫名其妙地出现一些问题，突触标本中突触后神经元看上去状态良好，但做了很多天甚至几周都没有得到有用的数据。在这种情况下，须要耐心地思考失败的原因，并设法解决。首先，应该检查溶液，用其它实验室制备的标本或更换实验动物。对于脑片的制备而言，切片机出现的机械故障会损坏脑片的质量。总之，在实验的全过程中能尽量注意每一个细节问题，出现问题后反复尝试，实验就会容易起来。

二、海马脑片的膜片钳记录

1、将刺激电极放置在含突触前纤维脑片区域附近

在突触传递的研究中，应该同时记录突触前和突触后神经元的电信号，虽然，并不是所有突触前神经元胞体的动作电位均可传导至突触(Vincent, 1996)。由于在突触前和突触后两个神经元上同时做膜片钳记录较困难，因此，需要用其它的方法来诱发突触前动作电位的发放。用刺激电极可在单个或多个突触前细胞或轴突诱发动作电位。另外，还可以用局部施加神经递质的方法来诱导动作电位，如用短促的压力、离子电泳或笼锁谷氨酸光解等方法将谷氨酸加到突触前胞体或轴突上，可以诱导出多个动作电位。

用电极刺激在神经元培养皿中，可以用连接了电源(通常是膜片钳放大器)的微电极直接刺激突触前神经元。在这种情况下，通常需要用负压吸引使突触前的细胞贴紧刺激电极，防止刺激电流的逸出。通过膜片钳放大器给脉冲刺激的优点是，它可以记录到突触前细胞被激活的胞外电信号(Role, 1987)。从培养的神经元和脑片上找到有突触联系的一对神经元是很困难的，但在神经元培养中有单个神经元的Autapic突触就会方便许多。

可以用膜片钳电极或尖端较细的一对钨电极给突触前轴突纤维施加电压脉冲。用电极刺激可将Ag/AgCl电极置于孵育槽中与其构成一电流回路。刺激电流一定要与膜片钳放大器记录电路隔离开，以防止刺激电流漏入记录电极中，而使刺激尾迹变得很大。为此，施加刺激需要一个未接地的隔离器。隔离器可以用外界

脉冲刺激或计算机来控制。另外，还需要将刺激尾迹缩小到最小，以排除其对突触信号起始段的干扰。为达到该目的，需将刺激电路的回路电极置于合适的位置或用膜片钳放大器提高串联电阻补偿的效率。

刺激电极的位置通常将刺激微电极或刺激电极置于突触前轴突通过的部位。但有时突触前轴突在制备脑片时即被去除。如果脑片制备时局部神经环路被破坏，实验中就很难成功地记录到突触后电流。实际上，切脑片的角度是保存局部神经环路最重要的因素之一，合适的角度既可使突触后神经元保存完好，也可保留部分较长的突触前纤维用于电刺激。用胞外电极刺激激活的神经纤维较多，而且，每次刺激激活的纤维数目也会不同。如果实验目的是将不同的传导通路分开，那么，必须要证明两个刺激电极激活的纤维各不相同。

2、全细胞记录

用可视化膜片钳寻找清楚、且表面光滑、折光性较好的突触后神经元。在加了正压后，将记录电极移入脑片视野中，并接近事先选好的神经元，然后，调整电极与神经元的相对位置，利用负压形成稳定的高阻封接。用短簇的脉冲负压使细胞破膜，稳定2~3分钟，观察封接测试波形起始段与基线间的差值是否在100pA 以内，封接电阻是否大于200M，如果是，且较稳定，再迅速补偿串联电阻和慢电容，舍弃串联电阻大于30M的细胞，且在记录过程中监测串联电阻的变化，当变化大于20%时，中止记录。如果细胞状态不好，就马上重新制备脑片，以提高实验效率。

3、判断突触前纤维

在记录电刺激的突触反应时，可以验证刺激电极是否放置在突触前神经元或轴突上，在实验中，如果记录不到突触反应，说明刺激电极位置不正确，这时可以稍微移动刺激电极的位置。如果还记录不到，这可能还与组织片活性较差有关，可以更换组织片或改进切片角度加以解决。电刺激方波时程一般设定为

0.1~0.2ms，恒流条件下刺激强度一般为0.1~3mA，恒压条件下刺激强度为5~40V.

4、突触反应的判断及其波幅稳定性的评价

突触信号的判断突触信号样的假象波有三个来源。第一、邻近纤维的活动使静止细胞产生电压波动；第二、如果恒流刺激强度过大，电流就可被注入突触后神经元，使其产生失活时间类似EPSP或EPSC的信号，其信号幅度随刺激强度的变化而变化；第三、直接刺激突触后神经元诱导出突触样的动作电位，这种反应紧接着刺激尾迹发生，没有翻转电位，使突触后神经元膜电位超极化和向记录电极内液中加入10mM 的QX-314，均可避免突触后神经元产生动作电位。但QX-314可阻断多种突触激活的通道(Otis, 1993)，在某些情况下它还可以增加漏电流。

多突触激活通常情况下，刺激电流可激活多个突触前纤维，在突触后可记录到多种突触信号。因此，有必要用一些选择性阻断剂阻断一些不在研究范围内的突触活动。而且，刺激一束纤维，通常可激活多个同种的突触前纤维。不同的刺激强度下，被激活的突触前纤维数目不同，从而引起的突触反应也会不同。因此，要仔细调节刺激部位和刺激强度以便能刺激到单一的轴突(Stevens, 1995; Zhang, 1994a)。胞内刺激突触前细胞是刺激单个轴突最好且最稳定的方法。

甚至在单个突触前神经元被激活后，在突触后记录到的反应也是由多种神经递质共同作用的结果。多突触活动是突触活动的叠加效应，这包括去极化和超级化反应。在一些标本中，这是不可避免的。通常可用药物阻断不在研究范围内的突触活动。提高灌流液中钙镁等二价阳离子的浓度至5mM，以增加动作电位的阈值，就可以有效地减少多突触活动。通常情况下，突触反应是否来自单突触可以根据如下条件来判断：潜伏时在0.5~1.5ms的范围内，高频刺激时突触反应立即消失，突触反应的上升支和下降支较平滑，且无长潜伏时成份(Berry, 1976)。

