氨基酸的薄层层析
实验4 氨基酸的薄层层析
一、实验原理
薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。
薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的R f值（R f值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。
氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。
二、实验材料
（一）样品
1．氨基酸标准溶液：
（1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。
（2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。
（3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。
2．混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。
（二）试剂
1．硅胶G(C.P.)
2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静臵冷却，弃沉淀，取上清备用。
3．展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。
4．0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。
5．展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。
（三）仪器及器材
1．层析板（6×15cm）；
2．小烧杯；
3．量筒（10mL）；
4．小尺子；
5．吹风机；
6．毛细玻璃管；
7．层析缸；
8．烘箱。
三、实验步骤（一）实验流程
（二）操作步骤
1．制板
↓（1）调浆：称取硅胶3g，加0.5%的羧甲
基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。
（2）涂布：取洁净的干燥玻璃板a均匀涂
层b。
（3）干燥：将玻璃板水平放臵，室温下
放臵0.5h，自然凉干。
（4）活化：70℃c烘干60分钟。
a. 玻璃板要清洁平整，无油污。
b. 粘在玻璃板侧面边上的硅胶
粉应去掉，否则在层析时会有较
强的边缘效应。
c. 应逐步加温，温度过高易导致
涂层裂开。
2．点样
↓（1）标记：用铅笔距底边2cm水平线上
均匀确定4个点并做好标记。每个样品间
相距1cm。
（2）点样：用毛细管分别吸取丙氨酸、
精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，轻轻
接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不
超过2mm。点样后用电吹风a轻轻吹干，
必要时重复加样b。
a. 用冷风吹干，避免破坏氨基酸。
最好从玻板背面吹。
b. 重复点样时必须等第一点样品
干后再点第二点。
3．层析
↓将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-
显色剂液面应低于点样线a。盖好层析缸
盖b，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶
端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅
笔描出溶剂前沿界线。
a. 样点不能浸入到溶液中。
b. 将层析缸盖涂上凡士林，防止
层析液挥发。
图9-8 薄层层析装臵
4．显色用热风吹干或在90℃下烘干30min，即可显出各层斑点。
（三）注意事项
1．吸附剂
薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜，如果颗粒太大，展开时溶剂推进速度太快，分离效果不好。反之，颗粒太小，展开时太慢，斑点易拖尾，分离效果不好。
2．点样
点样的次数依照样品溶液的浓度而定，样品量太少时，有的成分不易显示，样品量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离，点样后的斑点直径一般为0.2cm。
3．避免污染
整个层析过程中，避免用手接触层析板，必要时戴上手套。
四、结果与讨论
（一）结果
1．层析结果：
图9-9 氨基酸薄层层析结果图
2．数据记录
按照下表记录各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离（a）及溶剂前缘至样品原点中心距离（b）
各斑点
色斑中心至样品原
点中心距离（a）溶剂前缘至样品原点中心距离（b）
丙氨酸
甘氨酸
精氨酸
混合点1
混合点2
混合点3
平均a值
溶剂前缘至样品原点中心距离（b）3．结果计算与记录
原点到溶剂前沿的距离距离
原点到层析斑点中心的
f
R
各斑点R f值氨基酸名称
丙氨酸—
甘氨酸—
精氨酸—
混合点1
混合点2
混合点3
4．常见问题及处理
问题解析
（1）斑点拖尾，不集中硅胶颗粒太小；层析液因为挥发浓度降低。
（2）斑点未显色茚三酮因存放时间长失效；显色时未用热风吹干，或者烤箱温度不足。
氨基酸的薄层层析
实验4 氨基酸的薄层层析 一、实验原理 薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。 薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的R f值（R f值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。 氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。 二、实验材料 （一）样品 1．氨基酸标准溶液： （1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 （2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 （3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。 2．混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。 （二）试剂
1．硅胶G(C.P.) 2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。 3．展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。 4．0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。 5．展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。 （三）仪器及器材 1．层析板（6×15cm）； 2．小烧杯； 3．量筒（10mL）； 4．小尺子； 5．吹风机； 6．毛细玻璃管； 7．层析缸； 8．烘箱。 三、实验步骤 （一）实验流程 （二）操作步骤 1．制板 ↓（1）调浆：称取硅胶3g，加0.5%的羧甲 基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。 （2）涂布：取洁净的干燥玻璃板a均匀涂 a. 玻璃板要清洁平整，无油污。 b. 粘在玻璃板侧面边上的硅胶 粉应去掉，否则在层析时会有较
氨基酸的薄层层析
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称氨基酸的薄层层析 实验日期2018-11-7 实验地点 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握薄层层析法的一般原理。 2、掌握氨基酸薄层层析法的制版、点样、层析和显色等基本操作技术。 3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即本次实验中氨基酸混合液）。 二、实验原理 1、薄层层析原理（色谱分析技术的一种）： 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来） 2、氨基酸与茚三酮的显色反应： 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 3、以相对迁移率-Rf值来判定氨基酸的种类： 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。 Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到对应斑点前沿的距离 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
