吉林大学《仪器分析》第十五章 期末考试备考资料
吉大《仪器分析》第十五章质谱法
浅析气相色谱质谱法用于糖类物质结构分析的新方法
王建明
(兰州助剂厂，甘肃730070)
一、糖的结构
对糖的生理过程的理解与它的结构知识密切相关，因此糖的结构研究就直接影响着糖生物学的发展。但糖的结构相当复杂，糖类在有机体内可以单独存在，也可与配基结合成更复杂的复合体。不同的结构发挥着不的生物学功能。根据糖类分子的大小及组成，可将糖分为单糖、寡糖及多糖三大类。单糖是糖类的组成单元，单糖之间脱水形成糖普键，并以糖苷键线性或分支连接成寡糖和多糖。单糖含有多个活性不同的轻基和促使分子内成环的醛酮基，成环分子还存在构型上的差异，所以同一结构的糖链可以有很多种异构体(又称为糖形)。单糖之间有多种不同的连接方式，糖链上各种不同的分支链、糖链与配基间的不同连接等均是构成糖形的主要因素。糖类结构的多样性、复杂性和微观的不均一性给糖类的研究带来了巨大的困难，同时也使它能携带巨大的生物信息，因此对糖类结构的分析对研究糖类的构效关系具有十分重要的意义。
二、糖类结构分析的方法
长短不等的糖链，不但以寡糖和大分子多糖形式存在于自然界，而且作为蛋白、蛋白聚糖和糖脂的成分，活跃地参与许多重要的生命过程中。与其他生大分子一样，糖链的二级以上高级结构是以一级结构为基础的，不同的是，与白质或核酸大分子比起来，糖链的一级结构“含义”要丰富的多。糖链一级结构分析的一般步骤是：①分离提纯待测定的完整糖链：②对获的均一样品进行分子量测定；③糖链的糖基组成，各种单糖的分子数比例；④定各个单糖残基之问的连接次序；⑤每个单糖残基的D．或L_构型，吡喃环呋喃环形式；⑥每个糖苷链所取得d一或B．异头异构形式；⑦每个糖残基上基被取代的情况，有两个以上轻基同时被取代，则意味着这个残基处在叉状链分支点上；⑧糖链和非糖部分(肤链、脂类物质等)连接点的情况。显然，要弄清楚糖链的一级结构，不是一种技术和方法所能做到的。表1列出了糖链序列分析即一级结构测定常术方法，包括化学方法一酸水解、分析、高碘酸氧化、Smith降解等；析方法一红外光谱、气相色谱、毛泳、质谱、核磁共振等；生物学方法方法与免疫学方法等。从各种技术选择和巧妙配合中，得到来自各个信息和数据，从而构成推断糖链一的基础。
三、材料与方法
(一)试剂与仪器
岛津公司GC一2010气相色岛津公司GC—MSQP2010气相质谱联用仪；色谱柱(30erx0．25mm ×0．251xm)和色rtx一5ms(30mx0．32Mm×0．25仙mRESTEK公司产品；旋转蒸发器R为上海亚荣生化仪器厂；集热式恒磁力搅拌器DF．101S及亚循环水真空泵为郑州长城科工贸有限公司拎冻干燥LL3000购自Heto公司。
二甲亚矾(DMSO)，三甲基氯(TMS．CI)，六甲基二硅氮烷(HMD氟乙酸(TFA)均购自AlfaAesar；吡析纯)购于天津市科密欧化学试剂心；乙酸配f分析纯)购于成都市联试剂研究所；N，N一二甲基甲酞胺(D析纯)购于天津市化学试剂六厂；甲醇一将氯化钠置于三口瓶中，三连接一个导管到一个装有甲醇的试中，中间加一个干燥装置，接收氯化置需要冷却。再缓慢的将硫酸滴加产生的氯化氢溶解于甲醇溶液中。将甲醇称好重，根据滴加前后的重量得到多少毫升甲醇吸收了多少氯化后根据需要再用甲醇稀释。
(二)实验方法
1、甲基呋喃半乳糖苷合成工艺的优化
称取50mg半乳糖于50mL圆底烧瓶中，加入10mL无水氯化氢甲醇溶液，剧烈搅拌。对不同浓度的无水氯化氢甲醇，反应温度与反应时间分别进行单因素试验，定期取样O．5mL，加入过量的NaHCO3粉末中和，过滤，减压浓缩蒸干，硅醚化衍生后进行气相色谱与气质联用分析，考察反应条件对甲基呋喃半乳糖苷产率的影响。
2、甲基糖苷的部分甲基化
在优化条件下合成的甲基半乳糖苷减压蒸干后，溶于2mLDMF中，然后加入BaO(200rag)、Ba(OH)2—8H20(10arg)与碘甲烷(1mL)，暗处剧烈搅拌。每隔30min取O．5mL溶液，加入甲醇溶液中止反应，离心，上清液用TLC检测(CHCIZ：MeOH10：1)部分甲基化程度。
3、合成部分甲基化的糖醇乙酸醋衍生物
用地衣酚一硫酸显色后，选取在薄层板组分最多的溶液减压蒸干后，用2M的三氟乙酸溶液在100~C下水解2h，蒸干，得部分甲基化的半乳糖。在上述水解物中加入10 L氨水、lmL水、10mg硼氢化钠，振荡后室温下放置1．5h，使糖还原成相应的糖醇。滴入醋酸分解过量的硼氢化钠，至无气泡产生为止。溶液在60℃下减压浓缩至干。加入0．1％fv，)盐酸甲醇溶液2mL，振荡后减压蒸发至干，重复4次以除去硼酸根。将0．5mL吡啶和0．5mL乙酸配加入到上述干燥过的盛有糖残渣的反应瓶中，过夜，即得到部分甲基化的呋喃半乳糖醇乙酸酷衍生物。该混合物旋转蒸干后经三氯甲烷萃取后可直接进行气相色谱分析。
四、结论
(一)甲基化呋喃半乳糖普制备的最佳反应条件为：采用0．004mol／L的氯化氢甲醇溶液，反应温度为70~C，反应时间为4h，在此条件下合成的甲基呋喃半乳糖营得率为79．9％。
(二)采用Kuhn法合成部分甲基化的半乳糖：以甲基呋喃半乳糖苷为原料，使用DMF作为溶剂，使用BaO、Ba(OH)2-8H：O使轻基解离，甲基供体为碘甲烷。研究表明：当加入的BaO的量为200mg，Ba(OH)2_8H20 10mg，碘甲烷为lmL时，反应4h后得到的部分甲基化的糖醇乙酸酷的衍生物最多。