电刺激引起的突触反应波幅在一定范围内的波动是一种正常现象，但记录过程中有电流衰减发生，当记录过程中电流衰减大于10~15%，就必须中止实验。如果电流衰减不可避免，就需记录较长时间确定电流衰减的速度。低频刺激(0.1~1Hz)下，记录几分钟，观察突触反应波幅的相对稳定性。

电极内液成份与受体敏感性在形成全细胞记录后，胞内成份会被电极内液成份所稀释而发生改变，但在10分钟内即可达到平衡。因此，要记录G蛋白耦联受体的活性时，应向电极内液中加入10~100uM 的GTP(Trussell, 1987)。离子通道耦联的NMDA和GABAA受体的特性在全细胞记录过程中也会随时间的变化而衰减。在记录时可用多种方法来避免或减小其衰减，如提高电极内液EGTA的浓度或用BAPTA等快速络合剂代替EGTA，使胞内钙浓度远远低于1μM；向电极内液中加入mM级的ATP；采用穿孔膜片钳记录等。另外，电极的串联电阻小于10MΩ或突触距胞体较近时受体的敏感性会很快下降。

电压钳制是否准确在电压钳制不足的情况下，记录突触后电流，虽然，可以为突触药理学和突触效能的活动依赖性的改变提供很有用的信息，但这些数据不能用于突触后电流幅度和时程的准确估计。那么，我们如何判断每次记录时电压钳制的质量呢？如果突触后电流来自树突远端，那么，该突触后电流的钳制质量就较低(Silver, 1996)。另外，还有一些判断钳制质量的方法，如突触电流的上升时间较长(如AMPA受体电流的上升时间大于1ms)；在某一突触后电流的翻转电位下可见到双相的突触后电流等。

评价电压钳制质量最常用的方法就是在一次记录后，绘制上升时间对下降时间曲线图。如果上升和下降时间被树突过滤过，则该曲线呈正相关关系，上升或下降时间与幅度间就会呈负相关关系。总之，上升时间受树突过滤的影响要远远大于下降时间。因此，如果随上升时间的变化，下降时间变化较小，这种情况下的下降时间是可靠的(Hestrin, 1990)。需要注意的是，上升时间与下降时间相关性较差并不足以判断电压钳制的质量。Johnston等对树突上突触反应的钳制效果做了深入的讨论(Brown and Johnston, 1983; Spruston, 1993)。Husser (1997)等建议用突触电导随钳制电位的变化来检测树突突触反应的幅度和动力学特性。

在突触后电流较大时也存在钳制的偏差。这时，由电极串联电阻引起的电压降会影响到突触后电流的幅度和形状。若想验证是否存在这个问题，可以向灌流液中加入少许受体的高亲和力的阻断剂，观察突触后电流的时程是否会随其峰值的下降而变化，因为，受体的阻断不会改变其动力学特性(Otis, 1996; Zhang, 1994b)；另外，可以改变串联电阻补偿的水平，观察在不同的补偿水平下突触后电流会不会改变(Llano, 1991; Takahashi, 1995)。在许多情况下，有可能在发现偏差后更正突触后电流的下降时间。值得注意的是，串联电阻可以带来其它的偏差，如对波形的滤波效应。盲法膜片钳记录中，串联电阻通常要大于10MΩ，因此，这种影响是不可避免的。但可以用公式1/(2pRseriesCM)计算记录系统的过滤水平，确定突触后电流峰值和形状受影响的程度。

5、突触反应的记录

现在许多实验室都开始应用膜片钳技术记录培养神经元间、组织片中和异体移植组织中的突触传递。与尖电极记录相比，它具有明显的优势。如，记录的成功率较高，较高的信噪比，能较准确地钳制胞电位等。膜片钳甚至可以应用于在位突触活动的记录(Covey, 1996)。

记录自发突触后反应自发的突触后反应有两个来源。一是局部神经环路中动作电位发放引起的递质释放，另一个是突触囊泡中递质的自发释放，后者被称为微突触反应(miniature synaptic event)。由于动作电位依赖性的自发突触反应幅度与微突触反应差别并不大，因此没有必要将两者区分开来。为记录到很纯的微突触反应，可以用TTX来阻断动作电位依赖性自发突触反应，另外，去除灌流液中的钙或向其中加入钙通道阻断剂镉，即可以阻断电刺激诱发的递质释放。但如果多个囊泡在同一个突触末梢中同步释放，则以上两种方法的效果就不同了(Korn, 1994)。

自发性突触活动的发放频率通常小于几Hz。发育期标本上，自发性突触活动的频率就非常低(Edwards, 1990)，因此，需要记录较长时间才能获得足够用于分析的突触反应。如果自发性突触反应的频率很高，多个突触的反应就会重叠在一起，就不能通过上升或下降支的时间来判断是单个突触反应或是多个突触反应的叠加，从而，给数据分析带来许多麻烦。突触反应的频率受温度的影响较大(Fatt, 1952)，因此，在特定的实验中，可以通过调节灌流液的温度来调整合适的突触反应频率。局部施加去极化或超极化溶液也可以诱发自发突触活动(Bekkers, 1992; Tang, 1994)。在一些标本中，在刺激诱发的突触反应之后，自发性突触反应的频率会显著增高，在含有锶的灌流液中尤其如此(Dodge, 1969; Goda, 1994)。这一事实可用于检测与特定突触活动相关的量子大小(Otis, 1996)。

数据采集突触反应可用计算机软件通过特定的采集卡采集到计算机硬盘上。记录电刺激的突触活动时，还须用计算机产生一个TTL脉冲以激活刺激器，并由隔离器经刺激电极刺激突触前纤维。

所需的数据量电刺激所诱导的突触信号的记录中，其数据量取决于信噪比和信号的变异度。对电刺激诱导的全细胞电流记录而言，高信噪比不是问题，但在记录自发突触信号时，信噪比就变得比较重要了。实验前最好做预实验，估计获得准确的均数所需记录的信号数。当然，也应了解给定的刺激频率下突触信号的稳定性。对于电刺激诱导的突触信号，其峰值的变异系数较小，因此，以0.1Hz的刺激频率记录5~10次就足够了。对于自发性突触信号来说，信号峰值的变异度较大，通常大于20%，为得到较可靠的结果往往需要记录100个以上的信号。实际上，要得出准确的变异，往往需要记录成百上千次信号，这也是得到较可靠的信号峰值分布规律的必要条件。在低频刺激下记录突触信号时，要控制系统误差，使记录保持稳定，须要制备活性较好的标本，并要有配套的稳定的实验条件。精确的测量控制是保证实验数据可靠性的基础，而且，每次实验都要对其进行严格的评价。

