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高效液相色谱法及其在药物分析中的应用

以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。用常压输送流动相的方法为经典液相色谱法，这种色谱法的柱效能低、分离周期长。高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography，简称HPLC）是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法。与经典的液相色谱法相比，高效液相色谱法具有下列主要优点：①应用了颗粒极细（一般为10µm以下）、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；②采用高压输液泵输送流动相，流速快，一般试样的分析需数分钟，复杂试样分析在数十分钟内即可完成；③广泛使用了高灵敏检测器，大大提高了灵敏度。目前，已经发展了多种不同的固定相，有多种不同的分离模式，使高效液相色谱法的应用范围不断扩大。下面介绍高效液相色谱法的有关知识，新的方法和技术以及在药物分析中的应用。

一、分类

高效液相色谱法按分离机理的不同可分为以下几类：

（一）吸附色谱法（adsorptionchromatography）

以吸附剂为固定相的色谱方法称为吸附色谱法。使用最多的吸附色谱固定相是硅胶，流动相一般使用一种或多种有机溶剂的混合溶剂。在吸附色谱中，不同的组分因和固定相吸附力的不同而被分离。组分的极性越大、固定相的吸附力越强，则保留时间越长。流动相的极性越大，洗脱力越强，则组分的保留时间越短。

（二）液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)

液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数（K)的不同而被分离。目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法（简称键合相色谱法）可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。

按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。

1.正相色谱法（normalphasechromatography)

固定相极性大于流动相极性的分配色谱法称为正相分配色谱法，简称为正相色谱法。氰基键合硅胶、氨基键合硅胶等极性的化学键合固定相是正相色谱常用的固定相，正相色谱的流动相一般为极性较小的有机溶剂。在正相色谱中，极性小的组分由于K值较小先流出，极性较大的组分后流出。正相色谱法用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质的分离。

2.反相色谱法（reversedphasechromatography）

流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法，简称为反相色谱法。反相色谱法使用非极性固定相，最常用的非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶，还有辛烷基硅烷键合硅胶等。流动相常用水与甲醇、乙腈或四氢呋喃的混合溶剂。在反相色谱中极大的组分因K值较小先流出色谱柱，极性较小的组分后流出。流动相中有机溶剂的比例增加，流动相极性减小，洗脱力增强。反相色谱法是目前应用最广的高效液相色谱法。

（三）离子交换色谱法(ionexchangechromatography)

离子对交换色谱法是以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲和力的不同而被分离。柱填料含有极性可离子化的基团，如羧酸、磺酸或季铵离子，在合适的PH值下，这些基团将解离，吸引相反电荷的物质。由于离子型物质能与柱填料反应，所以可被分离。样品中不同的组分因离子交换平衡常数的不同而分离。离子交换色谱的流动相一般为一定PH值的缓冲溶液，有时也加入少量的有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以增大组分在流动相中的溶解度。流动相的PH值影响离子交换剂的交换容量。对弱酸或弱碱性的被分离组分，流动相的PH值还会影响其电离状况，流动相的PH值必须使待分离组分处于离解

状态，才能被分离。

离子交换色谱法用于分离在测定条件下呈离解状态的组分，如具有酸性或碱性的化合物，反相离子对色谱法在药物分析中的应用非常广泛，例如生物碱、磺胺类药物、某些抗生素及维生素等的分析均可采用此方法。

（四）空间排斥色谱法（stericexclusionchromatography）

空间排斥色谱也称为凝胶色谱。其固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质，即凝胶。被分离组分因分子空间尺寸大小的不同而被分离。当组分被流动相携带进入色谱柱时，体积大的分子不能进入固定相表面的孔穴中，而随流动相直接通过色谱柱，保留时间最短。体积较小的分子可以进入孔穴内，在色谱柱中所走的途径较长，保留时间也较长。分子的尺寸越小，可进入的孔穴越多，所走的路径越长，保留时间也越长。因此，凝胶色谱中，在一定范围内，体积不同的分子保留时间不同，从而达到分离的目的。凝胶色谱法主要用来分离高分子化合物，如蛋白质、多糖等。由于分子量和分子体积有关，凝胶色谱还可以用来测定组分的分子量。

（五）亲和色谱法（lighperformanceaffinitychromatography）

亲和色谱法是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从生物样品中分离和分析一些特殊物质的色谱方法。生物分子之间的专一作用包括抗原与抗体，酶与抑制剂，激素和药物与细胞受体，维生素与结合蛋白，基因与核酸之间的特异亲和作用等。

亲和色谱的固定相是将配基连接于适宜的载体上而制成的，利用样品中各种物质与配基亲和力的不同而达到分离。当样品溶液通过色谱柱时，待分离物质X与配基L形成X-L复合物，而被结合在固定相上，其他物质由于与配基无亲和力而直接流出色谱柱，用适宜的流动相将结合的待分离物质洗脱，如采用一定浓度的醋酸或氨溶液为流动相，减小待分离物质与配基的亲和力，使复合物离解，从而将被纯化的物质洗脱下来。

HPAC可用于生物活性物质的分离、纯化和测定，还可以用来研究生物体内分子间的相互作用及其机理等。

（六）手性色谱法（chiralchromatography）

不少有机药物的结构中有不对称碳原子，又称手性碳原子，有手性碳原子的药物具有旋光性。立体构型不同的一对对映体，其药效、毒副作用往往不相同。例如抗高血压药物а-甲基多巴是S-（-）体；又如氯霉素（含有二个手性碳原子），只有D-（-）异构体有效．而L-（+）异构体完全无效。沙利度胺（反应停）的两个对映体对小鼠镇静作用的效价相近，但只有左旋异构体才有胚胎毒及致畸作用。因此，对映体的分离，在药物的制备和质量控制方面，都具有重要的意义。对映体在普通条件下的理化性质是相同的，因此分离对映体需要在手性条件下进行。分离对映体的色谱方法称为手性色谱法。手性色谱法分为间接法和直接法两种。间接法是将对映体与一定的手性衍生化试剂反应，使其由对映体转变为非对映体，再利用他们理化性质的差异，用一般的色谱条件进行分离。直接法不需作衍生化反应，直接利用手性色谱柱或手性流动相进行分离，应用较多，以下主要介绍直接法。