三、材料与方法： 1、实验材料： （1）实验试剂：氨基酸的异丙醇溶液：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸 分析样品：混合氨基酸溶液 吸附剂：硅胶 粘合剂：0.5%的羧甲基纤维素钠 展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液） （2）实验器材：天平、层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻璃棒、量筒、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱 2、实验方法： （1）实验流程： （ 2）实验步骤： 步骤操作 ①制作硅胶层析板1、调浆称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫 升，调成均匀的糊状。 2、涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3、干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4、活化70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度 下降至不烫手时取出。 ②在层析板上加氨基酸样品1、标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。 2、取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细
氨基酸薄层层析实验报告doc
氨基酸薄层层析实验报告 篇一：生物化学实验-氨基酸分析实验报告 【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、 ②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、 ③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）： XX 】 一、预习报告 ? 实验原理： 根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。薄层层析是在玻 璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。 薄层层析（thin layer chromatography，TLC）：是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。 本次实验： ? 具体原理：当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不 一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在
薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。 ? 吸附剂（固定相）：硅胶（C.P.）。为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基 纤维素钠（CMCNa）作黏合剂。 ? 展开剂：正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:10:10,V/V/V）。 ? 展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。 ? 活化（activation）：在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。可使硅胶的活性提高，吸附能力加强。 ? 氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原， 此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。 ? Rf值： Rf? 斑点中心到样品原点的距离 对应溶剂前沿到样品原点的距离 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的， 因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 ? 实验材料：
氨基酸薄层层析
氨基酸薄层层析 一、实验目的 1、理解并掌握薄层层析法的原理。 2、掌握氨基酸薄层层析法的正确的操作步骤。 3、掌握根据不同物质的移动速率（Rf 值）来鉴定被分离的混合物的各种组分。 二、实验原理 1.薄层层析原理 薄层层析时一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来） 2.氨基酸与茚三酮的显色反应 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 3.基于相对迁移率Rf 值判定混合氨基酸组分 薄层层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf 值 即：Rf = 原点到溶剂前沿的距离 距离 原点到层析斑点中心的
因为物质在一定溶剂中的分配系数是一定值，故其移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法 A材料： 1样品： （1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。（2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。（3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10mol。（4）混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液 2试剂： （1）硅胶G(C.P)。 （2）0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。 （3）展开溶剂：按80:10:10比例（V/V/V)混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制 （4）0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.)0.1g溶于无水丙酮（A.R.)至100ml。（5）展层-显色剂：按照10:1比例（V/V)混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。 3仪器及器材： ①层析板（6cmx15cm）；②小烧杯；③量筒（10ml）；④小尺子；⑥毛细玻璃管； ⑦层析缸；⑧烘箱 B实验步骤 制版点样层析显色结果处理于分析薄层层析的具体操作步骤：
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析 一、实验目的 1．掌握薄层层析法的一般原理。 2．掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。 3．掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。 二、实验原理 1．薄层层析法是色谱分析技术的一种 一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶 硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。 硅胶吸附薄层层析的特点： ①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。 ②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。 ③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。但是实际操作时为70℃，活化1h 2．氨基酸与茚三酮的显色反应
茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。3．记录结果，计算Rf值 混合氨基酸被分离后，在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法： 材料： （一）分析样品：氨基酸混合液 （二）试剂： 吸附剂：硅胶 粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠、氨基酸的异丙醇溶液、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。展开-显色剂：正丁醇、乙酸、茚三酮溶液 （三）器材：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻棒、量筒、吹风机、毛细管、层析缸、药匙、烘箱 方法： （一）薄层板的制备 1．调浆称取硅胶3.5克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。 2．涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。 3．干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。 4．活化70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。
糖类的提取分离与薄层层析分析
糖类的提取分离与薄层层析分析 实验简介：薄层层析(thin layer chromatography,TLC)是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪酸、脂肪类、糖类、磷脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。本实验是从水果中提取单糖、双糖和多糖组分，采用硅胶G薄层层析法分析糖类成分。 一、实验目的 1、了解并初步掌握从水果中分离提取单糖、蔗糖及淀粉的原理。 2、学习薄层层析的一般操作及定性鉴定的方法。 二、实验原理 1、单糖及多糖的提取 凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。因此，单糖和双糖一般可用热水或乙醇将其提取出来。 多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有复杂的生理功能。多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。 2、薄层层析 薄层层析的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。 糖的分离鉴定可用吸附层析或分配层析，吸附层析常用的吸附剂为硅胶，分配层析常用的支持剂是硅藻土。在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上。硅胶G是一种已添加了黏合剂—石膏(CaSO4)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄板上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。若采用硼酸溶液代替水调制硅胶G制成的薄板可提高糖的分离效果。 薄层层析的展层方式有上行、下行和近水平等。一般常采用上行法，即在具有密闭盖子的玻璃缸(即层析缸)中进行，将适量的展层溶剂倒于缸底，把点有样品的薄层板放入缸中即可(如图1所示)。保证层析缸内有充分展层溶剂的饱和蒸汽是实验成功的关键。
氨基酸的薄层层析实验报告
生物化学实验报告 姓名： XXXXX 学号： XXXXXXXXXXXXXX 专业年级： XXXXXXXXXXXXXXX 组别：第X实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称氨基酸的薄层层析 实验日期XXXX-XX-XX 实验地点第X实验室 合作者XXXX 指导老师XXX 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1、掌握薄层层析法的实验原理。 2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作方法。 3、掌握如何根据移动速率（R f值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）的方法。 二、实验原理 1、薄层层析法是色谱分析技术的一种。 是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板（如玻璃板、塑料片、金属片等）上，形成薄层（常用厚度为0.25毫米左右）后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来） 硅胶吸附薄层层析： 吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附. 硅胶吸附薄层层析的特点： ②硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。
②硅醇基显较弱的酸性，因此，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。 ③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。 2、氨基酸与茚三酮的显色反应： 茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。 3、混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—R f值（rate of flow）来表示。 层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为R f 值。 即： Rf=原点到层析斑点中心的距离原点到斑点对应前沿的距离 由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（R f 值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。 三、材料与方法： （一）、材料：分析样品（氨基酸混合液）、吸附剂（硅胶）、粘合剂（0.5%的羧甲基纤维素钠）、氨基酸的异丙醇溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸）、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）； （二）、器材：层析板（5cm×15cm）、尺子、铅笔、小烧杯、玻棒、量筒（10ml）、吹风机、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱； （三）、方法： 1、实验流程： 2、操作步骤：
糖类的提取分离与薄层层析分析实验步骤
实验1 糖类的提取分离与薄层层析分析实验简介：薄层层析(thin layer chromatography, TLC)是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪酸、脂肪类、糖类、磷脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。本实验是从水果中提取单糖、双糖和多糖组分，采用硅胶G薄层层析法分析糖类成分。 一、实验目的 1．了解并初步掌握从水果中分离提取单糖、蔗糖及淀粉的原理。 2．学习薄层层析的一般操作及定性鉴定的方法。 二、实验原理 1．单糖及多糖的提取 凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。因此，单糖和双糖一般可用热水或乙醇将其提取出来。 多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有复杂的生理功能。多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。 2．薄层层析 薄层层析的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。 糖的分离鉴定可用吸附层析或分配层析，吸附层析常用的吸附剂为硅胶，分配层析常用的支持剂是硅藻土。在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上。硅胶G是一种已添加了黏合剂—石膏(CaSO4)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄板上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。若采用硼酸溶液代替水调制硅胶G制成的薄板可提高糖的分离效果。 薄层层析的展层方式有上行、下行和近水平等。一般常采用上行法，即在具有密闭盖子的玻璃缸(即层析缸)中进行，将适量的展层溶剂倒于缸底，把点有样品的薄层板放入缸中即可(如图1所示)。保证层析缸内有充分展层溶剂的饱和蒸汽是实验成功的关键。
实验一 薄层层析板的制备
