细胞培养 中和试验TCID50原理 方法
实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养
一、实验目的
了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类
BHK-21：仓鼠肾传代细胞
PK-15：猪肾传代细胞
IBRS-2：猪肾传代细胞
Hela：人的子宫瘤细胞
Vero：非洲绿猴肾细胞
Marc-145：来源于Vero细胞
TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞
Sf9：昆虫细胞
三、材料
1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头
2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞
3、0.25%胰酶
4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV）
四、传代细胞培养的条件要求
1）细胞密度：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
五、常用细胞分散剂与作用原理
1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，
导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽
酶的混合物。
六、营养液
1、人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清
1）血清的种类
胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理
无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。
3）血清的作用
A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
E、给培养液提供良好的缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。
4）应用血清存在的问题
A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。
C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七、传代细胞系培养
1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
3、培养方法
1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养
1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。
2、加入适量的病毒悬液
3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。
5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。
实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料
1、9-11日龄鸡胚
2、照蛋灯与蛋座
3、碘酊棉球与酒精棉球
4、大剪子、眼科剪、小镊子
5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、
6、胰酶、生长液、维持液
三、细胞培养的条件要求
1）细胞密度
原代细胞：4-6×105个/ml
传代细胞：2-3×105个/ml
2）pH范围最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
四、操作步骤
1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚
颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静
置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。
6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀
后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长
液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于
细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
○表示可计数
●表示不计数
五、结果的观察
于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。
实验四病毒感染力的滴定（TCID50的测定）
一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID
50
的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数致死量LD
50
(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID
50
半数细胞培养物感染量TCID
（50% tissue culture infective dose)：用细胞
50
来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，
每孔接种100μl。
3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液）
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
五、TCID50的计算方法
1、Reed-Muench两氏法
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数lgTCID
50
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
=10-3.8/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法
=L-d(s-0.5)
lgTCID
50
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
=-1-1×(3.375-0.5)
lgTCID
50
=-3.875
=10-3.875/0.1ml
TCID
50
含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。
实验五血清中和试验
一、实验目的
了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。
二、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。
三、用途
1、疾病诊断
2、病毒分离株的鉴定
3、不同病毒株的抗原关系研究
4、疫苗免疫原性的评价
5、免疫血清的质量评价
6、测定实验动物血清中是否存在抗体
四、分类
(一) 蚀斑（痘斑）减数试验
将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(二) 交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V ；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。
（三）终点法中和试验
1、固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID
50、EID
50
或LD
50
）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏
感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。
以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血
清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD
50
）。
2、固定血清——稀释病毒法
在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照
组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID
50、EID
50
或LD
50
，然后计算中
和指数。
五、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
6、待检血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清
六、操作步骤
1、固定病毒—稀释血清法
1）测定病毒液的TCID
50
2）将测好TCID
50的病毒液稀释成200个TCID
50
的病毒悬液。
