高效液相色谱知识收藏文件
高效液相色谱知识收藏
Agilent1100高压液相色谱仪差不多操作步骤Agilent1100液相差不多操作步骤
Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：
高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法
液相色谱柱使用及保养
高压液相色谱HPLC培训教程(一)
高压液相色谱HPLC培训教程(七)
高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生
HPLC对流淌相的差不多要求
高效液相色谱
Waters 600E-2487 HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项
色谱扫盲班
Agilent1100高压液相色谱仪差不多操作步骤Agilent1100液相差不多操作步骤
(一)、开机：
1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
5、把流淌相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge阀。
7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。
8 、设Flow：5ml/min，单击OK。
9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换信道接着Purge，直到所有要用信道无气泡为止。
10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purge valve。
11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。
（二）数据采集方法编辑：
1、开始编辑完整方法：
●从“Method”菜单中选择“Edit entire method”项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单击Ok，进入下一画面。
2、方法信息：
●在“Method Comments”中加入方法的信息（如：方法的用途等）。
●单击Ok 进入下一画面。
3、泵参数设定：（以二元泵为例）
●在“Flow”处输入流量,如1ml/min，在“Solvent B”处输入70.0,(A=100-B) ,也可Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以爱护柱子。
●单击Ok进入下一画面。
4、自动进样器参数设定:
●选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为6号。“Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----能够输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”---能够点击Edit 键进行进样程序编辑。
●点击Ok进入下一画面。
5、柱温箱参数设定:
●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>”键,如图所示,选中”Same as left”---使柱温箱的温度左右一致。
●点击ok进入下一画面。
6、VWD检测器参数设定:
●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时刻, 如>0.1min (2s)。
●在Timetable 中能够“Insert”一行，输入随时刻切换的波长，如1min ，波长=300nm。点击ok进入下一画面。
7、DAD检测器参数设定:
●检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长
=350nm,BW=100nm;
●检测波长：一般选择最大汲取处的波长。样品带宽BW：一般选择最大汲取值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无汲取或低汲取区域。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit—狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时能够输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。
●点击Ok进入下一画面。
8、RID检测器参数设定:
●色谱条件:
进样体积: 20ul 。光学单元温
度: Off 。
极性: 正。峰宽(响应时刻) : 4s 。
●“Optical Unit Temperature”---若环境温度操纵在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”---大多数分析
设为4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”---在不进行分析时能够让流淌相循环，节约流淌相，检测器连续运行，可随时投入使用。
●点击RID图标，选择RID Control ：Heater 设为On，若要循环流淌相，必须将“Recycling Valve”设为ON。手动purge 参比池，将其设为On，并输入Purge 时刻。
9、FLD检测器参数设定:
色谱条件：
●样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为
1:10。
●进样体积：5ul。
●柱温箱: 30℃。 EX=246nm,
EM=317nm ,PMT=10。
●响应时刻=4s. 停止时刻：出峰完毕。
● Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。
● Emission: 发射波长: 280-900nm, 步长为1nm,或Zero Order。
● PMT: 大多数应用适当的设定值为10,若
高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。
●“Peak width”：大多数应用设为4s，只有快速分析采纳小的设定值。
● Multi Ex ：多波长及光谱（激发）。
● Multi Em：多波长及光谱（发射）。
●同时能够输入范围Range、步长step、采集光谱。
10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，单击Ok。
11、单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”，单击Ok。
12、从菜单“View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击
Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows 2)。
13、从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。
区不: Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器
会将上次的数据覆盖。Prefix—在Prefix 框中输入前缀，在Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如vwd0001，vwd0002……。
14、从Instrument 菜单选择System on。
15、等仪器Ready，基线平稳，从Method菜单中选择“Run method”，进样。
（三）、数据分析方法编辑:
1、从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面。
2、从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击Ok。
3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项，。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时刻，单击ok,或选择”Use Ranges”调整。反复进行，直到图的比例合适为止。
4、积分:
(1)、从“Integration”中选择“Auto integrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。
(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分。
(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到中意为止。
(4)、单击左边“√”图标，将积分参数存入方法。
5、打印报告:
(1)、从“Report”菜单中选择“Specify report”选项，进入如上画面。
(2)、单击“Quantitative Results”框中Calculate
右侧的黑三角，选中Percent（面积百分比），其它选项不变。
(3)、单击Ok.
