第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日
第九章凝胶色谱分析
凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：
1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光
散射光
图9-1光散射现象
9.1 基本原理
9.1.1凝胶渗透色谱分离原理
让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后，不同相对分子质量的物质就被区分开了，相对分子质量大的在前面流出（其淋洗时间短），相对分子质量小的在后面流出（淋洗时间长）。从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分
子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小[7]。
图9-2 不同尺寸分子通过凝胶原理图
显然，凝胶色谱法的分离是严格地建立在分子尺寸基础之上的，通常不应该在固定相上发生对试样的吸着和吸附。同时，也不应该在固定相和试样之间发生化学反应（当然，也有一些凝胶色谱填料，例如，表面磺化交联聚苯乙烯颗粒，主要是基于分子尺寸大小而进行分离的。但其表面磺化层又与被测离子之间有轻微的离子交换作用）。
图9-3 凝胶渗透色谱分离不同分子尺寸试样示意图
凝胶渗透色谱法的特点是样品的保留体积不会超过色谱柱中溶剂的总量，因而保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成色谱峰的重叠，提高了仪器的使用效率。其缺点则是柱容量较小。
通常洗脱剂分子是非常小的，它们的谱峰一般是在色谱图中最后出现（此时为0t
）。显然，各被测物质均在0t 之前被洗脱，即它们的R t 均小于0t
，这与液-液、液-固和离子交换色
谱的情况正好相反。
9.1.2 色谱柱参数及其测定方法[6]
（1） 柱参数。将凝胶色谱柱填充剂的凝胶颗粒用洗脱剂溶胀，然后与洗脱剂一起填入柱中，
此时，凝胶床层的总体积为t V
g i t V V V V ++=0 （9-1） 式（9.1）中，0V 为柱中凝胶颗粒外部溶剂体积；i V 为柱中凝胶颗粒内部吸入溶剂的体积；g
V 为凝胶颗粒骨架的体积。
t V 、0V 、i V 和g V 均称柱参数。在实验中，其数值均可以测定。
被测物质的洗脱体积
i 0e KV V V += （9-2） 式（9.2）中，K 为固定相和流动相之间的被测溶质的分配系数 i
e i
p V V V V V K 0
—=
=
（9-3） 式（9.3）中，p V 为凝胶颗粒内部溶质能进入部分的体积。
由上可见，凝胶色谱分离的过程中，没有受到任何其它吸附现象或化学反应的影响，它完全基于分子筛效应。
① 若K=0，待测分子不能进入凝胶颗粒内部；
② 若0
若将i V 用凝胶相的总体积x V 代替，且
g i x V V V += （9-4） 则有
)V -(V 000e t a x a V K V V K V +=+= （9-5） 0
t 0
e a V -V V -V K =
（9-6）
式（9.6）中，a K 、0V 和e V 都容易测定，所以在实际工作中，人们喜欢用a K 。a K 与K 之间的关系为
g
i i
a V V V K
K += （9-7）
（2） 柱参数的测定。t V 为色谱柱的内体积。a V 为完全不能浸入凝胶颗粒内部的溶质分子的洗脱体积。
例如，可以通过聚苯乙烯等高分子化合物来测定0V 和e V 。例如，测定用氘标记丙酮和己烷（GPC ）的e V ，由公式
i 0e KV V V += （9-8） 此时，K=1，所以
0-V V V e i = （9-9） 即可求得i V 。
此外
r g i S W V ?= （9-10） 式中，g W 为干燥凝胶的质量，g ；r S 为凝胶内部单位质量保留溶剂的体积，mL/g 。
9.1.3 凝胶渗透色谱法校正原理
用相对分子质量已知的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积（或淋洗时间）与相对分子质量对应关系的曲线，该线称为“校正曲线”。然而聚合物中几乎找不到单分散的标准样，所以一使用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下，做一系列的GPC 标准谱图，分别对应不同相对分子质量样品的保留时间，以lgM 对t 作图，所得曲线即为“校正曲线”。通过校正曲线，就可以从GPC 谱图上计算出各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信息。聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并不多，没有标准样的聚合物就得不到校正曲线，单独使用GPC 方法也得不到聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布信息。对于这种情况可以利用普适原理加以校正[7]。 9.1.4 普适校正原理