6、突触反应的分析

(1) 刺激诱发的突触反应的分析

突触反应的大小和形状突触电流和电位的检测指标有潜伏时(latency)、峰值(amplitude)、10~90%上升时间(10~90% rise time)、1/2峰值时的波宽(half width)、失活的指数拟合时间常数(exponential decay curve)(图1)。潜伏时是刺激尾迹(stimulus artifact)的起始时间到突触电流或电位峰值的5%间的时间间隔(Zhang, 1994a)，潜伏时包括几部分的延迟：突触前轴突发放和传播动作电位的时间、神经末梢去极化到递质释放的突触延迟、递质扩散到突触后并引起受体激活的时间。由于递质扩散和受体激活的速度相当快，因此，突触延迟是突触前神经末梢发放动作电位和出现突触后反应间的时间间隔(Isaacson, 1995; Katz, 1965; Zhang, 1994a)。突触反应的幅度是其峰值与反应前基线间的差值。信噪比较低时，须要计算突触反应前多个点和突触反应峰值前后多个点的均值，然后，以它们间的差值作为突触反应的幅度。上升时间用从峰值的10%到90%的时间描述较为准确。由于潜伏时的存在，很难判断突触反应开始的时间和到达峰值的时间。当刺激尾迹严重地干扰了突触反应起始的判断时，也可以用20~80%上升段的时间来描述上升时间。突触反应时程可以用以下几种方法来描述：1、1/2峰值间的时间，它包括了上升时间和下降时间；2、突触反应的下降支经多种指数拟合(如单指数拟合、双指数拟合和多指数拟合)产生一个或多个时间常数(decay time constant)。

双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF)，即以较短的间隔重复刺激突触前纤维两次，第二次刺激诱发的突触反应大于第一次刺激的现象，这是一种突触前现象，它可反映突触前递质释放概率的变化。

最小刺激诱发的突触反应记录最小刺激(仅能激活一个或少数几个突触前纤维的刺激)诱发的突触反应可

用于估计量子的大小，这种刺激有时可以诱发突触反应(success)，而有时则不能(failure)，其诱导出的突触反应的均值可用于估计单个量子的大小。

可分析电刺激诱发的突触反应的软件有许多常规软件均可用于突触反应的分析，如Axon公司开发的pClAMP软件包，WaveMetrics公司开发的Igor Pro等，均可用于电刺激诱发的突触反应的分析。

(2) 自发性突触反应的分析

突触反应的检测目前有三种方法判断自发性突触反应(Hwang，1999)。第一、峰值超过即定阈值，该方法受基线波动的影响较大，这可以通过基线加以弥补；第二、峰值相对于基线的变化量超过阈值，它受高频噪声的干扰较大，而且，很难设定一个合适的阈值，为克服这些不足，可以在处理时对原始数据进行滤波处理，除去高频噪声；第三、与即定的波形模板进行比较，然后，判断是否突触反应，该方法对符合模板的突触反应具有很高的敏感性，但在设定模板前，必须知道所要研究的突触反应的一系列参数的范围，如果模板设计不合理，将大大降低探测的敏感性，而且这种方式尤其不适于有信号重叠或多个突触成份数据的分析。

PCLAMP 9.0对自发突触反应的分析基于波形模板，只要模板设计得当，探测概率也较高。另外，Copenhagen 等用Igor Pro开发了一个分析程序minifit.ipf。该程序对第二种方法做了一些改进，分三步探测突触反应。第一步，粗筛可能的突触反应，包括它们的起始时间和峰值时间；第二步，用突触反应起始与峰值间的差值计算可能的突触反应的波幅，去除波幅小于阈值的波形；第三步，对起始点之前数点和峰值时间后的多个点取平均值，以排除噪声的影响，并计算两者间的差值对突触反应的峰值做更精确的估计，如果该波幅低于阈值，与会从数据库中被删除。除波幅阈值的判断标准外，该程序还还引入了上升时间、下降时间和波形时程范围等描述波形模板的参数来进一步判断突触反应。该程序还可用于测量突触反应的生物物理学特征。它可计算10~90%上升时间，描述突触反应的上升相的动力学。该程序调用了Levenberg-Marquardt 非线性曲线拟合函数对突触反应的下降相做单指数或双指数拟合，通过双指数拟合与单指数拟合的比较检验，计算其失活时间常数。该程序还提供了一个非常有用的功能，就是将所有记录到的非连续的突触反应以上升支的中点为基础相叠加，做逐点平均，这样，既可以降低噪声，也可以计算其动力学特征参数。

总之，脑片膜片钳记录成功的前提是制备活性较好的脑片，记录条件优化后，实验的稳定性、可重复性和准确性均较高，在神经科学领域应用较为广泛。许多神经毒物可影响中枢神经系统的突触传递功能，脑片膜片钳技术将为实时、准确、高效地研究这些毒物作用的机制提供可靠的技术支持。