3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50μl生长液，再加50μl待检血清，混匀后，吸50μl至下一孔，如此下去。一直到1∶256），每个稀释度作4孔。
4）在上述各孔内加入50μl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃ 5%CO
2
培养箱中作用45min-60min。
5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，
其中病毒对照要作 200个TCID
50、20个TCID
50
、2个TCID
50
、0.2个TCID
50
4
个不同浓度的对照。
6）感作完成后每孔加入100μl细胞悬液，放37℃ 5%CO
2
培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。
7）结果计算，按Reed-Muench 两氏法或Karber 法进行。
血清稀释度 CPE 孔数
无CPE 孔数
累计
保护率% CPE 孔数 无CPE 孔数
1∶2（10-0.3） 0 4 0 15 100（15/15） 1∶4（10-0.6） 0 4 0 11 100（11/11） 1∶8（10-0.9） 1 3 1 7 87.5（7/8） 1∶16（10-1.2） 1 3 2 4 66.7（4/6） 1∶32（10-1.5） 3 1 5 1 16.7（1/6） 1∶64（10-1.8） 4 0 9 0 0（0/9） 1∶128（10-2.1） 4 0 13 0 0（0/13） 1∶256（10-2.4） 4
17
0（0/17）
即1∶20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE 。 2、固定血清——稀释病毒法 1）将病毒作连续10倍稀释
2）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl ，做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50μl 待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50μl 正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO 2培养箱作用1h 。
3）然后在每孔中加入100μl 细胞悬液。
距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/（高于50%的保护率—低于50%的保护率）
=（66.7-50）/（66.7-16.7）
lgPD50=高于50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差
=-1.2+0.33×(-0.3) =-1.299
=0.33
PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20
4）设两纵排正常细胞对照。
5）置37℃ 5%CO
2
培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6）分别计算每组病毒的TCID
50
，然后计算血清的中和指数。
中和指数=试验组TCID
50 /对照组TCID
50
如：中和指数=10-4.0/10-7.0 =103.0=1000
判定标准：以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。
首先要纠正一下错误的问题描述。正确的换算公式是
1 TCID50 = 0.7 PFU
你的病毒滴度为：10^12.3 TCID50/0.1ml = 10^13.3 TCID50/ml
（你好像没有理解TCID50的概念，请参考这里：https://www.docsj.com/doc/7d13841479.html,/bbs/topic/14324310）10^13.3 TCID50/ml = 10^13.3 TCID50/ml × 1又因为1 ＝0.7 PFU/TCID50, 所以10^13.3 TCID50/ml = 10^13.3 TCID50/ml * 0.7 PFU/TCID50 = 10^13.15 PFU/ml
https://www.docsj.com/doc/7d13841479.html,/bbs/topic/22833577
空斑分析(plaque assay)是检测病毒感染颗粒滴度的一种常用方法。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml，其中PFU(plaqueforming unit)表示空斑形成单位。它的优势在于可以直接用肉眼看到一个一个空斑（一些相信肉眼观察胜于可重复性的科学家非常乐意使用这个方法），但是它的重复性比较差（有时候是非常差），因此笔者强烈推荐采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。
由于PFU又使用非常广泛，所以就涉及到PFU和TCID50 换算的问题。简单地说他们的关系是：1个TCID50 约等于0.7个PFU，即：
1 TCID50 ≈ 0.7 PFU
例如某病毒的滴度为105TCID50/ml，那么它换算成PFU为：
105TCID50/ml = 105TCID50/ml * 1 =105TCID50/ml * (0.7PFU/TCID50) = 7*104PFU/ml
如果你是只求知其然那种科学家，知道这一点就够了，没有必要往下看了，但是千万别记反了。如果你还想知其所以然，请继续看我的推演。我尽量做到深入浅出。
我们知道1个PFU在理想的情况下代表一个病毒颗粒，但是实验过程中会出现两个（或多个）病毒
颗粒粘在一起了，或者是它们感染了同一个细胞或两个非常相近的细胞，在形态上，只表现出一个空斑，所以在严谨意义上又不好说一个空斑就是一个病毒，只好换了个说法：将形成一个空斑的病毒颗
粒的数量定义成空斑形成单位即PFU。事实上，1个PFU近似等于一个病毒颗粒。为了说明方便，在下文中我有时候也把一个PFU就说成一个病毒（当然是有感染性的病毒颗粒）。
根据TCID50的定义我们知道：用含有一个TCID50的病毒液体去感染细胞，有50%的感染可能性。有的战友会说，那不就是：一个TCID50的病毒液体就是含有0.5个病毒了吗？又因为一个PFU约等于1个病毒，所以1个TCID50约等于0.5 PFU了吗？如果你理解到这一步，那恭喜你，你肯定不会把TCID50/PFU的换算公式记反了，但是这个理解和实际情况是有偏差的。
回想一下，在TCID50试验结果中，我们只考察又多少个孔感染病毒，至于感染病毒的孔到底感染了多少个病毒形成了多少个空斑，并没有在计算结果中反应出来。换句话说一个感染了病毒的孔，它可能形成一个空斑，也可能形成两个、三个等多个空斑。所以说一个TCID50含有的病毒的数量要比0.5个病毒多一点点，所以就有1个TCID50要略大于0.5PFU。那么到底大多少呢？别急，先恭喜你一下，你的理解有进了一大步！
在进一步讲解这个0.7的近似值是如何计算出来之前，让我们来先回顾一下相关的数学概念。
现在我设想有一个摇奖机：机器里面有20个大小完全相同的球，每次摇奖它可以掉出一定数量的球，那么它掉出1个，2个，3个，……，20个球的概率分别是多少？学过高中数学我们就可以知道掉出n个球的概率符合二项分布。如果忘记了，你可以复习一下，如果不想复习，也不妨碍继续看我的帖子。我简单说明一下，掉出1个和20个概率最小，渐渐地到掉出10个和11个的概率最大。二项分布的概率函数图如下：
现在我们设想另外一种情况：如果是一个装有20个球的捞奖桶，然后用一个一定大小的勺子去捞出一定数量的球，那么它捞出1个，2个，3个，……，20个球的概率分别是多少？如果我让你猜一猜捞出几个球的概率最大，聪明的你肯定可以想到那取决与我给你的勺子有多大，如果勺子适合捞出
2.7个球，那么捞到3个球的概率最大。可以想象的是捞到20个球的概率几乎为0。同时我们知道
捞出的最大概率的球数实际上还取决于勺子的大小这个参数。关于这个数学模型，现在我们来学习一下泊松分布：
在的随机试验中，如果试验次数k很大，二项分布的概率p很小，且乘积λ= k*p比较适中，则事
件出现的次数的概率可以用泊松分布来逼近。具体的数学证明请看相关专业参考书。泊松分布的概率函数图如下：
（cited from:维基百科：泊松分布）
泊松分布的函数为：
P(X=k)=e-λ*λk/k!
其中λ表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间(或单位面积)内随机事件的平均发生频率。
在温故了二项分布并知新了泊松分布之后，我们再回过头来看看我们要解决的生物问题。在TCID50
试验中，一个孔形成非常非常多的空斑（即k很大）的情况的概率非常非常小（即接近0), 这种情况可以用泊松分布来逼近。
解决生物问题的第一步是要把生物问题转化为数学问题。这一步是相当困难的！以下是TCID50实验结果转化为数学的描述：
根据TCID50的实验我们知道用一个TCID50的病毒液体去感染细胞，有一半会感染，而另一半不会感染，换个说法就是：有一半的孔会出现至少一个空斑，而另一半的孔则出现0个空斑（即不感染），那么出现0个空斑的概率为0.5
即：
P(X=0)=e-λ*λ0/0! = 0.5
我们知道0!=1, λ0＝1 所以：
e-λ*1/1 = 0.5
求得
λ=-ln(0.5) ≈ 0.69
终于看到了这个近似值是怎么来的了，可是这个λ又表示什么意思呢？
泊松分布的函数为：
P(X=k)=e-λ*λk/k!