1.手性固定相（chiralstationaryPhase，CSP）

手性药物拆分前的对映体通常以镜象存在，即以外消旋体形式存在。用常规分析和制备方法不能将其拆分，需引入不对称（即手性）环境，使欲拆分的对映体（样品）、手性作用物（比如固定相）和手性源形成一个非对映异构分子的络合物。为了形成这样一种分子络合物，分子之间要有一种同时相互存在的作用力，以保持分子的空间定位。Dalgliesh认为至少要有三个作用力，其中一个要有立体选择性，可以是吸引的，也可以是排斥的。这就是“三点相互作用”理论。如果对映体中某一种对映体正好与此三个作用点配对，相互作用较强，保留时间就长。而另一种对映体因空间构型不同，不能完全配对，作用相对较弱，保留时间就短，从而可以得到分离。固定相的作用可以是氢键、偶极一偶极作用、π-π作用、静电作用、

疏水作用或空间作用等。

l常用的手性固定相有以下几种。

(1)Pirkle型手性固定相

Pickle型手性固定相是由美国学者Pirkle主持研制的，主要有π-碱性（斥电子基）手性固定相和π-酸性（吸电子基）手性固定相。在分离的过程中，化合物与固定相之间发生π-π电荷转移相互作用，此类固定相为电荷转移型手性固定相。如DNBPG-CSP是把（R）-N-3，5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸（dinitrobenzylphenylglycin）键合到氨丙基硅胶上

(2)蛋白质类手性因定相

蛋白质是由手性亚基团氨基酸组成的大分子物质，蛋白质类手性固定相是将蛋白质通过氨基酸键合到硅胶上而制成的。常用的蛋白质类手性固定相有牛血清蛋白（RSA）和人血a1-酸性糖蛋白（AGP）的手性固定相，商品有ChiralAGP，Resolvosil，EnantioPac等。

蛋白质类手性固定相应用范围较广，效果良好，但该类固定相的谱柱容量较小。常用洗脱系统是磷酸盐缓冲溶液（PH4～7），离子强度为0～500mmol，有机改性剂不得超过5%。用蛋白质类手性固定相拆分酸性和碱性倾倒物对映体时，流动相内可分别加少量离子对试剂，如N，N-二甲基辛胺，叔丁胺氢溴酸盐和辛酸，以获得理想的分离结果。

(3)多糖类手性固定相

多糖类手性固定相中应用最多的是环糊精。环糊精（cyclodextrin,CD)是一类环形寡聚糖，为手性高分子物质，。根据分子中葡萄糖单元的个数不同，环糊精可分为α、β、γ三类，他们分别由6、7、8个D-吡喃葡萄糖组成，将CD分别通过硅烷链连接在硅胶表面就构成环糊精手性固定相。环糊精分子成锥桶状，内腔的直径由组成环糊精的葡萄糖个数决定，如常用的β-环糊精由7个葡萄糖分子组成，内腔直径为0.8nm。用环糊精手性固定相进行分离时，首先要求被拆分的组分进人洞穴，形成包合物，保留时间以组分能否进人洞穴及其紧密的程度而定，环糊精环上还有多个手性中心，能选择性地与对映体作用，从而导致对映异构体的保留不同而被分离。如用β-环糊精手性固定相已经成功地分离了二茂铁等金属有机络合物、氨基酸以及生物碱等。除环糊精外，多糖类的手性固定相还可以用纤维素、直链淀粉作成，如纤维素三醋酸醋手性固定相、纤维素三苯甲酸醋手性固定相和纤维素氨基甲酸酯手性固定相等。

(4）冠醚（Grownether）类手性固定相

冠醚与环糊精类似，是本身具有手性的低聚糖，是含醚键的环状化合物，呈王冠状结构，外层是亲脂性的乙撑基，环的内层是富电子的杂原子，如氧、氮、硫等。通常使用的是18-冠-6的衍生物，健合在聚苯乙炜骨架或硅胶上，形成冠醚手性固定相。用冠醚手性固定相分离对映体时，不同对映异构体因与冠醚环腔形成的主客体络合物的稳定性不同而被分离。在冠醚上引人双萘基，双萘基可以形成“手性墙”，增加固定相的立体选择性。能质子化的氨基化合物，特别是氨基酸对映体在冠醚手性固定相上可以得到很好的分离。

2.手性流动相（chiralmobilephase，CMP）拆分法

手性流动相拆分法是将手性试剂添加到流动相中，利用手性试剂与对映异构体结合的稳定常数不同或结合物在固定相上分配的差异进行分离。近年来，手性流动相拆分法已广泛应用于药物对映体的拆分。此法的最大优势在于：可采用普通的非手性固定相，不需对样品进行衍生化，手性添加物本身可流出，也可更换，同时添加物的可变范围较宽，稳定性好，且价格便宜。

(1)配体交换型手性添加剂

配体交换型手性添加剂由手性配基和含二价金属离子的盐组成。手性配基多为具有光学活性的氨基酸及其衍生物，他们和二价金属离子螯合，分布于流动相中，遇到待分离的对映异构

体时，即形成配合物，再在流动相和固定相之间分配而实现分离。分离的机理一般认为是配基和金属离子形成的螯合物被吸附在固定相上，形成动态的手性固定相而发挥作用。也可以看成是手性配基、金属离子和对映异构体形成的配合物稳定常数不同而产生分离。采用5µm粒径的C18固定相，阿司帕坦作为CMPA，与硫酸铜络合，测定高血溶素患者尿中D-和L-2-哌啶酸的浓度。

(2)环糊精添加剂

环糊精在水中有一定的溶解度，用环糊精作为手性添加剂，加入流动相中，其分离机理与环糊精手性固定相相同，但保留行为正好相反。对映异构体与环糊精形成的包合物稳定性越强，随流动相出柱越快，保留时间越短。

(3)手性离于对添加剂

解离的有机化合物能与含互补电荷的试剂相互作用，生成电中性离子对。分离带电荷的对映异构体时，可以在流动相中添加手性的离子对试剂，对映异构体和离子对试剂形成电中性的离子对，离子对在固定相和流动相间分配系数不同而得到分离。常用的手性离子对试剂有（＋）10-樟脑磺酸、奎宁等。

二、高效液相色谱仪

高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、色谱柱系统、检测系统、数据记录处理系统等组成。仪器组成的方块图如图所示：

（一）输液泵

高效液相色谱的流动相采用高压泵输送，有不同类型的输液泵，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。目前使用较多的是柱塞式往复泵，柱塞式往复泵为恒流泵，可按设定的流速输送流动相，流量不受柱阻力的影响，可保持恒定，并容易清洗和更换。由于柱塞式往复泵是通过柱塞的往复运动来关液的，所以输液的脉动性较大。目前多采用双泵补偿的方法减小脉动性。双泵补偿是同时使用两个泵进行工作，两个泵可以按串联或并联方式连拉，交替送液，相互补偿，达到减小脉动的目的。