膜片钳原理

膜片钳技术原理 可兴奋膜的电学模型 细胞膜由脂类双分子层和和蛋白质构成。脂质层的电导很低，由于双分子层的结构特点，形成了细胞的膜电容，通道蛋白的开闭状况主要决定了膜电导的数值。在细胞膜的电学模型中，膜电容和膜电导构成了一个并联回路。在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的；而由通道蛋白介导的膜电导构成了膜反应的主动成分，它的电流电压关系是非线性的。 当改变跨膜电位时，膜电容和膜电导分别引发被动和主动电流：Im=Ii＋CdV/dt，其中Im是流过膜的总电流，Ii是通道电流，CdV/dt是由膜电容介导的电容电流。为了考察通道电流就必须消除电容电流的影响，此时可以令dV/dt＝0，即将膜电位钳制在一固定数值，使其不随时间变化，这就是电压钳技术的实质所在。 电压钳技术 离子通道的近代观念源于Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代的开创性研究。在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Cole等人在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。1949年Cole在玻璃微电极技术的基础上发明了电压钳位（voltage clamp technique）技术，基本原理如下： 电压钳技术的核心在于将膜电位固定在指令电压的水平，这样才能研究在给定膜电位下膜电流随时间的变化关系。在上图中，膜电位Vm由高输入阻抗的电压跟随器所测量。钳制放大器在比较了膜电位和指令电位E之后，通过电阻Ra将电流注入膜内以控制膜电位。钳制放大器的输出：Vo=A（E－Vm），因为这个输出由电阻Ra和膜所分压，所以输出电流：I=（Vo－Vm）/Ra。由这两个关系可推出：Vm=EA/(1+A)-RaI/（1+A）。因此若钳制放大器的增益A极大，膜电位Vm和指令电位E之间的差别就可以忽略，即实现了电压钳制。 Hodgkin、Huxley和Katz应用电压钳技术研究枪乌贼巨轴突，结合同位素示踪和胞内灌流等技术发现：动作电位的初期，细胞膜主要对钠离子的通透性发生改变，胞外的钠离子迅速内流，并产生所谓的“超射”现象（overshoot）；随后对钠的通透性的急剧减少并且对钾离子的通透性增加。兴奋期的膜电位存在“超射”现象也是膜学说所不能解释的。 根据这些实验，Hodgkin、Huxley和Katz在其1949—1952年的一系列论文中提出了“离子学说”或“钠学说”。认为当膜的去极化超过一个临界值时，就会触发动作电位的产生。在此期间，钠电导迅速上升，钠离子大量内流，使得膜电位接近钠的平衡电位；随后钠电导迅速失活，钾电导逐渐增加，引起膜电位的复极化。 Hodgkin和Huxley通过对电压钳位实验数据的分析，给出了所谓的Hodgkin—Huxley方程。他们将膜电位钳制在不同的水平，观察钾电导或钠电导随时间的变化，然后用一个常微分方程去逼近所得到的实验曲线，而这些微分方程中的参数则假定跟离子通道上的“粒子”相关。根据H—H方程，能够推导出动作电位的阈值、形状、幅度等性质。并且在去除电压钳制的条件下，可以得到一个以电压和时间为变量的偏微分方程，由它可以给出和真实状况相符合的神经冲动的传导。 膜噪声和噪声分析 Katz等人在1970年代初期研究了蛙神经肌肉接头处肌纤维膜电位的波动。他们根据对这种膜电位“噪声”的分析，提出了量子释放的概念，认为神经递质是以囊泡的形式从突触前膜释放到突触间隙中。并且Katz等人借助这种新的“噪声分析”方法（fluctuation analysis），能从突触后膜电位的“噪声”中推测出单位事件的幅度和时程。Anderson、Stevens、Colquhoun和Sigworth等人进一步发展了“噪声分析”。 “噪声分析”的实质在于二项分布期望和方差之间的关系。假定通道只有开和关两个状态，并且各个通道的开关是独立的。若N是通道的总数，p是通道的开放概率，i是单通道电流，I是膜电流的期望值。则有：I=Npi，var(I)=Np(1-p)i2,即：var(I)=iI-I2/N。用var(I)对I作图，这显然是一个开口朝下的抛物线。微分这个二次方程得到曲线的斜率：dvar(I)/dI=i-2I/N,当I=0时的斜率就是单通道电流，根据钳制电位和反转电位之间的差就可以算出单通道电导；在抛物线的顶点即当：dvar(I)/dI=0时，I=Ni/2，由此可算出

检测和校准实验室能力认可准则(17025 2017)

CNAS-CL01 检测和校准实验室能力认可准则 （ISO/IEC 17025:2017）Accreditation criteria for the competenceof testing and calibration laboratories 中国合格评定国家认可委员会 2018 年 09 月 01 日实施

前言 本准则等同采用ISO/IEC 17025:2017《检测和校准实验室能力的通用要求》。 本准则包含了实验室能够证明其运作能力，并出具有效结果的要求。符合本准则的实验室通常也是依据GB/T 19001(ISO 9001, IDT)的原则运作。实验室管理体系符合GB/T 19001的要求，并不证明实验室具有出具技术上有效数据和结果的能力。 本准则要求实验室策划并采取措施应对风险和机遇。应对风险和机遇是提升管理体系有效性、取得改进效果、以及预防负面影响的基础。实验室有责任确定要应对哪些风险和机遇。 中国合格评定国家认可委员会（英文缩写：CNAS）使用本准则作为对检测和校准实验室能力进行认可的基础。为支持特定领域的认可活动，CNAS 还根据不同领域的专业特点，制定一系列的特定领域应用说明，对本准则的要求进行必要的补充说明和解释，但并不增加或减少本准则的要求。 申请CNAS 认可的实验室应同时满足本准则以及相应领域的应用说明。 本准则的附录是资料性附录，不构成要求，旨在帮助理解和实施本准则。 在本准则中使用如下助动词： ——“应”表示要求； ——“宜”表示建议； ——“可”表示允许； ——“能”表示可能或能够。 “注”的内容是理解要求和说明有关要求的指南。