其中λ表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间(或单位面积)内随机事件的平均发生
频率。
这个描述比较抽象，我在网上找到了另外一个比较好的解释（请参考这里：https://www.docsj.com/doc/7d13841479.html,/Poisson_Exp.php）
The Poisson parameter Lambda (λ) is the total number of events (k) divided by the
number of units (n) in the data (λ = k/n). The unit forms the basis or denominator
for calculation of the average, and need not be individual cases or research
subjects.
For examples, if we have 100 people, and only 90 of them go shopping in a week
then the binomial risk of shopping is 90/100 = 0.9. However, some of the people
will go shopping more than once in the week, and the total number of shopping
trips between the 100 people may be 160, and the Poisson Lambda is 160/100 =
1.6 per 100 person week.
关于λ的解释还是很抽象，但是他给了一个很好的例子。把例子翻译过来就是：
在100个人中，只有90人每周去购物，那么单个人每星期去购物的机会为90/100=0.9。然
而一些人一个星期内不止去购物一次，而所有人的购物次数总和为160次。那么泊松分布的
λ是160/100 = 1.6次/人/星期。
如果再要求解一个人一周去购物两次的概率，就可以把λ＝1.6套入公式计算得到了。
好！现在我们来类比一下：现有100孔细胞，每孔接入0.1ml病毒液，只有50孔会感染病毒并产生空斑，所以每孔细胞感染病毒的机会为0.5 （这是根据TCID50的定义来的）。然而一些感染病毒的孔可能不止形成一个空斑，所以这100个孔总共形成的空斑数目肯定>50, 假设它的数值为k, 那么λ＝k/100 个空斑/每孔。
已经求得λ = - ln(0.5), 所以
-ln(0.5) = k /100
k= -ln(0.5) * 100 ≈ 70
即100个TCID50 在理想状态下共可以形成-ln(0.5) * 100) (≈70) 个空斑。
所以1个TCID50 可以在理想状态下可以形成-ln(0.5)个空斑，即：
1 TCID50 ＝-ln(0.5) PFU ≈ 0.7 PFU
更多讨论请参考我在丁香园发表的相关帖子:
https://www.docsj.com/doc/7d13841479.html,/bbs/topic/14324310
https://www.docsj.com/doc/7d13841479.html,/bbs/topic/22833577
MOI不是病毒的滴度，以下来自链接所给网站：MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的含义。A ,能产生细胞裂解效应的病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其MOI的含义与传统的概念相同。B ,对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu 表示病毒的数量，而是采用TU、IU、病毒颗粒（viral particles, v.p）或基因组数量（vector genome,v.g.）来表示病毒数量。采用TU或IU，MOI的含义便是TU number/cell 或IU number/cell。采用v.p.，MOI的含义便是v.p. number/cell 。采用v.g，MOI的含义便是v.g. number/cell。可以将上述不同的MOI 表示方式分为2种：1）以活性单位表示病毒数量，如pfu, TU, IU。这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。2）以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p. 或v.g. 。这时MOI的含义是指平均每
Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
一文读懂对话式交互技术原理及流程设计