（二）进样器

进样器是将试样送入色谱柱的装置。一般要求进样装置的密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。有进样阀和自动进样装置两种。除使用自动进样装置外，用手工进样均使用六通进样阀。在工作状态下，仪器系统内处于高压的状态，借助于六通进样阀，实现了常压下不停流进样。六通进样阀可分为定子和转子两部分，共有6个口，故称为六通进样阀。转子通过扳手调节，可以分别处于“装样”和“进样”两个位置。图中a为进样阀处于“装样”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样”位时，进样阀的流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。样品环有10µl、20µl、50µl等不同容积，可以选配。样品环不仅可以用来贮液，也可用来测量样品溶液的体积。将样品环装满后，进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。

（三）色谱柱

色谱柱是色谱分离的核心。为了保证色谱柱的柱效高，使用寿命长，一般使用由专业化工厂生产的商品柱。色谱柱管多由不锈钢制成，内装一定的固定相。色谱往长一般10～30cm，内径2～5mm。

化学键合相是广泛使用的固定相，其中又以十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilylsilicagel，

ODS）的应用最为广泛，ODS为非极性化学健合相，此外还有辛烷基硅烷键合硅胶等，非极性化学健合相用于反相色谱法。中等极性的化学键合相有苯基化学键合相等，氰基化学键合相和氨基化学键合相是常用的极性化学键合相，极性的化学键合相一般用于正相色谱法。吸附色谱的固定相中使用最多的是硅胶。无论自己填装的色谱柱还是购买的商品柱，使用能指标包括在一定实验条件下的柱压、理论塔板高度和理论塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性等。

（四）检测器

样品经色谱柱分离后进入检侧器进行检测。按其适用范围检测器可分为通用型和专属型两大类，专属型检测器只能检测某些组分的某一性质，紫外检测器(UVD），荧光检测器（ED）属于这一类，它们只对有紫外吸收或荧光发射的组分有响应；通用型检测器检测的是一般物质均具有的性质，示差折光检测器（RID），蒸发光散射检测器（ELSD)等。液相色谱-质谱联用(LC-MS)则是用质谱作为高效液相色谱的检测器。

1.紫外检测器

(1)普通紫外检测器

紫外检测器是高效液相色谱中应用最广的一种检测器。用一定波长的单色光照射流通

池，流动相携带被分离的组分进入流通池时，流动相在测定波长处不吸收光或吸收很弱，测定组分在该波长处有很强的吸收，记录不同时间对光的吸收度，就得到一张色谱图。组分对光的吸收符合Iambert-beer定律，因此色谱峰的面积和组分的量成正比关系。紫外检测器

的特点是灵敏度高，线性范围宽，对温度和流动相的波动不敏感，可用于梯度洗脱。但紫外检测器只能检测具有紫外吸收的组分，像糖类、脂肪酸类等在测定范围内无紫外吸收的组分不能检侧。用普通紫外检侧器也不便测定流出组分的紫外吸收光谱，有的紫外检测器虽可测定紫外吸收光谱，但在组分到达检测器时需停流，再扫描。

(2)光二极管阵列检浏器(photodiodearraydetector，PDAD）

光二极管阵列检测器是20世纪80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以在瞬间完成对组分的紫外扫描。

由光源发射的光照射流通池，被组分选择性地吸收，透过光通过光栅分光，形成组分的紫外吸收光谱，照射在成矩阵排列的光二极管上，光二极管将光信号转换为电信号，输出的电信号与光的强度成正比，电信号经过累加、处理，就可以得到组分的紫外吸收光谱。因此，使用PDAD，可以在瞬间获得组分的紫外吸收光谱，而不需停流进行紫外扫描。光二极管的个数越多，图谱的分辨率越高，若有512个光二极管，在190～800nm范围内扫描，则平均每1.2nm对应一个光二极管。用PDAD按设定的时间间隔采集数据，可以得到一张三维的光谱-色谱图。吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量。应用三维图谱还可以对峰的纯度进行检查。若一个色谱峰包含有两个组分，则不同位置的紫外吸收光谱会有差异通过比较色谱峰不同位置紫外光谱图的一致性，可以进行色谱峰的纯度检查。

2．荧光检测器

荧光检测器是利用组分发出的荧光进行检测的方法。荧光检测器的灵敏度比紫外检测器高，检测限可以达到1×10-10g/ml，但组分必须有荧光。许多药物和生物活性物质具有天然荧光，能直接检测，如生物胺、维生素和甾体化合物抢救无效；通过荧光衍生化可以使本来没有荧光的化合物转变成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围，例如氨基酸。由于荧光检测器的高灵敏度和选择性，它是体内药物分析常用的检测器之一。

3．蒸发光散射检测器（evaporativelightscatteringdetector，ELSD）

蒸发光散射检测器是在90年代出现的一种新型的通用型检测器，主要适用于无紫外吸收，不能用紫外检测的组分，如糖类、脂肪酸、甘油三酯及甾体等。

ELSD的检测可分为三个步骤。

(1)雾化在雾化器中，洗脱液通过1个针孔与氮气（也可以用空气）混合，形成均匀的雾状液滴。

(2）流动相蒸发液滴通过加热的漂移管时，流动相被蒸发，样品组分形成气溶胶，进人检测室。

(3）检测在检测室内，用激光来照射气溶胶，产生散射，测定散射光强，记录散射光强度随时间的变化关系，就得到了色谱图。

气溶胶受固定光强的激光照射后，待测组分的质量(m）和散射光强度(I)有以下的关系：

I=KmblgI=blgm+lgK

式中K和b为与蒸发室温度和流动相性质有关的常数。上式说明散射光的对数响应值与组分的质量的对数成线性关系。

ELSD用来测定那些不能用紫外检侧器检侧的组分，对HM的检测器是很重要的补充。但ELSD对有紫外吸收的组分检测灵敏度相对较低．此外，它只适合流动相能完全挥发的色谱条件，若流动相含有难以挥发的缓冲剂时，就不能用ELSD进行检测。

4.液相色谱一质谱联用（LC-MS)