(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击Report 底部的“Print”钮。
(四)、关机:
●关机前，用 100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
●退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。
关掉Agilent 1100电源开关。
Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：
1、色谱柱长时刻不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN 适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）
2、关于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
3、流淌相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。
4、带seal-wash的 1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度虹吸排出，溶剂不能干涸。
5、其它主意事项见讲明书，或由现场工程师介绍。
维护知识问答
1、为什幺溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤特不重要，它会对色谱柱、仪器起到爱护作用，消除由于污染对分析结果的阻碍。
色谱柱：由于填料颗粒专门细，色谱柱内腔专门小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
样品过滤头的类型：
30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。
13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。
3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特不适用于水基溶液，推举用于蛋白质和其相关样品。
尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。
再生纤维素滤膜：具有蛋白汲取低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
2、为什幺HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？
HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒特不坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在
高效液相色谱(HPLC)基础知识
高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 方法项目 数量 1985年版1990年版1995年版2000年版 HPLC法 鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用
碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色 谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用 液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在 5
高效液相色谱操作知识
高效液相色谱操作知识 （一）高压恒流泵的维护注意事项 泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。应采取下列措施以延长使用寿命： 绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。 要用HPLC级试剂 输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。压力下限应设置在0.5~1MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。 (二)流动相使用的注意事项 必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45?m薄膜过滤。 过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 几种脱气方法比较： 1、氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。 2、加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 3、抽真空脱气法：易抽走有机相 4、超声脱气法：一种较为常见的脱气法。流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10~15 分钟，此法效果并不太好但操作简单。 如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相： 浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜 特别注意HPLC使用过后的系统清洗： 含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法： 1、先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。 此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗 2、再用5：95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。 3、最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。
高效液相试题及答案
高效液相色谱基础知识测试 一、填空题 1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是：安捷伦1260 。高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。 2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。 3、本公司所用的高效液相，为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化，影响分离效果。一般采用C18（十八烷基硅烷键合硅胶）填料的色谱柱，最高工作压力为400 bar。 4、高效液相根据流动相与固定相极性分为：正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。 5、开机步骤：接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。 6、高效液相的维护：最后一次进样完成后，应用流动相冲洗20分钟，以保证洗脱完全，若流动相中含有无机盐类，应用高纯水冲洗30分钟，。 7、进样器的保养：每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。 8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器，氢火焰检测器，电子捕获检测器和火焰光度检测器。 二、选择题 1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（D ） A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用( A )
A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( B ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是( A ) A.示差折光检测器 B.极谱检测器 C.荧光检测器 D.电化学检测器 5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.Ｕ形柱 D.螺旋形柱 6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是（B ）。(1)光源；(2)气路系统；(3)单色器系统；(4)进样系统；(5)分离系统；(6)吸收系统；(7)电导池；(8)检测系统；(9)记录系统。 A 1-3-6-8-9 B 2-4-5-8-9 C 2-4-5-7-9 D 2-4-6-7-9 7.在气相色谱定性分析中，实验室之间可以通用的定性参数是（ D ）。 A 调整保留时间 B 校正保留时间C保留时间D相对保留值 三、判断题：（正确-----√；错误----×） 1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标（√） 2. 灵敏度是检测器的主要性能指标（√） 3. 检出限与噪音无关（×） 4. 要提高柱的分离效能，可以考虑增加柱长，增加色谱柱选择性，调节流动相的组成等措施（√） 5. 溶解于流动相中的气体在色谱分离的过程中不会影响流动相的流速和检测器的稳定性（×） 6. 分析一个复杂混合物，恒溶剂洗脱是不能令人满意的。可在分离的过程中连续改变流动相的组成，即所谓梯度洗脱( √)
最全的液相色谱知识 整理