离子通道研究技术的最新进展_全自动膜片钳技术

离子通道研究技术的最新进展———全自动膜片钳技术 曹小于1　郑婉云2　鲁燕滨3　黄　超1 (1.达科为生物技术有限公司　深圳　518054) (2.厦门大学生命科学学院分子细胞神经科学实验室　厦门　361005) (3.南京善康医药科技发展公司　南京　210013) 摘　要　全自动膜片钳技术是离子通道检测技术的最新进展,它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。近来在多个方面作出新的突破,如高的实验通量表现,较高的自动化程度、良好的封接质量、微量加样等。目前,该技术在以离子通道为靶标的药物研发,药物毒理测试以及虚拟药筛等方面有广阔的应用前景。本文对全自动膜片钳仪器的原理和技术细节作全面介绍。 关键词　全自动膜片钳　高通量药筛　hERG检测　虚拟筛选 引言 细胞是通过细胞膜与外界隔离的,在细胞膜上有很多种离子通道,细胞通过这些通道与外界进行离子交换。离子通道在许多细胞活动中都起关键作用,它是生物电活动的基础,在细胞内和细胞间信号传递中起着重要作用。随着基因组测序工作的完成,更多的离子通道基因被鉴定出来,离子通道基因约占1.5%,至少有400个基因编码离子通道。相应的由于离子通道功能改变所引起的中枢及外周疾病也越来越受到重视。以离子通道作为靶标的药物现占总靶标的5%,而潜在的离子通道靶标药物将占总靶标的25%,因此开发离子通道为靶标的药物将具有广阔的市场前景。已知与离子通道有关的疾病主要有:癫痫(ep ilep sy)、心律失常(Cardiac ar2 rhyth m ia)、糖尿病(diabetes)、高血压(hyperten2 si on)、舞蹈症(Huntingt on’s disease)、帕金森症(Par2 kins on’s disease)……。 离子通道的实验研究最初主要来源于生理学实验。1949～1952年,Hodgkin等发展的“电压钳技术”为离子通透性的研究提供技术条件。60年代中期,一些特异性通道抑制剂的发现为离子通道的研究提供有力武器。1976年Neher和Sak mann发展的膜片钳技术直接记录离子单通道电流,为从分子水平上研究离子通道提供直接手段。80年代中期,生化技术的进步,分子生物学以及基因重组技术的发展,使人们能够分离纯化许多不同的通道蛋白,直接研究离子通道的结构与功能关系(见表1)。 表1　传统膜片钳技术主要优缺点总结 优　点缺　点 A高信息量:能改变细胞膜电位,单细胞记录A需要受过良好训练的电生理学专家 B高灵敏性:能记录到pA级电流变化和单通道B通量很低,一天的实验数据量不超过10 　开关状态C劳动力投入密集,试验操作过程复杂 C灵活性好:可以控制改变细胞膜内外的溶液成分D不适合药物粗筛/二次筛选 D应用范围广:可以分析检测所有的离子通道类型E技术自动化非常困难,且不能进行平行检测E相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权 　威性和精确性〔1〕 1　多款全自动膜片钳系统分析 1.1　技术实现原理 Nani on公司的PatchL iner NPCκ216,Molecular Devices公司的I on works HT和PatchXp ress7000A 全部采用的是平板微阵列技术。其技术特点如下:在平板电极上打磨或者使用金属离子轰击成孔,每孔都是大小均一的直径约1～2μm的小孔,每个小孔下面有电极连接到放大器,可对实验过程中的电流变化进行记录。将细胞悬浮液加载到平板玻璃孔上,通过调节压力和吸力,一个细胞便可以自动定位在小孔上(相当于微管电极的尖端),自动进行封接,自动判断封接并进一步施加负压破膜以进行全细胞模式实验〔4,5〕。

膜片钳技术的发展和应用

膜片钳的发展和应用 1．背景 细胞是生物的基本组成单元，细胞外围有一层薄膜，彼此分离又互相联系，细胞间与细胞内的通信、信号传递依靠其膜上的离子通道来进行，离子和离子通道是细胞兴奋性的基础，亦是产生生物电的基础。生物电信号通常是用电学或电子学的方法进行测量。早期多采用双电极电压钳技术作胞内记录，近年来逐渐被膜片钳所取代，这项技术为从细胞和分子水平了解生物膜离子单通道“开启”和“关闭”的门控动力学及各种不同离子通道的通透性和选择性等膜信息提供了最直接的手段。 膜片钳记录(patch clamp recording)是利用玻璃微电极吸引封接面积仅为几个um2的细胞膜片，在10-12A水平，记录单个或几个通道的离子电流，已达到当今电子测量的极限。此技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。从而点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。 2．膜片钳技术简介 2.1 基本原理和记录方法 电压钳(V oltage-clamp)是由英国学者Huxley和Katz最先应用的[1]。其实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流，保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化，因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道的活动，但该技术由于在细胞内插人两根电扳，对细胞损伤很大，在小细胞中难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致，而逐渐被膜片钳所取代。 膜片钳技术(patch-clamp)是在电压钳基础上发展起来一种新技术，与电压钳的主要区别有二：一是钳制膜电位的方法不同；二是电位固定的细胞膜面积不同，即所研究的离子通道数目不同。与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域(膜片)形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一(或多数)离子通道的分子活动[2]。1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级(10-12 A)的微弱电流[3,4]。1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10 us和1 um。 随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式： (1)细胞吸附式(cell-attached patch)将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面, 形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。 (2)内面向外模式(inside-out patch)高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。

ISO17025实验室认可准则--考核试卷

ISO17025实验室认可准则考核试卷 一.多项选择题（每题3分，共45分） 1. ISO/IEC17025-2005规定了实验室能力的通用要求，包括使用 _______ 所进行的测试和校准。 ①标准方法；②非标准方法；③实验室制定的方法。 2 ?取样记录必须包括___________ 。 ①取样人的识别；②取样程序；③环境条件（若有关） 3.如果实验室的工作要偏离测试和校准方法，则只要在这种偏离已经___________ 后才允许存在。 ① 被文件化；②经过技术验证经过批准；③ 被客户认可。 4?如果经评价认为实验室的不符合工作____________ 时，必须立即运行纠正措施程序。 ① 比较严重；②可能再次发生；③对实验室的运行与其政策和程序的符合性产生怀疑。 5?实验室的内部审核必须由____________ 的人员承担。 ①经过培训；②具备资格；③尽可能独立与被审核活动。 6?实验室的技术管理层全面负责__________ 。 ① 技术工作；②所须资源供应；③体系管理工作。 7. ___________________________ 实验室采取纠正措施必须入手。 ① 纠正错误；②调查确定问题的根本原因；③确定有关人员的责任。

8. ___________________________ 实验室的质量方针必须有批准发布。 ① 主要管理者；②实验室主任；③ 实验室的上级领导。 9?除非__________ ，否则实验室要为分包的工作向客户负责。 ① 客户指定分包方；②管理机构指定分包方；③分包方愿意承担责任。 10?实验室采取纠正措施的力度必须与_________ 相适应。 ① 问题的严重性；② 问题的危险性；③实验室管理者的要求。 ①停止使用；②单独放置或加贴明显的停用标签或标记；③立即清理出实验室。 二.判断题（每题1分，共35分） 1 ?实验室的客户可以依据本认可准则对实验室能力进行确认。（） 2?实验室的运作应符合有关规定和安全要求。（） 3?实验室本身必须是能承担法律责任的实体。（） 4?实验室的质量手册中必须规定技术管理者和质量经理的作用和责任。（） 5?实验室的作废文件必须销毁，不得保留。（） 6?实验室必须事先将分包协议书面通知客户。（） 7.影响实验室输出质量的物品的采购文件的技术内容必须经过审批后发布。（） 8 ?需要采取纠正措施时，实验室须选择并实施最有可能消除问题并防止其再次发生的措施。 （） 9?实验室须确定必要的改进机会和潜在的不合格原因，无论它使技术方面的或是与质量体系有关的。（） 10?对于影响检测和校准质量的区域，实验室必须根据其特定情况规定控制范围。（） 11?进行检测时，实验室制订的方法如果适合于预定用途并且经过确认，也可以采用。（）12?如果客户推荐的方法已过时，实验室可以直接予以更改，不需通知客户。（）