液相色谱-质谱联用技术（LC-

MS）是用质谱作为HPLC的检测器，它将HPLC的高分离效能和质谱的高灵敏度、高专属性、通用性及较强的结构解析能力相结合，成为药品质量控制、体内药物分析和药物代谢研究的最重要的手段。由于质谱的工作系统是处于真空状态的，若将液相色谱的流出液直接引人质谱仪，流出液挥发产生的大量气体，会使质谱仪无法正常工作。因此，LC-MS的关键是接口，目前应用较多的接口有以下几种。

（1）粒子束（PB）接口

使用粒子束接口时，来自HPLC的洗脱液经雾化器雾化，变成气溶胶微粒，雾化的工作气体是氦气。溶剂在脱溶剂室被蒸发，再进入动量分离器，在动量分离器内由于溶剂和测定组分的质量有很大差别，二者之间会出现动量差，动量较小的溶剂和喷射气体（氦气）被抽气泵抽走，测定组分则沿传输管进入质谱仪的离子源。使用粒子束接口时，可使用EI（电子轰击离子源）或CI（化学离子源），因而可以得到经典的质谱图，并可以使用图谱库检索，对未知样品的分析非常有用，但不适用于对热不稳定的化合物的分析。

(2）热喷雾接口（TSP)

热喷雾接口是在液态下将样品分子离子化的方法。流动相在经过喷雾探针时被加热，体积膨胀后以超声速喷出探针，形成雾滴。液滴在离开喷嘴时由于统计涨落分别带上多余的正电荷或负电荷，当它在运动中不断失去溶剂，液滴的半径足够小时，表面电荷形成很强的电场，导致组分离解。也可以采用热灯丝发射电子束轰击溶剂和测定组引发化学电离。TSP适用于含水比例较高、流速较高(1ml/min～

2ml/min）以及极性较大的测定组分的分析。

(3)大气压离子化（API）接口

大气压离子化接口是指离子化在常压下进行的接口，API是目前LS-MS中应用最广的接口。API有电喷雾(ESP)、离子喷雾(ISP)和大气压化学电离(APCI)三种操作模式。

（五）数据记录处理和计算机控制系统

现代HPLC的的特征是用微机控制仪器。HPLC仪器的中心计算机控制系统，即能做数据采集和分析工作，又能程序控制仪器的各个部件，还能在分析一个试样之后自动改变条件而进行下一个试样的分析，许多色谱仪的软件系统具有方法认证功能，使分析工作更加规范化。

三、在药物分析中的应用

高效液相色谱法分离效能高，应用范围广，灵敏度高，仪器已较成熟、普及，在新药的研究开发，药品检验，生物样品的分析中应用十分广泛。

（一）色谱系统适用性试验

由于色谱分离的效果受色谱柱的状况，流动相组成等因素的影响很大，为保证测定结果的准确，中国药典规定，在进行色谱分析前需检查色谱系统是否正常，是否符合要求，即需要作色谱系统适用性试验，色谱系统适用性试验的内容有：

1.色谱柱的理论板数

在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液记录色谱图，量出测定组分或内标物质峰的保留时间tR和半高峰宽（Wh/2），按下式计算色谱往的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)2

如果测得理论板数低于各品种项下的规定，应更换色谱柱或其他条件使理论板数达到要求。色谱柱的理论板数主要取决于半高峰宽Wh/2，在一定的条件下，wh/2越窄，理论板数越高，相邻峰的分离越好。

2分离度（R)

分离度用来表示相邻两峰分离的程度。分离度（R）的计算公式为：

2(tR2―tR1)

W1+W2

除另外有规定外，分离度应大于1.5。当分离度大于1.5时，相邻两峰达到了完全分离。3.重复性

取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，峰面积的相对标准偏差(RSD)应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。

4.拖尾因子（T)

拖尾因子用来表示峰的对称性。为保证测定结果的准确，特别当采用峰高法定量时，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定，拖尾因子计算公式为

W0.05h

2d1

除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。

（二）在药物分析中的应用

1.在鉴别中的应用

在HPLC法中，保留时间与组分的结构和性质有关，是定性的参数，可用于药物的鉴别。如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致。头抱拉定、头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液、曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别。

2.在杂质检查中的应用

HPLC分离效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。主要用于药物中有关物质的检查。“有关物质”是指药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。若杂质是已知的，又有杂质的对照品，可用杂质对照品做对照进行检查。若杂质是未知的，可以采用主

成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查，下面举两个例子。

示例一：黄体酮中有关物质的检查

黄体酮在合成过程中可产生20β-羟基-黄体酮、20a

–羟基-黄体酮等有关物质，中国药典采用高效液相色谱法进行检查。色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，流动相为甲醇-水（65:35），检测波长：254nm，检查方法为精密称取供试品适量，加甲醇溶解并定量稀释制成lmg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，加甲醇稀释成0.02mg/ml的溶液，作为对照溶液，分别取供试品溶液和对照溶液各10ul进样，记录色谱图，规定供试品溶液杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于对照溶液主峰面积的3/4，限量为1.5%。供试品溶液和对照溶液的色谱图如下

高效液相色谱法专属性强、灵敏度高，在药物含量测定中的应用十分广泛。如中国药典中合成药及其制剂，用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。中药材及其制剂组成复杂，基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法

示例二：复方对乙酰氨基酚片的含量测定

复方对乙酰氨基酚片含有对乙酰氨基酚、阿司匹林和咖啡因三种药物，我国国家药品质量标准采用容量法分别测定三种药物的含量。

USP（24）采用高效液相色谱法同时分离并测定三个组分的含量，方法简便、准确。

色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶柱，流动相：水-甲醇-冰醋酸（69:28:3）,UV

275nm检测，柱温：45℃，流速：约2.0ml/min。

内标溶液的制备：制备苯甲酸的甲醇溶液，每lml约含苯甲酸6mg。

标准贮备液的制备：分别精密称取对乙酰氨基酚对照品、阿司匹林对照品和咖啡因对照品适量，加混合溶剂甲醇-冰醋酸(95:5)溶解并稀释至已知浓度，其中对乙酰氨基酚的浓度为0.25mg/ml，阿司匹林的浓度为0.25jmg/ml

(j为阿司匹林和对乙酰氨基酚标示量的比值），咖啡因的浓度为0.25j'mg/ml。

(j'为咖啡因和对乙酰氨基酚标示量的比值)。

标准溶液的制备：精密量取标准贮备液20ml和内标溶液3m1，置50ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀。其中对乙酰氨基酚的浓度为0.1mg/ml，阿司匹林的浓度为0.1jmg/ml，咖啡因的浓度为0.1

j'mg/ml。

供试品溶液：取不少于20片复方对乙酰氨基酚片，精密称定，充分研细，精密称取适量（约相当于250mg对乙酰氨基酚），置100ml量瓶中，加混合溶剂75m1，振摇30分钟，加混合溶剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，内标溶液3m1，置