一文读懂对话式交互技术原理及流程设计 一、对话式交互技术 以智能音箱、智能电视为代表的对话式交互，是时下非常火热的、且能够走近我们生活的人工智能子领域。 什么是对话式交互呢？我们首先从一个例子开始。贾维斯，电影《钢铁侠》中那位钢铁侠的AI 管家，他能独立思考、可以实时帮钢铁侠处理各种事情，包括计算海量数据。其中最让观众印象深刻的就是，贾维斯可以随时随地像人一样进行口语交流，来解决钢铁侠的问题。 贾维斯能听、会说，能实时理解主人的对话意图并根据实际场景进行下一步的对话，如果在对话过程中碰到有歧义的情况，他还会追问钢铁侠，让他提供更多的信息来消除歧义。贾维斯的这些能力就是对话式交互要提供的，其中的核心是VUI （V oice User Interface，语音用户界面）的设计。相对于GUI（Graphical User Interface，图形用户界面），VUI 解放了人的双手，某些场景下，简单的一句语音命令就能代替GUI 下鼠标/ 遥控器的多次点击，这带来的不只是方便，还节省了时间。一个好的VUI 系统，能够让用户尽可能通过最少轮次的对话实现既定意图的执行。贾维斯总能在危机时刻帮到钢铁侠，他是一个具有完美VUI 的语音助手。 嗯，我们不要入戏过深，贾维斯是一部电影里的虚拟系统。那么，现实生活中，我们能创造出来一个接近贾维斯的对话式交互系统吗？我们该怎么做呢？呃，很遗憾，以当前的科技发展水平，我们还做不到电影里那么智能，更不用说让机器有意识。但人机交互并不是昨天才发明出来的，人类在这个领域已经探索了几十年，我们可以实现钢铁侠与贾维斯的交互方式，并用这种方式来帮我们处理一些数据或控制我们身边的一些硬件设备（比如让语音助手根据天气提供穿衣建议或者控制厨房和卧室的各个家电），这就是我们要聊的对话式交互技术。 对话式交互技术包括了语音识别/ 合成、语义理解和对话管理三个部分。当下的对话式交互产品主要分两类：以微软小冰为代表的开放域（Open Domain）对话系统和以亚马逊
教学设计原理与方法
教学设计原理与方法 一、教学设计概述 1、教学设计的定义是什么？谈谈你是如何理解的。 对教学结果作出评价的一种计划过程与操作程序。 确定并解决教学问题，实现教学最优化的现代教学技术。 （教学设计不再是简单的设计之后加以实施的问题，而是一个在学—教的具体境脉中、在互动中发展演化的过程。） 教学设计属于教育科学领域的方法论学科，是教学论的重要组成部分。 教学设计的基本原理与方法适用于不同类型和层次的教学系统的设计，具有很强的实践性、操作性。 2、教学设计的理论基础是什么？ a)系统科学理论 b)学习理论 c)教学理论 d)教育传播理论 3、教学设计的内容包括哪些？ 1、分析教学目标 2、确定教学策略 3、进行教学评价 4、教学设计应用在哪些领域？试举例说明。 （一）教学类型（过程）的设计 1、多媒体组合课堂教学 2、基于局域网的网络教学 3、广播电视远程教学 4、基于Internet的远程教学 （二）教学资源的设计 1、电视教材 2、多媒体（网络）课件 3、专题学习网站 4、网络课程 5、专业资源库 二、学习者特征与教学目标分析 1、学习者特征分析的内涵是什么？教学中通常需要分析学习者的哪些特征？（学生的认知结构和认知发展水平、学习者的起点能力分析、学习风格、自我效能感、学习动机） 教学中通常需要分析学习者的： 一、认知发展特征分析 二、起点能力分析 三、学习风格分析 四、学习动机分析 五、学习自我效能感分析 2、教学目标分类的代表性理论有哪些？
（一）布卢姆等的教学目标分类理论 1、认知领域 2、动作技能领域 3、情感领域 （二）加涅的学习结果分类理论 （三）国内对教学目标的研究 3、教学目标分析方法有哪些？举例说明如何表述教学目标？ 依据知识点的内容属性确定具体的教学目标，采用教学内容与教学目标二维层次模型 行为目标的ABCD表述方法 A即Audience，意指“学习者”，要求有明确的学习者，他们是目标表述句中的主语。 B即Behavior，意为“行为”，要求说明通过学习后，学习者应能做什么，是目标表述句中的谓语和宾语。 C即Conditions，意为“条件”，要求说明上述行为在什么条件下产生，是目标表述句中的状语。 D即Degree，意为“程度”，要求明确上述行为的标准。 三、学习环境设计 1、学习环境的内涵是什么? 谈谈你是如何理解的 /场所说 /工具说 /条件说 广义的学习环境，是指一切影响学习的环境条件和各种因素。 狭义的学习环境，是指在正规课程中影响课堂学习的各种情况和条件。（专指课堂学习环境） 全面认识学习环境概念，需要结合学习环境的空间和时间两个存在形式来考察，学习环境既是一种静态的系统结构，也是一种动态的发展过程。 2、建构主义学习环境的基本构成要素是什么？举例说明。 3、试述学习环境的设计方法。 ——真实情境 ——问题情境 ——模拟真实情境 四、学习资源设计 1、学习资源的主要类型有哪些？
第一性原理计算方法论文
第一性原理计算的理论方法 随着科技的发展，计算机性能也得到了飞速的提高，人们对物理理论的认识也更加的深入，利用计算机模拟对材料进行设计已经成为现代科学研究不可缺少的研究手段。这主要是因为在许多情况下计算机模拟比实验更快、更省，还得意于计算机模拟可以预测一些当前实验水平难以达到的情况。然而在众多的模拟方法中，第一性原理计算凭借其独特的精度和无需经验参数而得到众多研究人员的青睐，成为计算材料学的重要基础和核心计算。本章将介绍第一性原理计算的理论基础，研究方法和ABINIT 软件包。 1.1第一性原理 第一性原理计算(简称从头计算，the abinitio calculation)，指从所要研究的材料的原子组分出发，运用量子力学及其它物理规律，通过自洽计算来确定指定材料的几何结构、电子结构、热力学性质和光学性质等材料物性的方法。