17025实验室认可准则

SO17025/实验室认可目录一实验室认可的意义6 1. 什么是实验室认可？6 2. 在实验室认可活动中的实验室有什么涵义？ 6 3. 实验室的顾客有哪些？ 7 4. 我国为什么要推行实验室认可？ 7 5. 与实验室认可有关的组织有哪些？8 6. 使用认可实验室如何有益于政府？9 7. 认可实验室是如何得到国际承认的？9 8. 实验室为什么要申请认可？10 9. 实验室是否需要申请多重认可？11 10. 实验室申请认可需满足什么条件？11 11. 实验室认可是完全自愿的吗？12 12. 认可和认证有什么不同？12 13. 实验室认可和ISO9000 认证有什么关系？13 14. 实验室认可对全球测量一致性起什么作用？14 15. 实验室认可和合格评定有什么关系？14 二质量要素的理解16 16. 为什么要建立质量管理体系？16 17. 最高管理者、技术管理层和质量主管在实验室中各担负哪些职责？16 18. 纠正措施的实施由技术管理层负责，还是质量主管负责？16 19. 质量主管是否应对检测/校准质量承担领导责任？17 20. 在检测/校准活动中，实验室员工应对顾客的什么信息承担保密责任？17 21. 如何绘制组织结构图？18 22. 实验室可分配的资源和可使用的权利有哪些？18 23. 什么是二级法人的实验室？19 24. 二级法人的实验室如何做到质量活动的公正性？19 25. 组织结构的功能是什么？20 26. 如何进行实验室的组织设计？20 27. 质量管理和全面质量管理的目标是什么？21 28. 实验室如何加强质量管理？22 29. 监督员如何实施日常质量监督？22 30. 质量管理部门和监督员的工作有何不同？23 31. 怎样做到“足够的”监督？23 32. 监

膜片钳使用规则

膜片钳使用规则 一、工作原理： 1.膜片钳是一种可以直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。其基本原理是用一个尖端光洁，直径约为0.5~3um 的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极另一端开口处施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在这一小片膜周边与微电极开口处的玻璃边沿之间，会形成紧密的封接，其电阻可达数个或数十个千兆欧，这实际上把吸附在微电极尖端开口处的那一片膜同其余部分的膜在化学上完全隔离出来，由微电极记录到的电流变化只同该膜片中通道分子的功能状态有关。如果在这一小片膜中只包含了一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。 二、操作步骤： 1.打开总电源。 2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。 3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。 4.灌注玻璃电极并排空气体。 5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。 6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。

7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。 8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。 9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。 10.用毕请关闭仪器，并切断总电源。 三、注意事项： 1.每天做实验前请用清水拖地，以防尘埃、静电伤害机器。 2.拉制仪使用前需预热15-30min。 3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次 氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换 次氯酸钠。 4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。 5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时 才可关闭。 6.在放大器打开时绝对不能用手、金属物品或其它导电的物品接触 电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。 7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（1cm左右为适），以防液 体进入银丝底部增加噪声。 8.安装玻璃微电极时，电极应与银丝平行，防止刮蹭银丝电极。 9.玻璃微电极需先用甲醇浸泡，再用酒精灯微烧两端，使其平滑。 10.换液时应时刻观察浴槽，防止液面过低或液体溢出污染镜头，最 适液面为微高于出液口。

检测和校准实验室认可准则培训测试题

《检测和校准实验室认可准则》培训考核试题姓名__________班组________分数_________ 一．填空题:(在横线上填出正确的答案) https://www.docsj.com/doc/b010424268.html,AS-CL01：2006标准的中文名称是。 ：2006等同采用国际标准。 3.实验室的职责是以的方式从事检测和校准,并能满足、或需求。 4.质量监督人员的任职条件是和。 5.凡作为管理体系组成部分发给实验室人员的所有文件、在发布之前应 由。 6.实验室应有选择和购买有影响和 的政策和程序.还应有与检测和校准有关的和的购买、 和的程序。 7.“纠正”的定义是: 8.的定义是为消除已发现的不合格或其他不期望情况的原 因所采取的措施。 9.的定义是为消除潜在不合格或其他潜在不期望情况的原因所采取的措 施。 10.记录分为和两类。 11.内审的目的是。 12.审核应由和的人员来执行,且只要资源允许,审核人员应独立于。 13.管理评审是执行管理层定期对实验室的和 进行评审,以确保其持续和,并进行必要的。 14.实验室应对、和及实行 有效的监督。

15.管理层应授权专门人员进行、 以及。 16.对检测和校准方法的偏离,仅应在该偏离、、 和情况下才允许发生。 17.实验室应对、、 、进行确认,以证实该方法适用于预期的用途。 18.意味着对测量结果可信性、有效性的怀疑程度或不肯定程 度,是定量证明测量结果的质量的一个参数。 19.当需要利用以维持设备校准状态的可信度时,应按照 进行。 20.用于检测和(或)校准的所有设备,包括对检测、校准和抽样结果的准确 性或有效性有显着影响的辅助测量设备,在投入使用前应。 二.判断题:正确请打“√”错误请打“╳” 1.文件控制程序只需清楚规定内部文件,如质量手册、程序文件、作业指导 书如何控制,而不需规定外部文件,比如标准规范如何进行控制。() 2.实验室可根据不同类型的委托书、标书或合同，按照不同的规定实施评 审。() 3.实验室应保存合理的申诉和投诉及处理结果的记录并按规定保存。() 4.客户只需得到检测结果即可,无权到实验室监视与其工作有关的操 作。() 5.客户的抱怨一定要及时处理,但抱怨及对此开展的调查和纠正措施不一 定要予以记录。() 6.记录的修改只可划改,不能涂改、描改,且划改处应有改动人的签名或签 名缩写。() 7.实验室不但要确保固定设施的环境不会对测量质量产生影响,更要注意

膜片钳记录和分析技术

膜片钳记录和分析技术 2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：2186 关键词：膜片钳细胞信号 分享到： ?收藏夹 ?腾讯微博 ?新浪微博 ?开心网 细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信,是依靠其膜上的离子通道进行的，离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。由此形成了一门细胞学科-电生理学（electrophysiology），即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。 早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。现代膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的。 1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术）。以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。 一、膜片钳技术发展历史 1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位