最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法） HPLC日常维护- 进样阀问题可能原因解决方法 手动进样阀，转动不灵转子密封损坏更换或调整转子密封转子太紧调整转子的松紧度 手动进样阀，载样困难进样阀安装不当重新安装定量环阻塞清洗或更换定量环进样器污染清洗或更换进样器管路阻塞清洗或更换管路 自动进样阀，不能转动无压力（或电源）提供恰当的压力（电源）转子太紧调整转子的松紧度 进样阀安装不当重新安装 自动进样阀，其它问题 阻塞清洗或更换阻塞部件机械故障见随机维修手册控制器故障维修或更换控制器 出现问题可能原因解决方法 保留时间变 化柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱 等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱缓冲液容量不够用>25mmol/L的缓冲液 柱污染每天冲洗柱 柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相 柱快达到寿命采用保护柱 保留时间缩 短流速增加检查泵,重新设定流速 样品超载降低样品量 键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度增加柱恒温 保留时间延 长流速下降管路泄漏,换泵密封圈,排除泵内气泡 硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度降低柱恒温 出现肩峰或 分叉样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂 柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 进样器损坏更换进样器转子 鬼峰进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 样品中未知物处理样品 柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对 色谱)
高效液相色谱习题及答案53326
高效液相色谱法习题 一、思考题 1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3．在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4．液相色谱有几种类型? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？ 9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？ 12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？ 13．何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱？试述它们的基本原理 14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？ 16．以液相色谱进行制备有什么优点？ 二、选择题 1．液相色谱适宜的分析对象是（）。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2．HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为（）。 A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相粘度较大 D 柱温低 3．组分在固定相中的质量为MA(g)，在流动相中的质量为MB（g），而该组分在固定相中的浓度为CA（g·mL－1），在流动相中浓度为CB（g·mL－1），则此组分的分配系数是( )。 A mA/m B B mB/mA C CB/CA D CA/CB。 4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。 A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的？ A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6．在分配色谱法与化学键合相色谱法中，选择不同类别的溶剂（分子间作用力不同），以改善分离度，主要是（）。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是（）。 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。 A ODS柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。 A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样
HPLC基础知识
第一章 高效液相色谱仪的特点 混合物最有效的分离、分析方法。 俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素， 色谱法是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。 特点：高压、高效、高速、高灵敏 适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 与GC 互补性 三、液相色谱组成： （一）、输液系统 泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站（记录仪） （二）、附件 过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。 （三）、工作程序： 液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器 （四）、泵体组成部分： 电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴 （五）、检测器组成部分： 1、电器部分（变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴） 2、光学部分（氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板） （六）、HPLC的分类 1、吸附色谱Adsorption Chromatography 用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 2、分配色谱Partition Chromatography 用载带在固相基体上的固定液做固定相，以不同极溶剂作流动相。依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。 3、离子色谱Ion Chromatography 用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲液做流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography 用化学惰性的多孔性凝胶做固定相，按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。又分： a、Gel Filtration Chromatography（GFC）以水为流动相的体积排阻色谱 b、Gel Permeation Chromatography（GPC）以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱 5、亲和色谱
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理 高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。 高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。 二、高效液相色谱分析原理 （1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。 （2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分 离。 开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。 三、工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 四、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
安捷伦1260型高效液相色谱仪操作规程