基本思想是将多原子构成的实际体系理解成为只有电子和原子核组成的多粒子系统，运用量子力学等最基本的物理原理最大限度的对问题进行”非经验”处理。第一性原理计算就只需要用到五个最基本的物理常量即(b o k c h e m ....)和元素周期表中各组分元素的电子结构，就可以合理地预测材料的许多物理性质。用第一性原理计算的晶胞大小和实验值相比误差只有几个百分点，其他性质也和实验结果比较吻合，体现了该理论的正确性。 第一性原理计算按照如下三个基本假设把问题简化： 1．利用Born-Oppenheimer 绝热近似把包含原子核和电子的多粒子问题转化为多电子问题。 2．利用密度泛函理论的单电子近似把多电子薛定谔方程简化为比较容易求解的单电子方程。 3．利用自洽迭代法求解单电子方程得到系统基态和其他性质。 以下我将简单介绍这些第一性原理计算的理论基础和实现方法：绝热近似、密度泛函理论、局域密度近似(LDA)和广义梯度近似(GGA)、平面波及赝势方法、密度泛函的微扰理论、热力学计算方法和第一性原理计算程序包ABINIT 。 1．2量子力学与Born-Oppenheimer 近似 固体是由原子核和核外的电子组成的，在原子核与电子之间，电子与电子之间，原子核与原子核之间都存在着相互作用。从物理学的角度来看，固体是一个多体的量子力学体系，相应的体系哈密顿量可以写成如下形式： ),(),(R r E R r H H ψψ= （1-1） 其中r,R 分别代表所有电子坐标的集合、所有原子核坐标的集合。在不计外场作用下，体系的哈密顿量日包括体系所有粒子(原子核和电子)的动能和粒子之间的相互作用能，即 N e N e H H H H -++= （1-2） 其中，以是电子部分的哈密顿量，形式为：
《教学设计原理与方法》课程复习提纲-
《教学设计原理与方法》复习提纲 （20XX年6月） | 一、教学设计概述 1、教学设计的定义是什么 教学设计是应用系统方法分析研究教学的问题和需求，确定解决它们的教学策略、教学方法和教学步骤，并对教学结果作出评价的一种计划过程与操作程序。 2、教学设计的理论基础是什么 系统科学理论、学习理论、教学理论、教育传播理论 3、教学设计的内容包括哪些 1、分析教学目标 2、确定教学策略 3、进行教学评价 4、教学设计应用在哪些领域试举例说明。 ? 教学类型（过程）的设计教学资源的设计 1、多媒体组合课堂教学 1、多媒体（网络）课件 2、基于局域网的网络教学 2、专题学习网站 3、广播电视远程教学3、网络课程 4、基于Internet的远程教学 4、专业资源库 二、教学目标与教学内容分析 1、教学目标的定义是什么 教学目标是对学习者通过教学后应该表现出来的可见行为的具体明确的表述，是教学设计和课程设计的基础，是学习者在教学活动实施中应达到的学习结果。 | 2、教学目标分类的代表性理论有哪些
3、教学目标分析方法有哪些教学目标的表述方法有哪些试举例说明。 教学目标的分析方法： （1）分析教学内容 （2）分解目标层次 （3）表述教学目标教学目标的表述方法： ` （一）行为目标的ABCD表述法 对象（audition）、行为（behavior）、条件（conditions）、标准（degree） Ex：（“给予20个要填写形容词的未完成的句子，学生能在15分钟内分别写出形容词以完成句子”） （二）内部过程与外显行为相结合的表述法（三）表现性目标的表述法 4、教学内容可以分为哪几类 事实、概念、技能、原理、问题解决 5、教学内容分析方法有哪些教学内容分析的关键在什么地方 归类分析法图解分析法层级分析法信息加工分析法 教学内容分析的关键： "
大鼠骨骼肌细胞培养实验指导
大鼠骨骼肌细胞培养 骨骼肌是一种横纹肌，通常是通过肌腱固定到骨骼上，其伸缩可以带动骨骼的移动，促进机体运动。 肌细胞呈纤维状，不分支，有明显横纹，核很多，且都位于细胞膜下方。肌细胞内有许多沿细胞长轴平行排列的细丝状肌原纤维，每一肌原纤维都有相间排列的粗肌丝及细肌丝。肌纤维收缩并不是肌纤维中肌丝本身的缩短或卷曲，而是细肌丝在粗肌丝之间滑行的结果，肌丝滑行使肌节长度缩短，肌原纤维缩短表现为肌纤维收缩。 体外培养大鼠骨骼肌细胞，为临床肌肉损伤的治疗提供理论依据. 一、实验前准备 实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。 按照含0.2%的XI胶原酶、0.2%的中性蛋白酶、0.1%的胶原酶进行配制消化液，用0.22微米的PES微孔滤膜进行过滤除菌，置于50毫升离心管中，可直接用于组织消化。瓶口消毒后室温待用。 取出无菌培养皿，分别作好标记，吸取适量PBS置于相应标记的培养皿中。 无菌条件下，准备好各种大小的眼科剪刀、止血钳、眼科镊子和手术刀。将断颈处死后浸泡于体积分数为 75%乙醇的SD大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。 二、骨骼肌提取 眼科剪刀剪开大鼠后肢皮肤，暴露腿部肌肉，用手术刀小心割取后肢大腿肌肉，同样方法分离另一后肢大腿肌肉。小心剪取表面无附着膜和脂肪组织的肌肉，置于装有PBS的无菌培养皿中。 吸取适量消化液于相应标记的培养皿中。 将剪取的骨骼肌在无菌PBS浸泡清洗，去除脂肪组织后放置于含消化液的培养皿中，采用眼科剪刀剪碎骨骼肌组织，成1平方毫米不规则碎片。 轻轻摇匀，室温静置消化30分钟 收集组织悬液于50毫升离心管中，用消化液反复冲洗培养皿，直至将全部组织块收集到离心管内。 轻轻吹打混匀组织块悬浮液。