实验一薄层层析板的制备 一、实验目的 制备薄层层析板，使叶绿素在层析板上分离显色。 二、实验原理 薄层层析，常用 TLC（Chromatography）表示，又称薄层色谱，属于液－固吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至 0.01 μg ）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达 500mg 的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。 薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺和纤维素。其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为：“硅胶H ”—不含粘合剂；“硅胶G ”—含煅石膏粘合剂；“硅胶HF 254 ”—含荧光物质，可用于波长为 254nm 紫外光下观察荧光；“硅胶GF 254 ”—既含煅石膏又含荧光 剂等类型。粘合剂除上述的煅石膏（半水合硫酸钙： 2CaSO 4 · H 2 O ）外，还 可用淀粉、羧甲基纤维素钠。 三、实验材料、器具 1、试剂硅胶、4‰的CMC溶液（羧甲基纤维素钠） 2、实验用具：药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒 四、实验步骤 1、载玻片要求平滑清洁，没有划痕，在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤，再用水冲洗干净。（干净的标准：水不是呈股流下，而是呈瀑布状态流下。） 2、与硅胶混合：CMC－Na溶液与硅胶的比例为3:1(3ml：1g)。取CMC－Na溶液倒入研钵中，然后加入硅胶，在研钵中研磨，按一个方向研磨，自下而上，然后自上而下，以赶尽气泡为佳。 3、铺板：将载玻片置于平台上，用药匙舀取糊状硅胶，均匀地铺在载玻片表面。铺板时，可以顺着板中间倒，也可以顺着某个边缘倒，也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上，倒时也要注意不要引入小气泡。尤其是载板的四个角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好的板，表面看上去要光滑平整，没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平的台面上，否则难保证板面硅胶的厚度均匀。（3g硅胶大约可铺7.5×2.5cm载玻片5-6块） 4、晾干：置水平台上于室温下晾干。 5、活化：将晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min，然后取出，放入干燥器中，备用。活化硅胶有利于提高硅胶的吸附性能，同时排除硅胶内部已吸收的水分及其他气体。通过活化硅胶，主要改变了硅胶内部的微孔结构，使其孔径的大小及微孔结构的排列得到进一步的改善。但是这样硅胶的吸附变大，可能会使样品分离困难。
氨基酸的薄层层析
氨基酸的薄层层析 [原理] 氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。 [试剂] （一）硅胶G （二）0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。 （二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。 1．0.01mol/L精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。 2．0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。 3．0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。 将上述溶液各取出1ml，混合均匀作为氨基酸混合溶液。 （三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。临用时配置。 （四）0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml中。 [主要器材] （一）玻璃板（4×10cm） （二）层析缸。 （三）喷雾器。 （四）长颈漏斗。 （五）玻璃毛细管。 （六）恒温干燥箱。 [操作步骤] （一）薄板的制备
1．称取硅胶G 0.5g放入研钵中，加1.5ml0.2%羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。 2．将上述糊状物倾倒在4×10cm的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶G均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。 1．薄板上硅胶干后，放入105℃的恒温干燥箱内活化，半小时后取出，晾凉备用。 图11 层析薄板 （二）点样 1．在距离薄板一端约2cm处用细线向下压硅胶，压成一条点样线。 2．用直径约1mm的玻璃毛细管分别吸取甘氨酸、精氨酸、酪氨酸及混合氨基酸溶液，在点样线上点样，每隔0.8cm处点一种样品（约5ul），点样直径约2~3mm。待点样处干后，再将样品在原点样处重复点一次。 （三）展层 1．硅胶板的点样端向下，倾斜地放入层析缸内，使其与缸底平面呈约30。角。 2．用长颈漏斗加入展开剂使展开剂离点样处1~2cm处为止。 3．盖上层析缸盖进行层析。 4．当展开剂前沿到达玻璃板全长的3/4处停止层析，取出玻片，记下展开剂前沿位置，将硅胶板置干燥箱烘干。 （四）显色 1．用0.5%茚三酮丙酮溶液均匀地喷洒于硅胶板上。 2．将玻板置105℃干燥箱内烘干，约2分钟左右即可显出粉红色斑点。 [结果] 计算R f值： R f值= = 样品至色斑中心的距离（cm）样品至溶剂前沿的距离（cm） 氨基酸移动的距离（cm）溶剂移动的距离（cm） 点样线
氨基酸的鉴定(纸层析法)
氨基酸的鉴定（纸层析法） 实验目的： 1、掌握纸层析法的基本原理 2、通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并学会分析未知样品中的氨基酸组分。实验原理： 1、层析法又称色谱法(Chromatography)，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附办、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。操作方式: 纸层析、薄层层析、柱层析等。 分离机理: 分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等。 2、纸层析法是用滤纸作为情性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂(流动相) 沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 物质被分离后在纸层析图谱上的移动速率用R f值来表示： 3、在一定条件下，物质的R f值是常数。R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。 4、本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。 试剂： 1、酸性展层剂——正丁醇：88% 甲酸:水=15:3:2
实验11 氨基酸的薄层层析分离和鉴定