50ml量瓶中，加混合溶剂稀释至刻度。

测定方法：分别取对照品溶液和供试品溶液各l0µl注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积值，按下式计算供试品中各测定组分的含量。

含量（mg）=2500C（Ru/Rs）

式中C为标准溶液中测定组分的浓度（mg/ml），Ru和Rs分别为供试品溶液和标准溶液中测定组分与内标峰面积的比值，2500为稀释倍数。

4.手性分离

示例三：蛋氨酸对映异构体的分离

冠醚类手性固定相适用于氨基酸对映体的分离。使用以下条件分离蛋氨酸，两个对映体可以得到完全分离。色谱柱为CROWNPAK

CR(+

)手性柱；流动相为pH1.5的HCIO4溶液-甲醇(85:15）；流速:0.6m1/min；柱温:24℃；紫外200m检测。蛋氨酸对映体的色谱图见图。

1.D-蛋氨酸

2.L-蛋氨酸．

使用冠醚类手性固定，用不同PH值的HCl04水溶液作流动相，数十种氨基酸的对映体均可得到完全分离。

5.在药浓检侧中的应用

示例四：对乙酰氨基酚急性中毒的血药浓度检测分析

对乙酰氨基酚是临床上使用极其广泛的解热镇痛药。由于患者状态的多样性以及对酰

氨基酚中毒的早期症状与胃溃疡症状极其相似且肝功正常，故常常发生漏诊，等到发生肝损伤已经错过了治疗最佳时机。因此，国外已将对乙酰氨其酚血浓度作为急诊中毒病人常规检测。

色谱条件：采用Nova-PakC18柱（4µm,150mm×3.9mm），柱温25℃；流动相为甲醇-水（30:30），流速为0.8ml/min；二极管阵列检测器，检测波长254nm。

血浆样品制备

取静脉血3ml～4ml，置含肝素抗凝剂的离心管中，离心分离5min（3000r/min），上清液为待测血浆。取上述血浆1ml，加饱和硫酸锌溶液1ml，沉淀蛋白后，加入乙醚5ml，涡漩混合1min，离心20min（3000r/min）。精密吸取乙醚液3.0ml于50℃氮气流吹干，冷至室温，以蒸馏水500µl溶解残渣，取10µl进样。

对照品溶液制备

配制对乙酰氨基酚甲醇溶液（10mg/ml），并用甲醇逐级稀释成浓度为0.01mg/ml～5mg/ml 的对照品溶液，4℃冰箱存放备用。

血浆中对乙酰氨基酚标准曲线制备

取肝素抗凝的血浆1ml，分别加入不同浓度的对乙酰氨基酚工作液100µl，使血浆中药物浓度为0.9µg/ml～454.5µg/ml，再按“血浆样品制备”项下方法操作，记录色谱图，以溶液C对峰面积A作线性回归，得回归方程：A=1.64×104+1.68×107C，R=0.9995，线性范围为0.9µg/ml～454.5µg/ml，最低检测浓度为0.9µg/ml(以信噪比≥3计)。

用HPLC测定可疑中毒病人血中对乙酰氨基酚浓度具有准确、快速的优点，可有效地帮助临床医生确诊，快速有效地救治患者，对提高医疗质量有重要意义。液、组织中药物的浓度，在药物代谢动力学研究、临床血药浓度检测中应用非常广泛。

高效液相色谱仪操作方法

Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （ 1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（4 ）页输入后按【Exit 】；在第（ 6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （ 1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位

高效液相色谱的发展及其应用

高效液相色谱的发展及其应用摘要：了解高效液相色谱[1]的发展历史，知道高效液相色谱的组成结构、操作原理以及方法等等。掌握它的分类方法，通过比较得出高效液相色谱分析方法的优点与缺点。明确高效液相色谱的应用，最终分析结果。关键词：高效液相色谱；发展历史；应用高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 1、高效液相色谱的发展历史 1.1高效液相色谱的历史高效液相色谱作为色谱分析法的一个分支，是在二十世纪60年代末期，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上，发展起来的新型分离分析技术。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了高效液相色谱。 1.2高效液相色谱与其它色谱的比较[2] 1.2.1与经典液相色谱的比较经典液相色谱法使用粗粒多孔固定相，装填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，柱效低，分析时间冗长。高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。 1.2.2与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法有许多相似之处。气相色谱法具有选择性高、分离效率高、灵敏度高，分析速度快的特点，但它仅适于分析蒸气压低、沸点低的样品，而不适用于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物以及生物活性物质，因而使其应用受到限制。在全部有机化合物中仅有20%的样品适用于气相色谱分析。高效液相色谱法却恰可弥补气相色谱法的不足之处，可对80%的有机化合物进行分离和分析。 2、高效液相色谱 2.1高效液相色谱的特点 2.1.1高效液相色谱的优点 1.分辨率高于其它色谱法，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果； 2.速度快，十几分钟到几十分钟可完成； 3.重复性高、样品不被破坏、易回收； 4.高效相色谱柱可反复使用； 5.自动化操作，分析精确度高；

体内药物分析考试

浙江大学继续教育学院《体内药物分析》习题集一、名词解释 1.反相HPLC 答：即流动相极性大于固定相极性的HPLC。 2.ODS 答：即十八烷基硅烷键合硅胶，为常用反相HPLC的固定相。 3.荧光光谱答：以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标所作的图。 4.激发光谱答：以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标所作的图。 5.RSD 答：相对标准偏差，即精密度的一种表示方法。 6.一相代谢答：指药物在体内发生的氧化反应、还原反应、水解反应。 7.二相代谢答：指药物在体内的结合反应，包括：葡萄糖醛酸结合、硫酸酯化、甲基化、乙酰基化、氨基酸缀合、谷胱甘肽缀合等。 8.检测限答：表示药物的最低可测度，不必定量，通常以S/N=2~3倍时被测药物的绝对量表示。 9.定量限答：表示药物可定量测定的最低量，须符合一定精密度和准确度要求，常以标准曲线最低浓度点来确定，或以 S/N=5～10确定。 10.血清答：全血经离心后的上清液。 11.血浆答：全血加抗凝剂（肝素等），经离心后的上清液。