(完整版)transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
量子力学第一性原理
量子力学第一性原理：仅需五个物理基本常数——电子质量、电子电量、普郎克常数、光速和玻耳兹曼常数，通过求薛定谔方程得到材料的电子结构，而不依赖于任何经验常数即可以预测微观体系的状态和性质，预测材料的组分、结构、性能之间的关系，进一步设计具有特定性能的新材料 作为评价事物的依据，第一性原理和经验参数是两个极端。第一性原理是某些硬性规定或推演得出的结论，而经验参数则是通过大量实例得出的规律性的数据，这些数据可以来自第一性原理(称为理论统计数据)，也可以来自实验(称为实验统计数据)。如果某些原理或数据来源于第一性原理，但推演过程中加入了一些假设(这些假设当然是很有说服力的)，那么这些原理或数据就称为“半经验的”。 量子化学的第一性原理是指多电子体系的Schr?dinge r方程，但是光有这个方程是无法解决任何问题的，量子力学能够准确的解决的问题很少很少，绝大多数都是有各种各样的近似，为此计算量子力学提出一个称为“从头计算”的原理作为第一性原理，除了Schr?dinger方程外还允许使用下列参数和原理： (1) 物理常数，包括光速c、Planck常数h、电子电量e、电子质量m e以及原子的各种同位素的质量，尽管这些常数也是通过实验获得的。(在国际单位值中，光速是定义值，Planck常数是测量值，在原子单位制中则相反。) (2) 各种数学和物理的近似，最基本的近似是“非相对论近似”(Schr?dinger 方程本来就是非相对论的原理)、“绝热近似”(由于原子核质量比电子大得多，而把原子核当成静止的点处理)和“轨道近似”(用一个独立函数来描述一个独立电子的运动)。 量子化学的从头计算方法就是在各种近似上作的研究。如果只考虑一个电子，而把其他电子对它的作用近似的处理成某种形式的势场，这样就可以把多电子问题简化成单电子问题，这种近似称为单电子近似，也称为平均场近似，例如最基本的从头计算方法哈特里－富克（Hartree-Fock）方法，是平均场近似的一种，它把所有讨论的电子视为在离子势场和其他电子的平均势场中的运动。但是哈特里－富克近似程度过大，忽略了电子之间的交换和相关效应，使得计算的精度受到一定的限制，为了解决这一问题，P Hohenberg和W Kohn于1964年提出密度泛函理论（density functional theory, DFT），这一理论将电子之间的交换相关势表示为密度泛函，然后使薛定谔方程在考虑了电子之间的复杂相互作用后
细胞培养实验指导
细胞培养实验指导陈轶霞刘俊林
实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常采用紫外灯消毒；按实验室的卫生管理要求对实验室洁净区按周期进行熏蒸消毒；在培养期间发生严重污染时要进行熏蒸消毒。 （2）培养工作开始操作前将所有培养用的物品经专用物流通道通过传递窗放进培养室，开紫外灯消毒30min，关紫外灯后方进入操作。配有空气净化系统的洁净室在风机开启至少30min后才能达到相应的洁净度级别。 （3）操作者进入培养室时要遵守的程序 a: 用肥皂洗手，在干手器上吹掉手臂上的水滴。 b: 换穿无菌室专用鞋，进入更衣室，外衣挂到指定的衣柜里，用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂进行消毒，戴帽子（不露头发）、口罩（应包住胡须），穿已消毒的洁净服，进入缓冲室。再用0.1%新洁尔灭溶液对手及前臂消毒，在其滞留3min后进入培养室。 （4）开超净工作台10min，期间用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭操作台面后可开始具体的操作，同时点燃酒精灯用于临时性的火焰消毒。 （5）实验完毕，关闭超净工作台，及时清理实验用品，废物从通往物流通道的传递窗中传出。工作台面用0.1%新洁尔灭溶液的擦拭消毒后方可出培养室。 （6）出培养室时，将工作服放在更衣室指定的位置以便清洗和消毒，鞋放到隔离鞋柜里，跨过隔离鞋柜，将用过的一次性帽子、口罩、鞋套等放到指定的废物桶，出实验室前用肥皂洗手，关闭空气净化系统，开紫外灯30min。 注：(不写实验报告)
病毒感染细胞实验整体流程和原理
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
交互设计概述·全
交互设计概述 1. 探索思想 如果我们问，交互设计是什么？?家从 IxDC 的定义中能很快知道答案。 交互设计，又称互动设计（Interaction Design, 缩写 IxD 或者 IaD），是定义、设计?造系统的?为的设计领域。在于定义?造物的?为?式（the “Interaction”，即??制品在特定场景下的反应?式）相关的界?。[]1 很显然，如果根据定义去看，我们应该是云?雾?，根本看不懂它的定义，也?法理解交互设计是什么，又为何如此去定义的。?然，这种?法就不可取。?当?法理解?个东西是什么的时候，不妨问问??，为什么这个东西不是其他什么。 所以与其从正?去理解交互设计是什么，不如进?对它进?质疑与攻讦。当然，我们进?质疑与攻讦的?的，不是为了搞个?新闻，去否定交互设计的价值，?