实验11 氨基酸的薄层层析分离和鉴定 一实验目的 1．理解薄层层析原理， 2．掌握薄层层析技术， 3．学会氨基酸的较为精确的定性。 二实验原理 1 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别(如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性)，使各组分在两个相中的分布不同，其中一个相是固定不动的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 2 固定相：可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液） 3 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 4 层析技术利用 分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。 鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移 值）， 动距离，称比移值（ R f 所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的比移值就比较困难。为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。 薄板层析:通常将吸附剂（载体）铺在光洁的表面上（如玻璃板、金属或塑料等），形成均匀的薄层。然后以流动相展开，样品中的组分不断地被吸附剂（固定相）吸附，又被流动相溶解（解吸）而向前移动。由于吸附剂对不同组分有不同的吸附能力，流动相有不同的解吸能力，因此，在流动相向前流动的过程中，不同组分移动的距离不同，因而得到分离。 5 薄层层析特点 装置简单，操作简便。展开耗时短，一般20－30min即可上行十几厘米。斑点扩散少，检出灵敏度高。（0.01ug）同一薄层析可用多种试剂显斑。加厚薄层后可用于制备。（50mg） 三实验器材 1 材料 (1) 玻板：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格,要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。 (2)固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF<[254]> 、硅胶H、硅胶HF<[254]>,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F<[254]>等。 其颗粒大小,一般要求直径为10～40μm。薄层涂布,一般可分无粘合剂和含粘 合剂两种;前者系将固定相直接涂布于玻璃板上, 后者系在固定相中加入一定量的粘合剂，一般常用10～15％煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小时)，混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.5～0.7％)适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。也有含一定固定相或缓
氨基酸的分离鉴定(纸层析法)
氨基酸的分离（纸层析法） 一、实验原理 1、层析法又称色谱法，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而得到有效的分离。 操作方式：纸层析、薄层层析、柱层析等 分离机理：分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等 2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂（流动相）沿纸流动经过层析点时，层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。 分配系数=溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度 物质被分离后在滤纸上的移动速率用R f值表示： R f=原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离 只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，R f值是常数，故可根据R f值作定性 依据。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 二、实验器材 标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。 三、实验试剂 1、酸相溶剂：V[正丁醇（A.R）]：V[88%甲酸]：V[水]=15：3：2 2、显色贮备液：V（0.4mol/L茚三酮-异丙醇）：V（甲酸）：V（水）=20：1：5 四、实验操作 1、点样 量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中，混匀密闭，静置。 戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。 用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上，每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过5mm。 2、层析与显色
氨基酸的薄层层析
实验2 氨基酸的薄层层析 一、目的 熟悉层析技术的一般原理，分类及应用范围。重点掌握薄层层析法的原理及操作技术，用以分离混合氨基酸中各游离氨基酸组分。了解层析技术来分离不同物质的基本原理，以及层析技术的优点。 二、原理 层析法又称色谱法、色层法或层离法，是广泛应用的一种生物化学技术。根据流动相不同分为液相层析和气相层析。 按照层析过程的机理不同，层析法分为以下几种类型： 1、吸附层析：利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。例如活性炭，硅胶等。 2、分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。 3、离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。 4、凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。例如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。 5、亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。例如酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等 按操作形式不同，层析法分为以下几种类型： 1、柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 2、纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的 目的。 3、薄层层析：薄层层析是一种微量而快速的层离方法，与纸层析方法类似。这 种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅胶涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。 本实验中用到薄层层析是一种微量而快速的层离方法。这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。本实验中硅胶作为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。 三、实验材料 1．仪器 薄层板：2.5×7.5cm（×1）、毛细管（×3）、研钵（×1）、药匙（×1）、量筒10mL （×1）、小尺子（×1）、层析缸（×1）、电吹风（×1）、喷雾器（×1）、烘箱（200℃）、铅笔。 2. 试剂 （1）1% 脯氨酸水溶液； （2）0.2%亮氨酸水溶液； （3）脯氨酸和亮氨酸的混合溶液； （4）硅胶G（C.P.,层析用）；
氨基酸薄层层析医学第二实验室
南方医科丈修生物化学实验报告 名: 学号: 专业年级: 组另1」：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心
实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声 说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理， 应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪 器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不 得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖” ，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试 管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。 任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强 酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。 实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗 干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。