一、开机 1、开机前准备：流动相使用前必须过0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水，不能使用超过3天的注射用水，以防止长菌或长藻类）；把流动相放入溶剂瓶中。A瓶：为水相B瓶：为有机相。 2、打开电脑，选Win 2000，进入Win 2000界面。 3、双击CAG Boodp server图标，放大CAG Boodp server小图标，出现窗口，5min 内打开液相各部件电源开关，等待1100广播信息后，表示通讯成功连接，关闭CAG Boodp serve窗口。 4、双击online图标，仪器自检，进入工作站。 该页面主要由以下几部分组成： ——最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen…等； ——命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等； ——中部为工作站各部件的工作流程示意图；依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告； ——中下部为动态监测信号； ——右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。 4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。 二、编辑参数及方法 1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“New method”，出现DEF-LC.M，从“Method”菜单中选择“Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击OK，进入下一画面。 2、方法信息： 在“Method Comments”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击OK，进入下一画面。 3、泵参数设定： 进入“Setup pump”画面，在“Flow” 处输入流量，如1ml/min；在“Solvent B”处输入有机相的比例如70.0，（A=100-B），也可在Insert 一行“Timetable”，编辑梯度；输入保留时间；在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。单击OK，进入下一画面。 4、DAD检测器参数设定： 进入“DAD signals”画面，输入样品波长及其带宽、参比波长及其带宽（参比波长带宽默认值为100nm）；选择Stoptime：as Pupm； 在“Spectrum”中输入采集光谱方式“store”：选All；如只进行正常检测，则可选None；范围Range：可选范围为190~950nm；步长Step可选2.0nm； 阀值：选择需要的灯； Peak width（Response time）即响应值应尽可能接近要测的窄峰峰宽，可选“2s”或4s； Slit-：狭窄缝，光谱分辨率高；宽时，噪音低。可选4nm
安捷伦1100及液相色谱仪的基本知识
安捷伦1100液相色谱仪各项性能指标 悬赏分：5|解决时间：2010-10-16 22:13|提问者：4329211 最佳答案 朋友，直接致电agilent的800-820-3278免费电话就可以得到Agilent的满意答复了 系列Agilent 1100泵系统 ●电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统，精度高、流速范围广柱流速范围：1-20ul/min;10-100ul/min（可选件） 0.001-2.5m1/min(EFC关闭状态) ●高压制备泵系统，单元或双元高压制备泵 流速范围:0.001-100m1/min ●分析型泵系统 流速范围： 单元泵：0.001-10m1/min 二元泵：0.001-5m1/min 四元泵：0.001-10m1/min 品种齐全的Agilent 1100系列进样系统 ●标准手动进样器（分析型或制备型） ●标准自动进样器 样品瓶容量：可达100个(2mlx100) 进样量：0.1-100ul(0.1-1800ul)可选件 ●微盘式自动进样器 样品瓶容量：2x96(孔板)，2x386(孔板)或100x2ml 进样量：0.1-100ul(标准件) 0.1-1500ul可选件 ●微量标准自动进样器/微盘式自动进样器 进样量：0.01-8ul（标准）;0.01-40ul（可选） ●恒温标准自动进样器/微盘式自动进样器 温度范围：4-40℃可设定步进1℃ ● 220型微孔板式自动进样器－组合化学样品管理系统 样品瓶容量：各种规格试管多达12个微孔板（96孔板,384孔板） 进样量：0.1-5ul;0.1-20ul Agilent 1100系列检测器 ●可变波长扫描紫外检测器（VWD) 波长范围：190?600nm ●多波长检测器(MWD)
高效液相色谱实验
化学与材料工程学院 环境监测分析实验报告 实验名称：高效液相色谱分析苯-甲苯混合物 专业班级：应化13 学号： 150313135 姓名：朱建南 指导教师：翟春 实验地点：敬行楼A210 实验日期： 2016年 11月 28日
高效液相色谱实验 一、实验目的 1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作； 2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法； 3．评价色谱柱柱效； 4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点； 5．学习未知样品的定量分析方法。 二、实验原理 不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。 色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等 1．色谱定性分析方法 a保留时间定性 b 峰高增量定性 2．色谱定量分析方法 a 归一化法,要求所有组分必须全部出峰。 b 标准曲线法（外标法）。简单、方便, 结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。 三、仪器与试剂 LC-1602A型高效液相色谱仪、甲醇(色谱纯) 、苯、甲苯、苯－甲苯 四、高效液相色谱仪操作步骤 1. 流动相的预处理 甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。 2. 准备苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样 3. 高效液相色谱仪操作 a 依次高压输液泵和检测器电源开关； b 打开色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，并开灯； c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。 d 关闭三通阀，设置最小压力(0.1)和最大压力(20)，并设置实验需要的流速 (0.5ml/min)，启动高压泵。 e用平头微量注射器洗涤进样口后，取试液30 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时
HPLC原理和操作详解
H P L C原理和操作详解 Revised as of 23 November 2020
高效液相色谱 我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid
Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为~ ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——紫外检测器可达，荧光和电化学检测器可达。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类
高效液相色谱基本常识
被分离组分在柱中的洗脱原理 Ⅱ 基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）. ⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 ⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 ⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 ⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。 ⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰， T>1.05为拖尾峰。 ⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。 ⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。 ⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。 ⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。 ⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 ⊕峰面积（peak area,A）――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h＝ 2.507σh=1.064Wh/2h 2.定性参数（保留值） ⊕死时间（dead time,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。
高效液相色谱知识收藏
高效液相色谱知识收藏 Agilent1100高压液相色谱仪差不多操作步骤Agilent1100液相差不多操作步骤 Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项： 高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法 液相色谱柱使用及保养 高压液相色谱HPLC培训教程(一)
高压液相色谱HPLC培训教程(七) 高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生 HPLC对流淌相的差不多要求 高效液相色谱 Waters 600E-2487 HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项 色谱扫盲班