是通过这种质疑，去理解交互设计的合理性，存在的意义，从?加深对于交互设计的理解，在宏观层?去触及交互设计为什么是这样的。毕竟，?个合理的东西，从任何?度进?攻击都不应该会有破绽。 所以，第?件事，我们应该问问，交互设计是不是应该必须存在在世界上的？它的存在是有什么必然性吗？世界上没有交互设计，还能不能正常运作？ 交互设计是如何诞?的？交互设计有什么?？我们为什么需要去研究交互设计？ 只有我们肯定了交互设计存在的合理性，我们才能更好地去理解，什么是交互设计。 2.交互设计存在的合理理性 2.1.界定交互设计的标准是什什么？ 既然我们质疑交互设计存在的合理性，我们?先要做的，应该是界定，什么能够称得上是交互设计？能被称为交互设计的界定标准是什么？因为如果没有这个标准，?切皆可以被称为「交互设计」，那么我们所有讨论的案例、理论、设计都将会是没有意义的。我们出?个问题?问?下： ??瓶?的包装设计能不能被称为交互设计？ ??个栏杆的指?设计设计能不能被称为交互设计？ ?飞机的控制系统仪表盘设计能不能被称为交互设计？
教学设计原理 加涅 完整笔记
教学设计原理 R.M.加涅
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一教学系统导论 1 教学设计导论 教学设计的主体内容：教师用来使学生参与到学习活动中去的完整的活动范围，如： ?如何将学生进行分组，以有助于学生学习和交流 ?什么时候练习与反馈最有效 ?技能知识学习的前置知识有哪些 掌握教学设计原理的目的： 按照一定的理论，对教学设计过程进行设计，促进学生参与到学习事件和活动中去，使教学更有效。 1.1 教学设计的基本假设 没有哪一种教学设计模型是最佳的，基本假设： ?教学设计是帮助学习过程，而不是教学过程（目的是达到教学效果） ?学习效果受多种因素的影响（毅力、时间、教学质量、学生能力、原有知识、学习能力等） ?教学设计模型可运用到多种教学场景下（学生个体、小组、大组），原理保持不变 ?利用学习者对教学设计进行检验，反复设计与验证，使教学趋于完善 ?教学设计本身是一个过程，包含相关子过程（原子过程是：将学生置于学习过程中的预习、评价、 反馈等） ?不同的学习目标需要不同的教学形式 1.2 学习原理 学习情境 人在清醒的时刻，都在观察和处理信息，一些信息被记忆，一些被摒弃。 是什么让人记忆： ?学习者内部（来源于学习者，想获知） ?学习者外部（提供一个事件，包括学习内容、目的、方法等环境）
?学习者、学习发生的情境、学习的内容、学习过程等存在着相互作用 教学原则 从学习原理中，指导教学设计的一些原则： ?接近：教学环境与学习目的相接近 教学情境的设计接近学习的目的，或学习预期。教学设计以达到教学目标为纲，而不应以方便学习或教学为目的。如，学习目的是“在没有帮助的情况下，装配一支枪”，教学中要尽量避免给学生图纸。 ?重复：教学环境与学习者的反应需要重复，以使学习得到进步 重复的教学环境和学习者反应，只是一种练习形式，而非基本条件，也不是必须的。 ?强化：使学习变得有期望，以便学习者能“自我激励” 学习过程中，如果能让学习者看到预期的结果，并相信能达到，将使学习得到强化。预期的结果可以分为两种 ?短期，如学习习得了，就有奖励等 ?长期，如社会期望、人生追求、家庭厚望等 ?合作协商：学生与其他学生或知识丰富的人一起学习，以确认信息的意义，即合作学习环境可以 促进学习 ?广泛认知：学生广泛的获取相关惰性知识（初步接触，并不注重应用，在需要时能回忆起来，并 通过进一步学习掌握的知识），是教学环境设计的一部分 ?组织活动：通过参加活动来促进学习发生 要明确学习是活动的结果和目的。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
细胞生物学试验指导
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
电子运动服从量子力学规律
电子运动服从量子力学规律，电子体系的性质由其状态波函数确定。但波函数包含3N个变量（N为电子数目），对于含很多电子的大体系，通过求出波函数计算体系的性质计算量非常大，很难实现。根据密度泛函理论，体系的性质由其电子密度分布唯一确定。电子密度分布是只含三个变量的函数，通过它研究体系的性质可以大大减少计算量，对大体系的量子力学计算就比较容易进行。密度泛函理论研究的基本内容是寻找体系的性质（特别是动能和交换相关能）作为电子密度分布的泛函的精确或近似的形式、相关的计算方法和程序及在各科学领域的应用。目前与密度泛函理论相关的研究有三方面的工作：1．密度泛函理论本身的研究。一部分工作是寻找基态体系性质（特别是动能和交换相关能）作为电子密度分布的泛函的精确形式或者尽可能精确的近似形式；另一部分工作是拓宽密度泛函理论的内涵。2．密度泛函计算方法的研究，包括新算法的提出和程序的优化。用密度泛函理论研究具体体系，必须通过计算才能得到所需结果。大的体系，计算很复杂，是能否用密度泛函理论方法进行研究的瓶颈。因此，发展高效率的计算方法和相关程序是很重要的工作。目前的研究热点是实现对大体系的高精度计算，结合使用密度泛函理论的线性标度算法和分区算法特别受到重视，迄今也已经提出过很多算法，并且推出了相关的计算程序。发展对含重元素体系的相对论密度泛函计算方法也受到重视。3．用以近似能量密度泛函为基础建立的方法研究各种化学和物理问题。