12.酶免疫分析答：酶免疫分析是在放射免疫分析基础上发展起来的一种免疫分析方法，以酶代替同位素来标记药物，酶与底物、辅酶等反应后引起吸收光谱变化而被检测。 13.手性药物答：分子结构中含有不对称碳原子（即手性中心）的药物称为手性药物。 14.TDM 答：治疗药物监测，为英文“therapeutic drug monitoring”的缩写。 15.冷冻答：指－20℃及以下温度。 16.人工抗原答：全称为人工完全抗原，将药物等小分子半抗原与蛋白质、多肽等大分子物质经人工合成而得，具有免疫原性。 17.生物转化答：主要指体内代谢反应。 18.提取回收率答：指药物加入到生物样本中经前处理后测得的量与理论加入量的比值。 19.CYP1A2 答：细胞色素P450 1族A亚族第2个酶基因。 20.毛细管电泳答：即高效毛细管电泳(HPCE),是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据各组分之间的迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。二、填空 1.气相色谱法中常用的检测器有氢焰离子化检测器、氮磷检测器、电子捕获检测器、MS 等。 2.分析方法认证的主要指标线性范围、准确度、精密度、专属性、灵敏度、稳定性等。 3.在毛细管电泳中，驱动荷电物质前进的两个重要作用力是电泳流和电渗流。

37高效液相色谱法标准操作规程

高效液相色谱法标准操作规程目的：建立高效液相色谱法标准操作规程。适用范围：高效液相色谱法。责任：质检员实施本操作规程，检验室主任负责监督本规程正确执行。程序：高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1.对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法（附录ⅣA）项下对溶剂的要求。正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和 1

2 调整。应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 (1) 色谱柱的理论板数（n ）在选定的条件下；注入供试品对仪器或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R （以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54(t R /（W h/2）计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改普通色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。 (2)分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定时峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R ）的计算公式为： ()21122w w t t R R R +-= 式中 2R t 为相邻两峰中后一峰的保留时间； 1R t 为相邻两峰中前一峰的保留时间； W 1及W 2为此相邻两峰的保留时间；除另有规定外，分离度应大于1.5。 (3)重复性取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。 (4)拖尾因子为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子拖尾因子公式为： 1 05.02d W T h = 式中W 0.05h 为0.05峰高处的峰宽； d 1为峰极大至峰前沿之前的距离。除另有规定外，T 应在0.95～1.05之间。 3.测定法

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言：高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

体内药物分析题库

题目 A B C D 1 以下关于生物药剂学的描述，正确的是剂型因素是抱片剂、胶囊剂、丸剂和溶液剂等药物的不同剂型药物产品所产生的疗效主要与药物本身的化学结构有关药物效应包括药物的疗效、副作用和毒性改善难容性药物的溶出速率主要是药剂学的研究内容 2 生物药剂学的描述，错误的是生物药剂学与药理学和生物化学有密切关系，但研究重点不同药物动力学为生物药剂学提供了理论基础和研究手段由于生物体液中药物浓度通常为微量或痕量，需要选择灵敏度高，专属性强、重现性好的分析手段和方法从药物生物利用度的高低就可以判断药物制剂在体内是否有效 3 生物膜结构的性质描述错误的是流动性不对称性饱和性半透性 4 K+、单糖、氨基酸等生命必须物质通过生物膜的转运方式是被动扩散膜孔转运主动转运促进扩散 5 红霉素的生物有效性可因下述哪些因素而明显增加缓释片肠溶衣薄膜包衣片使用红霉素硬脂胺盐 6 不属于药物外排转运器 P—糖蛋白多药耐药相关蛋白乳腺癌耐药蛋白有机离子转运器 7 不是主动转运的特点逆浓度梯度转运无结构特异性和部位特异性消耗能量需要载体参与 8 胞饮作用的特点有部位特异性需要载体不需要消耗机体能量逆浓度梯度转运 9 以下哪些药物不是 P-gp的底物环孢素A 甲胺嘌呤地高辛诺氟沙星 10 药物的主要吸收部位是胃小肠大肠直肠 11 影响胃空速率的生理因素不正确的是胃内容物的粘度和渗透压精神因素食物的组成药物的理化性质 12 在溶出为限速过程吸收中，溶解了的药物立即被吸收，即为（）状态漏槽动态平衡饱和漏槽和饱和

13 为避免药物的首过效应常不采用的给药途径舌下直肠经皮口服 14 淋巴系统对（）的吸收起着重要作用肠溶性药物解离型药物水溶性药物小分子药物 15 正确的是不同的厂家生产的同一剂型或者同一厂家生产的不同批号的产品之间，不可能产生不同的治疗效果对难溶性药物进行微粉化或制成固体分散物，可以增加其溶解度或体内吸收药物的晶型对药物的溶解度有影响，但是对生物利用度没有影响只要是同一药物，给药途径和剂型不同时，其产生的血药浓度一定相同 16 被动扩散吸收具有以下特征需要存在浓度差存在竞争性抑制现象需要载体需要消耗能量 17 主动转运吸收具有以下特征需要存在浓度差脂溶性大的药物吸收快不需要载体存在饱和现象 18 胆汁中的胆盐一般能增加难溶性药物的吸收，因为其具有表面活性作用重吸收作用胃空作用首过效应 19 直接关系到药物的脂溶性，影响药物穿透生物膜的药物的理化性质是 pKa pH 油/水分布系数晶型 20 以下不属于药物通过细胞膜被吸收的机理的是被动扩散微绒毛吸收载体转运离子对转运 21 不属于细胞膜主要组成成分的是脂肪多糖氨基酸蛋白质 22 通常胃液的pH值为1-2 1-3.5 4-5.7 7.6-8.2 23 以下说法不正确的是药物的生物活性在很大程度上受药物的理化性质和给药剂型的影响同一药物相同的给药途径而剂型不同，有时会产生截然不同的血药浓度生物药剂学实验测得的指标是判断某药在临床上有效或无效的最终指标，是唯一的指标生物药剂学的研究必须要以药理实验为基础，其研究范畴不能代替其它医药学科

高效液相色谱法的标准操作规程

高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

第十二章色谱分析法基础

第十二章色谱分析法基础教师：李国清一.教学目的： 1. 熟练掌握色谱分离方法的原理； 2. 掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表的各种技术参数的准确含义； 3. 能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素； 4. 学会各种定性和定量的分析方法。二.教学重难点： 1. 塔板理论，包括理论塔板数（n）、有效塔板数（n eff）和塔板高度（H）及有效塔板高度（H eff）的计算。 2. 速率理论方程 3. 分离度和基本分离方程三．教具：多媒体计算机、板书。四．教学方法：讲授、演示、提问、讨论。五．教学过程 §12-1、色谱法的特点、分类和作用一.概述色谱法是混合物最有效的分离、分析方法。