的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。 1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GW10-100G?的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。 1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率。 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。 二、膜片钳技术原理 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来（见下图），由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的（或多个的离子通道分子活动的技术。些技术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的弊端。

膜片钳技术在药学研究中的应用

膜片钳技术在药学研究中的应用 前言 德国物理学家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片钳技术（patch clamp technique）是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多数的）离子通道活动的技术，已被广泛应用。作为先进的细胞电生理技术，它一直被奉为研究离子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在，并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。 关键词膜片钳技术；药学研究；应用 Abstract [ ]The patch-clamp technique , a dominant technique in cellular electrophysiology , is always being regarded as the gold standard for ion channel research.. Application of the patch-clamp technique can demonstrate the existences of ion channels and provide valuable information for ion channels, including their electrophysiological properties , molecular structures and the mechanism of drug action .Genomics and proteomics research has showed that the development of drugs for ion channel target would be very promising in future. Key words Patch-clamp technique ; Study on Medicinal chemistry ; Application 80年代初发展起来的膜片钳技术（patch clamp technique）为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段，该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其它生物现象有更进一步的了解，而且基因组学、蛋白质组学研究表明，以离子通道为靶标的药物研究在未来具有很大的发展空间。为了突破由于筛选技术所造成的对离子通道为靶标的药物开发的瓶颈，近年来，对膜片钳技术进行了改进以适合药物高通量筛选的要求，由此产生了一些技术。 一、膜片钳技术原理及特点

膜片钳技术原理与基本操作

膜片钳技术原理与基本操作 1976 年Neher 和Sakmann 建立了膜片钳技术（Patch clamp technique），这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多数的离子通道分子活动的技术。1981 年Hamill, Neher 等人又对膜片钳实验方法和电子线路进行了改进，形成了当今广泛应用的膜片钳实验技术。该技术可应用于许多细胞系的研究，也是目前唯一可记录一个蛋白分子电活动的方法，膜片钳技术和克隆技术并驾齐驱给生命科学研究带来了巨大的前进动力，这一伟大的贡献，使Neher 和Sakmann 获得1991 年诺贝尔医学与生理学奖。 一、膜片钳技术的基本原理 用一个尖端直径在1.5~3.0μm 的玻璃微电极接触细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接，此时电极尖端下的细胞膜小区域（膜片，patch）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定（钳制，Clamp）电位，对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。 基本的仪器设备有膜片钳放大器、计算机、倒置显微镜、示波器、双步电极拉制器、三轴液压显微操纵器、屏蔽防震实验台、恒温标本灌流槽、玻璃微电极研磨器。膜片钳放大器是离子单通道测定和全细胞记录的关键设备，具有高灵敏度、高增益、低噪音及高输入阻抗。膜片钳放大器是通过单根电极对细胞或膜片进行钳制的同时记录离子流经通道所产生的电流。膜片钳放大器的核心部分是以运算放大器和反馈电阻构成的电流-电压（I-V）转换器，运算放大器作为电压控制器自动控制，使钳制电位稳定在一定的水平上。 二、操作步骤 1.膜片钳微电极制作 (1) 玻璃毛细管的选择：有二种玻璃类型，一是软质的苏打玻璃，另一是硬质的硼硅酸盐玻璃。软质玻璃在拉制和抛光成弹头形尖端时锥度陡直，可降低电极的串联电阻，对膜片钳的全细胞记录模式很有利；硬质玻璃的噪声低，在单通道记录时多选用。玻璃毛细管的直径应符合电极支架的规格，一般外部直径在 1.1~1.2mm。内径1mm。 (2) 电极的拉制：分二步拉制。第一部是使玻璃管中间拉长成一窄细状，第二次拉制窄细部位断成二根，其尖端直径一般在1~5μm，充入电极内液后电极电阻在1~5MΩ为宜。调节第一步和第二步拉制时加热线圈的电流强度，即可得到所需要的电极尖端直径。电极必须保持干净，应现用现拉制。 (3) 涂硅酮树酯：记录单通道电流时，为了克服热噪声、封接阻抗噪声及电极浸入溶液产生的浮游电容性噪声，需要在电极尖颈部（距离微电极尖端50mm）的表面薄薄地涂一层硅酮树酯（sylgard），它具有疏水性、与玻璃交融密切、非导

实验室生物安全认可规则

CNAS-RL05 实验室生物安全认可规则 Rules for the Accreditation of Laboratory Biosafety 中国合格评定国家认可委员会

目录 前言 (2) 1 范围 (3) 2 引用文件 (3) 3 术语和定义 (3) 4 申请认可条件 (3) 5 认可流程 (3) 5.1初次认可 (3) 5.1.1意向申请 (3) 5.1.2正式申请 (4) 5.1.3受理 (4) 5.1.4评审准备 (4) 5.1.5 现场评审 (4) 5.1.6评定 (5) 5.1.7 批准发证 (5) 5.2监督评审 (5) 5.2.1定期监督评审 (5) 5.2.2 不定期监督评审 (5) 5.3复评审 (6) 6 变更 (6) 6.1获得认可的实验室的变更 (6) 6.1.1变更通知 (6) 6.1.2变更的处理 (6) 6.2认可要求的变更 (7) 7 暂停、恢复、撤销和注销认可 (7) 7.1暂停认可 (7) 7.2恢复认可 (7) 7.3撤销认可 (7) 7.4注销认可 (7) 8 权利和义务 (8) 8.1 CNAS的权利和义务 (8) 8.2 实验室的权利和义务 (8) 8.2.1 申请认可实验室的权利和义务 (8) 8.2.2 获准认可实验室的权利和义务 (9)

前言 中国合格评定国家认可委员会（英文缩写：CNAS）是经国务院认证认可监督管理部门批准设立并授权，统一负责实验室和检验机构等认可及相关工作的国家认可机构；遵循的原则是：客观公正、科学规范、权威信誉、廉洁高效。认可规则是CNAS 认可工作公正性和规范性的重要保障，CNAS依据国家有关法律法规和《中国合格评定国家认可委员会章程》制定本规则。 根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》和《中华人民共和国认证认可条例》，国务院认证认可监督管理部门授权CNAS 依照实验室生物安全认可准则，统一实施实验室生物安全认可工作。 CNAS 实验室生物安全认可准则采用《实验室生物安全通用要求》（GB19489）和《病原微生物实验室生物安全管理条例》中适用的明确规定；CNAS对实验室生物安全认可范围仅限于CNAS实验室生物安全认可准则的要求。 CNAS 应对通过认可的实验室颁发相应生物安全防护水平等级的认可证书。获得CNAS认可的实验室还应依据国家其他相关规定申请开展实验室活动的资格。 本规则是CNAS认可活动的程序和要求，包括认可条件、认可流程、变更、暂停、恢复、撤销、注销认可以及已认可实验室的权利和义务等。 本规则内容为强制性要求。 本规则于2016年制订，本次为第一次修订，修订后文件版本号不变。