密度泛函方法由于其计算量比从头计算方法小得多，可以用来计算大的复杂体系，结果精度可以满足很多研究工作的要求，因此目前已经得到广泛应用。随着更精确的密度泛函形式的发现和更高效率的计算方法和程序的推出，密度泛函理论方法肯定将在化学、物理学、材料科学（纳米科学）、生命科学、药物化学等领域的研究工作中发挥更大的作用。 自从20世纪60年代密度泛函理论(DFT)建立并在局域密度近似(LDA)下导出著名 的Kohn-Sham (KS)方程[1,2]以来,DFT一直是凝聚态物理领域计算电子结构及其特性 最有力的工具。近几年来DFT同分子动力学方法相结合,在材料设计、合成、模拟计算和 评价诸多方面有明显的进展,成为计算材料科学的重要基础和核心技术[3]。特别在量子 化学计算领域,根据INSPEC数据库的记录显示,1987年以前主要用Hartree-Fock(HF) 方法,1990~1994年选择DFT方法的论文数已同HF方法并驾齐驱,而1995年以来,用 DFT的工作继续以指数律增加,现在已经大大超过用HF方法研究的工作[4]。W. Kohn 因提出DFT获得1998年诺贝尔化学奖,非常精确地表明DFT在计算量子化学领域的核 心作用和应用的广泛性。 DFT适应于大量不同类型的应用,因为电子基态能量与原子核位置之间的关系可以 用来确定分子或晶体的结构,而当原子不处在它的平衡位置时,DFT可以给出作用在原子核位置上的力。因此,DFT可以解决原子分子物理中的许多问题,如电离势的计算[5], 振动谱研究,化学反应问题,生物分子的结构[6],催化活性位置的特性[7]等等。在凝聚态 物理中,如材料电子结构和几何结构[8],固体和液态金属中的相变[9~10]等。现在,这些方 法都可以发展成为用量子力学方法计算力的精确的分子动力学方法[11]。 DFT的另一个优点是,它提供了第一性原理或从头算的计算框架。在这个框架下可 以发展各式各样的能带计算方法。虽然在DFT的所有实际应用中,几乎都采用局域密度 近似(LDA),这是一种不能控制精度的近似,因而DFT方法的有效性在很大程度上要看 其结果与实验相一致的能力。人们没有任何直接的方法可以改善LDA的精度。然而 DFT允许发展别的方法作为补充,在这个方向上,已提出了例如广义梯度近似(GGA)等 方法[12~16],把密度分布n(r)的空间变化包括在方法之中,实现了可较大幅度减少LDA 误差的目的。
《教学设计原理与方法》考核方式
《教学设计原理与方法》考评方式与标准 一、考核的形式 本课程考核的形式主要有三种，分别是日常考查、项目实践评定与期末考试评定。 日常考查是一种伴随日常教学而进行的经常性检查和了解学生学习情况的方法。本课程采用的日常考查形式主要是习题作业。 项目实践评定是一种针对项目或任务的实践成果而进行考核评价的方法。本课程综合采用电子作品（e-work）和评价量规（rubric）对每一项目实践的成果加以评定。 ?电子作品是学习者根据所学的知识，针对某一主题独立完成任务并以成果的 形式如电子作品、解决方案、研究报告、网页等方式展示自己的学习所得。 ?评价量规是一个评分工具，它为一个作品或其他成果表现列出标准，并且从 优到差明确描述每个标准的水平。 期末考试是依据课程目标和内容，选择一系列有代表性的问题，按照一定的程序与方式，对学生所学知识的掌握程度及综合运用知识的能力进行测量与评价的方法。 二、考核的内容 针对不同的考核形式，相应地，有不同的考核内容。 日常考查的内容主要是各教学专题的习题作业，请参见习题作业。 项目实践评定的内容主要是三个电子作品，并依据三个评价量规进行评价（如表1所示）。 项目实践内容电子作品评价量规 项目实践1：网络教学资源 的设计选择某一个学科的某一个内容，基 于一定的教学策略与设计方法，参 照资源技术规范，设计与开发一个 网络教学资源。 参见“附录1：网络教学资源 评价量规” 项目实践2：教学过程（模 式）的设计依据已开发的学习资源，选择合适 的教学模式（策略）进行教学过程 设计，撰写一份教学设计方案。 参见“附录2：教学设计方案 评价量规” 项目实践3：教学（培训）绩效改进方案的设计结合具体的问题，运用以绩效为导 向的教学设计方法，设计一份教学 （培训）绩效改进方案。 参见“附录3：教学（培训） 绩效改进方案评价量规”
植物生理学实验指导
植物生理学实验指导 Prepared on 24 November 2020
植物生理学实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存 植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。 植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。 一、原始样品及平均样品的采取、处理 植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。 在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。 除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
细胞凋亡实验步骤及注意事 项
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。