俄国植物学家茨维特在1906年使用右图的装置分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响：（1）一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动。各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。色谱法是一种分离技术：试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，可实现混合物中各组分的分离与检测。二．色谱法分类

高效液相色谱仪操作步骤

高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

高效液相色谱在生物制药中的应用

高效液相色谱在生物制药中的应用高效液相色谱法是近35年发展起来的一项高效、快速的分离分析技术，是现代分离测试的重要手段[1]。高效液相色谱法已经被广泛用在各种领域，它是以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域发展最快、应用最广的现代分析技术之一。于此同时，高效液相色谱法成为环境污染物检测技术及化工产品质量检验中的标准方法。鉴于其简便、快速、灵敏、准确的特点，目前，在医药、卫生、食品、环保等各个领域已得到广泛应用。随着色谱技术的不断发展，在世界许多科学领域中，色谱法已成为世界许多科学领域中普及的一种分离分析手段，色谱仪也呈多样化、高精化、自动化、联用技术化等方向发展。高效液相色谱仪具有柱效高、分析速度快、流动相和被测组分的体积流量小等特点，广泛应用于临床工作[2]。 1.高效液相色谱的介绍高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱法有以下五个特点：①高压：流动相为液体，流经色谱柱受到的阻力比较大，为了能够快速的通过柱子，必须对流动相加很高的高压。②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、热稳定性差、高沸点、大分子化合物的分离分析，显示出优势。⑤分析速度快、载液流速快：分析所需时间一般小于1小时，和传统经典液体色谱法相比速度快得多。高效液相色谱有5种类型： 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography）

体内药物分析终极复习资料

1.体内药物分析定义。P1 研究药物及其代谢物在生物体内数量和质量变化规律的方法学科,获得药物在体内吸收、分布、代谢排泄等各种动力参数，药物与大分子的相互作用，代谢产物、代谢途径等信息，对药物评价，为临床合理用药、研发新药等提供科学依据。 2.影响血药浓度的因素（理解）。P3-5 （1）机体因素：包括生理、病理、遗传因素（2）药物因素：包括剂型因素、药物相互作用（3）（3）其他因素：大气污染、食品、烟、酒、茶等药物进入体内后，血液循环为药物体内转运的枢纽。大多数药物只有达到作用部位和受体部位，并达到一定的浓度后，才产生一定的药理作用。多数药物的血药浓度与药理效应呈平行关系，部分药物的血药浓度与药效无明显相关关系。 3.体内药物分析的生物样本及分析对象。P8 生物样本：凡是体液所到之处，如血液、尿液、唾液、毛发、各种器官、组织、呼出气体等都是取样对象，还包括细胞悬液，微粒体孵育液、器官灌流液等体外试验中的各种生物介质。分析对象：母体药物、代谢产物、必要的内源性物质或与之相关的其他药物。 4.体内药物分析的特点（1）干扰杂质多（2）被测浓度低（3）供试样品量少（4）待测物的易变性（5）要求较快提供结果（6）要有一定的仪器设备（7）工作量大 5.生物样品选择的基本原则。常用的生物样品及其应用特点。P19 选择原则：（1）必须能反映浓度与药效的关系（2）易于获得（3）便于处理（4）根据不同目的要求选取常用生物样品及应用特点：血液优点：较好体现药物浓度与治疗的关系缺点：（1）损伤性取样，取样量有限制（2）需要专业人员操作尿液优点：（1）非损伤性取样（2）药物浓度高（3）收集方便缺点：（1）浓度变化大，与血药浓度相关性差（2）：不易采集，保存（3）：肾功能不全、婴儿不宜用此法唾液优点：（1）非损伤性取样（2）含蛋白浓度低，易处理（3）C S/C P较恒定时，可代替血样进行TDM及药物动力学研究缺点：（1）适用药少（2）取样量变化大

高效液相色谱法操作规程

目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程，保证正确操作。范围：本标准适用于高效液相色谱法的操作。责任者：QC主任，设备使用人员。规程：依据：《中华人民共和国药典》2000年版二部。 1 ?定义及概述： 1.1高效液相色谱法是一种现代液体色谱法,其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱留或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 1.2高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外一可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2. 高效液相色谱仪的使用要求：

2.1按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2,仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。 3. 操作前的准备： 3.1流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。对规定PH值的流动相，应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45a m。适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足量的流动相及时待用。 3.2供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量测定时, 对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45a m适宜的滤膜滤过。必要时，在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。 3.3检查上次使用记录和仪器状态:检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。 4操作： 4.1泵的操作；用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml,设置高流速（9ml/min）或用冲洗键PURGE进行充泵排气，观察出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP冲洗，关闭排放阀。 4.1.3将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏。初始平衡时间一般约需30分钟，如为梯度洗脱，应在程序器上设置梯度状态，用初始化比例的流动相对色谱柱进行平衡。 4.2紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作。 4.2.1开启检测器电源开关，选择光源（氘灯或钨灯），选定检测波长，

高效液相色谱的应用与发展前景

高效液相色谱的应用呵发展前景液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快. 分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC) HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪结构。高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。对于高效液相色谱的发展前景应该是非常乐观的，现在的社会的发展节奏很快，各个领域对于分析检验的需求很多，而分析检验中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。所以她的发展情景很乐观。理由有几点 1，随着科技的发展，技术的日臻完善，较之以前色谱分析的方法有了很大程度的提高，很多科学家在对于一些分析上的难点有了新的突破，这样一个不断完善的技术在以后的社会发展中一定会扮演着一个重要的角色。 2，最近,一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相色谱分析法上,使得高效液相色谱的应用更广泛,并充分利用高效快速.选择性好.灵敏度高等优点,建立更加系统的成分分析方法.通过与质谱联用.梯度洗脱.柱切换技术.配合先进的检测技术,以及与分子生物学.现代分子药理学相结合,必