膜片钳技术SOP

膜片钳技术SOP 关键词：膜片钳 目的： 研究膜片上几个甚至一个离子通道的电流，对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，来反映细胞膜上离子通道活动，为研究离子通道结构与功能关系提供关于生物电特性的新资料。基本原理： 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。

药品和试剂： 根据不同的实验设计选择不同的药品和试剂。 主要仪器设备与材料： ①屏蔽防震实验台(TMC 63-544) ②数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China） ③微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan） ④微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan） ⑤电子刺激器（SEN-2030, NIHON KOHDEN, Japan） ⑥膜片钳放大器（AXOPATCH 200B Axon Instruments U.S.A） ⑦倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany） ⑧计算机（PⅢ 800） ⑨A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 Axon Instruments U.S.A） ⑩pClamp软件（10.0）Axon Instruments U.S.A ) 实验对象： 兔、大鼠、猪、和人的组织细胞（直径小于30μm的细胞），都可用于膜片钳实验。动物由泸州医学院（许可证号：SYXK（川）2008-063）提供；人体组织来源于临床手术丢弃物。本SOP以猪冠状动脉平滑肌细胞为例，选取体重约120～150 Kg的猪，雌雄不拘，猪心脏购自泸州市屠宰场。 实验环境： 常温（22o C）下进行, 湿度（70-80%） 操作步骤： 1.液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，可参考相应的文献进行调整。包括：电极液；细胞外液等。基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。（详见细胞的分离与培养SOP：L Y-XJD-SYJS-014/015） 2.标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，

膜片钳的发展与应用

膜片钳技术的发展与应用 崔梦梦 （生命科学学院 1241410026） 摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录 单一离子通道的电流。膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨 率和10us的时间分辨率。作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离 子通道的“金标准”。应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其 电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。此外，将膜片钳技术与 其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物 学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。 关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用 在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。 随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 一、膜片钳技术的基本原理 膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。电极尖端的直径一般可达0.5um，它与膜的高阻封接可达到10亿欧，因而极大提高了膜片钳技术的可靠性和灵敏度。 二、膜片钳技术的改进与新进展 （一）穿孔膜片钳技术 1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术。即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。该技术中，抗生素形成孔道的有效半径为0.4—0.8 nm，可以选择性地通透Na+ 、K+ 、Li+ 、Cs+ 、Cl- 等一价离子，使细胞内环境相对稳定，电

全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用

全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用 来源：易生物浏览次数：513 网友评论0 条 全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用一：全自动膜片钳技术介绍：膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch... 关键词：应用药物全自动通道细胞研究 全自动膜片钳技术及其在药物筛选中的应用 一：全自动膜片钳技术介绍： 膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。是研究离子通道的最重要的技术。目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional pat ch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。 传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！签于全自动膜片钳技术的这些优点，目前已经广泛的用于药物筛选。 传统膜片钳技术主要优缺点总结 全自动膜片钳技术的发展，经历了下列三个发展阶段，在每个阶段，所采取的原理和技术有所不同： 1. Flip-Tip翻转技术： 将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。随后,药物化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。这种方式形成

膜片钳技术

2008级硕士研究生膜片钳技术试题 请用A4纸书面手写，严禁抄袭。下学期开学后两周内交于先知楼2002室陆巍老师处，过期不侯！ 问答题（共100分） 1、什么是膜片钳技术？它的基本工作原理是什么？ 答：膜片钳技术是以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术，具体说来就是利用微玻管（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接，使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）(10-12A)进行监测记录的方法。 膜片箝的基本原理是：用一个尖端光洁、直径约0.5-3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触而不刺入，然后在微电极的另一段开口施加适当的负压，将与电极尖端接触的那一小片膜轻度吸入电极尖端的纤细开口，这样在小片膜周边与微电极开口的玻璃之间形成紧密封接，在理想状态下电阻可达数十兆欧。实际上把吸附在微电极尖端开口的那小片膜同其余部分的膜在电学上完全分开，如果这小片膜上只含一个或几个通道分子，那么微电极就可以测量出单一开放的离子电流或电导，对离子通道的其他功能进行研究。 2、膜片钳记录方法分为四类？各有何特点？ 答：膜片箝有四种分类： （1）单通道记录法-细胞吸附模式（Cell-attached Mode） 微电极在显微镜下贴近细胞后，给微电极施加一负压，形成高阻抗封接。此时可看到背景噪音明显减少，通常选取电极下仅有一个通道的膜片进行分析，即单通道记录，以利于不失真的观察一个通道的活动状态。该方法的优点是对细胞膜结构和调制系统干扰最小，能准确反映通道的活动状态并对此进行客观分析。但缺点是电流小，分辨率地，对技术要求高，难度较大，且工作量大而成功率又较低。 (2)全细胞记录法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再给一个很小的负压，将电极覆盖的膜吸破，使电极内与整个细胞内相通，用这个方法可记录进出整个细胞的电流。该方法的优点是电流大，信噪比好，既可以做电流钳制又可以做电压钳制，且可以改变细胞内容物。但此法只能用于直径小于3μ的细胞，且仅能观察膜电流的变化，不能分析变化的产生机制。 (3)膜内面向外式（Inside-out） 按照细胞密着式将电极封接好之后，再将电极拉开，使之与胞体脱离即可，也是用以记录封在电极尖端口下的膜片中的离子通道电流。是在细胞吸附式的基础上改进而成。其优点是可以观察化学因素对细胞膜内侧面结构的影响，但其操作难度较高。 (4)膜外面向外（Outside-out）在全息胞记录式的基础上，拉开电极使之与胞体脱离，这是附在电极尖端的膜片又可自动地将电极尖端口封住。此膜片的外侧面向外其是在全细胞记录的基础上改进而成，优点是可以分别观察化学因素对细胞膜外侧面结构的影响。 3、膜片钳技术的应用范围有哪些？ 答：应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性,同时可发现新的离子通道及亚型,并能在记录单细胞电流和全细胞电流