Agilent1100高压液相色谱仪差不多操作步骤Agilent1100液相差不多操作步骤 (一)、开机： 1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。 2、打开 1100 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。 4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 5、把流淌相放入溶剂瓶中。 6、打开Purge阀。 7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。 8 、设Flow：5ml/min，单击OK。 9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换信道接着Purge，直到所有要用信道无气泡为止。
高效液相色谱以理论常识-测含量
被分离组分在柱中的洗脱原理 Ⅱ基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）. ⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 ⊕噪音（noise）――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 ⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 ⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。 ⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。 ⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。 ⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。 ⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。W h/2＝2.355σ。 ⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，σ大，峰形胖、柱效低。 ⊕峰面积（peak area,A）――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h＝2.507σh=1.064Wh/2h 2.定性参数（保留值） ⊕死时间（dead time,t0）--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 ⊕死体积（dead volume,V0）――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速） ⊕保留时间（retention time,tR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。⊕保留体积（retention volume,VR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F*tR . ⊕调整保留时间（adjusted retention time,tR’）--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0 ⊕调整保留体积（adjusted retention volume,VR’）--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’ 3.柱效参数 ⊕理论塔板数（theoretical plate number,N）用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： N=（tR/σ）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W：峰宽；σ：曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。 N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
高效液相色谱法基本知识
10 高效液相色谱法基本知识 （见第7章） u HPLC 法分类与定义 正相高效液相色谱法（NP-HPLC ）——固定相极性大于流动相极性。常用色谱柱有硅 胶柱、氰基柱、氨基柱；流动相为烷烃加适量极性溶剂，如正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇等。 主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物，如维生素 A 、维生素D 、维 生素 K 1 的含量测定。 反相高效液相色谱法（RP-HPLC ）——流动相极性大于固定相极性。常用色谱柱为十 八烷基硅烷键合硅胶（ODS ）柱；流动相主要成分为甲醇-水或乙腈-水（添加适量酸或缓冲 盐），用于大多数非极性、弱极性药物的分离分析。 v 系统适用性试验内容与要求 理论板数（n ）＝16（t R /W ） 2 或 n ＝5.54（t R /W h /2） 2 ，计算 n 时应指明测定物质。当 测定结果有异议时，应以峰宽（W ）计算结果为准。 分离度（R ） W W t t R R 2 1 ) ( 2 1 2 + - = 或 ) ( 70 . 1 ) ( 2 2 / , 2 2 / , 1 1 2 h h R R W W t t R + - = ，一般要求待测组分与相邻共 存物之间的 R 应大于 1.5。当测定结果有异议时，应以峰宽（W ）计算结果为准。 重复性：用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。取同一溶液连续进样 5 次，其峰面积的相对标准偏差（RSD ）应不大于 2.0％。 拖尾因子（T ） 1 05 . 0 2d W h = ，峰高法定量时 T 应在 0.95～1.05 之间。 w 测定方法 内标法：按规定，取被测物对照品和内标物质一定量，混合，配制成校正因子测定用的 对照溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰面积。根据对照溶液色谱图中对照品和内标物 质的峰面积或峰高，以及对照品和内标物的浓度，按下式计算校正因子（f ）： 对 对 内 内 C A C A f / / = 另取被测物适量，加一定量内标溶液，混合，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪， 记录色谱峰面积。根据供试品溶液色谱图中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度（ 样 C ）： ' ' / 内 内 样 样 C A A f C ′ = 外标法：按规定，精密称取对照品和供试品，分别配制成溶液，注入高效液相色谱仪， 记录各自色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度（ 样 C ）： 对 样 对 样 A A C C =
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被分离组分在柱中的洗脱原理 II基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 十色谱图(chromatogram)一样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号一时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile). 十基线(base line) 一流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 十噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 十漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 十色谱峰(peak)一组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种：前延峰 (leading peak)和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。 十拖尾因子(tailing factor,?) —T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)《中国药典》规定T应为0.95~1.05。 1X0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。 十峰底——基线上峰的起点至终点的距离。 十峰高(Peak height, h) --- 峰的最高点至峰底的距离。 十峰宽(peak width, W) --峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=40o 十半峰宽(peak width at half-height, Wh/2) --峰高一半处的峰宽。W h/2 = 2. 355a0 十标准偏差(standard deviation, o) --正态分布曲线x=± 1 时(拐点)的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，。大，峰形胖、柱效低。 十峰面积(peak area, A) --- 峰与峰底所包围的面积。A=X (jxh = 2. 507ah=1.064Wh/2h 2.定性参数(保留值)