第十二章色谱分析法

第十二章色谱分析法 1、简要说明气相色谱法的分离原理答：气相色谱法的分离原理是利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数。当两相作相对移动时，混合物中各组分在两相中反复多次分配，原来微波的分配差异产生了很明显的分离效果，从而依先后顺序流出色谱柱。 2、气相色谱仪有哪些主要部件？各有什么作用？答：气相色谱仪的主要部件有：高压气瓶、气化室、恒温箱、色谱柱、检测器。高压气瓶：储存载气；气化室：将液体或固体试样瞬间气化，以保证色谱峰有较小的宽度；恒温箱：严格控制色谱柱的温度；色谱柱：分离试样；检测器：将组分及其浓度变化以不同方式转换成易于测量的电信号。或答：气路系统：是一个载气连续运行的密闭管路系统，通过该系统，可获得纯净、流速稳定的载气。进样系统：包括进样器和气化室。其作用是让液体试样在进入色谱柱前瞬间气，快速而定量地加到色谱柱上端。分离系统：色谱柱是色谱仪的分离系统，试样各组分的分离在色谱柱中进行。温控系统：主要指对色谱柱、气化室、检测器三处的温度控制。检测系统：是把载气里被分离的各组分的浓度或质量转换成电信号的装置。 3、试述热导池检测器及氢火焰电离检测器的工作原理。答：热电池检测器是基于被分离组分与载气的导热系数不同进行检测的。当通过热导池他体的气体组成及浓度发生变化时，引起热敏元件温度的改变，由此产生的电阻值变化通过惠斯登电桥检测，其检测信号大小和组分浓度成正比。氢火焰电离检测器是根据含碳有机物在氢火焰中发生电离的原理检测的。 4、根据速率理论方程式，讨论气相色谱操作条件的选择。答：H = A + B/u + Cu 操作条件选择： ①使用适当细粒度和颗粒均匀的填充物，并尽量填充均匀，紧密，减小涡流扩散； ②载气流速u，当u较小时，分析扩散项B/u成为影响H的主要因素，此时应采用相对分子质量较大的载气（N2、Ar）以使组分在气相中有较小的扩散系数，减小组分在气相中停留的时间；当u较大时，传质阻力项Cu成为影响H的主要因素，此时宜用相对分子质量低的载气（H2、He）使组分在气相中有较大的扩散系数，减小气相传质阻力。可由H-u曲线求得U opt. ③适当降低固定液的液膜厚度，增大组分在液相中的扩散系数。 5、试述速率理论方程式中A、B/u、Cu三项的物理意义。答：A：涡流扩散项，在填充色谱中，当组分随载气向柱出口迁移时，碰到的填充物颗粒阻碍会不断改变流动方向，使组分在气相中形成紊乱的类似“涡流”的流动，引起色谱峰变宽。 B/u：分子扩散项，是由于色谱柱内沿轴向存在浓度梯度，使组分分子随霸气迁移时自发地产生由高浓度向低浓度的扩散，从而使色谱峰变宽。

Water 2695 高效液相色谱仪操作规程

Water 2695 高效液相色谱仪操作规程 1目的用于规范检验人员正确操作使用Waters 2695 高效液相色谱仪。 2 适用范围适用于使用Waters 2695高效液相色谱仪检测分析的操作管理。 3 职责使用Waters 2695高效液相色谱仪进行检验的检验员应对本规程负责，相关项目经理负责监督该操作规程的正确执行。 4仪器组成及原理 4.1仪器组成本仪器由Waters 2695 高效液相色谱仪、检测器(2996型二极管阵列检测器、2487紫外检测器、2489紫外检测器、474型荧光检测器)、Empower色谱作站组成。2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机，可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面等组成。 4.2高效液相色谱法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，经色谱柱进行分离，检测器检测分离后的不同组分，数据处理装置记录色谱图或进行数据处理。 5.仪器的操作 5.1仪器的准备 5.1.1 检查流动相（使用前应首先脱气）、在线清洗溶液（10%甲醇-水溶液seal wash）、进样针清洗溶液（90%甲醇-水溶液injector wash）是否足够。 5.1.2 检查色谱柱的使用是否正确（方向是泵出来进检测器的方向，正常的话是色谱柱上所标示的箭头向上；一般情况下不能将色谱柱反过来用，除非柱子确实无法使用可考虑反方向使用）、连接是否有误，有无漏液，废液瓶的容量是否足够。 5.2开机、自检与仪器预备 5.2.1依次开启不间断稳压电源、开启2695 分离单元电源和计算机电源；仪器开始自检（约5～6min），待仪器操作面板上出现“Idle”字样表示自检成功，仪器进入待命状态。 5.2.2按动仪器面板右下方“Menu/Status”键进入操作状态，按动“Direct Function” 功能键，若仪器是首次使用或溶剂的管路充满空气时，先选择Dry Prime，按动OK，对管路进行排空；此时开启仪器下方purge阀，用专用注射器手工抽出管路内部的空气。（此操作一般情况下不会使用） 5.2.3若非5.2.2 状态时，直接以▼键切换到wet Prime，按动OK，对事先设置好流动相溶剂比例的管路进行相应的流动相灌注。 5.2.4 按动“Direct Function” 功能键，以▼键将仪器切换到purge injector状态，按动OK，对针头进行purge。（此操作是为了避免进样针中有气泡导致进样不平行） 5.2.5 在面板上设置流动相流速（flow），各通道溶剂流动比例以及柱温（col Htr）等参数，然后按动Enter。

高效液相色谱法在生命科学中的应用

高效液相色谱法在生命科学中的应用高效液相色谱在生命科学中的应用范围越来越广，高效液相色谱由于具有高选择性、高灵敏度，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，已成为医药研究的有力工具。如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。而目前高效液相色谱的蒸发现了它在生命科学中的重要地位。光散射检测器的应用更体现了它在生命科学中的重要地位。1天然药物分析天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行分离鉴定，再测定有效成分的含量；通过指纹图谱建立识别模式，可以判定药材的质量高低。 2 天然药物及复方成药分析复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑血管疾病、神经衰弱、

慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％以上的速度增长。HPLC分析必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。 3 抗生素分析抗生素是由微生物或其他方法产生的化学物质，在高度稀释的情况下仍具有抑制或杀灭其他微生物的性能。抗生素的分离、分析和定量测定是药物分析中较困难的领域。采用较多的方法是微生物法、分光光度法和化学方法，但所需时间较长、专一性较差。 HPLC分析技术近年来在抗生素的质量控制中已广泛应用。对结构、组分等较清楚的药物，HPLC分析将逐步取代传统的生物测定。目前，各国药典中应用HPLC技术对抗生素进行质量控制的项目包括鉴别、组分分析、含量测定和相关物质测定等。 4 在鉴别中的应用在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别.