由于GPC 对聚合物的分离是基于分子流体力学体积而实现的，即对于具有相同分子流
体力学体积的聚合物，能在同一个保留时间流出，即它们的流体力学体积相同。[8]
依照聚合物链的等效流体力学球模型，Einstein 的黏度关系式为
[
]M NV /.52=η （9-11） 式中，[]η为特性黏数；M 为相对分子质量；V 为聚合物链等效球的流体力学体积；N 为阿伏伽德罗常数。可以用[]M η来表征聚合物的流体力学体积。
两种柔性链的流体力学体积相同：
[η]1M 1=[η]2M 2 （9-12）
式中，脚标1和2分别代表两种聚合物，把Mark-Houwink 方程
[η]=KM （9-13）
2
1
122111αα++=M k M k （9-14）
两边取对数：
lgk 1+(α1+1)lgM 1=lgk 2+(α2+1)lgM 2 （9-15）
即如果已知标准样和被测高聚物的k 、α值，就可以由已知相对分子质量的标准样品M 1标定待测样品的相对分子质量M 2。
实验证明，该法对线性和无规则团形状的高分子的普适性较好，而对长支链的高分子或棒状刚性高分子的普适性还有待研究。 9.1.5 光散射理论
[4,9]
激光照射到样品时，会在各个方向产生散射光，于是我们可以在一个角度或多个角度收集散射光的强度。
1.光散射所透露的信息
光散射强度与分子量和溶液的浓度成正比；散射光角度的变化与分子的尺寸大小相关。 1）当分子尺寸小于10nm 时，各角度散射强度相同；
2）当分子尺寸在10与30nm 之间时，散射强度随角度增大呈现直线下降的趋势； 3）当分子尺寸大于30nm 时，散射强度随角度增大呈曲线下降的趋势。 2.基本理论
通常，溶剂中分子光散射现象可用公式9-16表达：
c A P M R c K w 2*2)
(1
+=θθ （9-16） 式中：
常数 A
N dc dn n K 4
02
2
02*
λ)/(π4= （9-17） n 0是溶剂的折光指数；c 是溶液浓度；N A 是阿伏伽德罗常数；λ0为入射光波长；d n /d c 表示溶液折射率与浓度变化的比值，它表明了聚合物在溶液中的比折光指数增量；R θ是超瑞利系数；M w 是重均分子量；A 2是第二维里系数，是溶质与溶剂相互作用的量度；P (θ)是光散射强度的函数。
???++=2
θ
sin λ3π161)
(1
2
20
2
2G
r P θ （9-18） 将P 代入式（1）展开得：
c A r M R c K G w 22222θ*2]2
θ
sin λ3π161[1+???++= （9-19） 在上式中，R θ为测量值，K *c 、λ0、θ为已知值；M w 、A 2、r g 为未知值。
3.Zimm Plot
如图9-4所示，为著名的Zimm 曲线。 当θ→ 0，c→ 0，简化为
w
M R c K 1
)0(*= （9-20）
图9-4 Zimm Plot
可通过实验测定M w 值。配制不同浓度梯度的溶液，在不同的角度测量其散射光强度，绘制Zimm Plot ，求得M w ，
9.2 基本构成及其工作原理
9.2.1 GPC 系统组成
GPC 仪的组成：泵系统、（自动）进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。
1.泵系统
包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工作状况好坏直接影响着最终数据的准确性。越是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。要求流量的误差应该低于0.01 mL/min 。
2.色谱柱
色谱柱是GPC 仪分离的核心部件，在一根不锈钢空心细管中加入孔径不同的微粒作为填料。每根色谱柱都存在一定的相对分子质量分离范围和渗透极限，因此色谱柱存在使用上限和下限。色谱柱的使用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大的凝胶的尺寸还大，这时高聚物无法进入凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，达不到分离不同相对分
子质量的高聚物的目的。并且还会有堵塞凝胶孔的可能，影响色谱柱的分离效果，会降低其使用寿命。色谱柱的使用下限是当聚合物中最大尺寸的分子链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也达不到分离不同相对分子质量的目的。因此，在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择一条与聚合物相对分子质量范围相配好的色谱柱。常用色谱柱如表9-1所示。
3.填料
对填料最基本的要求是填料不能被溶剂溶解。主要有有机凝胶和无机凝胶。有机凝胶主要有：交联聚乙酸乙烯酯凝胶和交联聚苯乙烯凝胶。交联聚苯乙烯凝胶的特点是孔径分布宽，分离范围大，适用于非极性有机溶剂。三个系列柱的凝胶颗粒分别为5 um、10 um和20 um，分别用于测定低、中和超高分子量的高分子。无机凝胶主要有多孔玻璃、多孔氧化铝和改性多孔硅胶。其中改性多孔硅胶较常用，其特点是适用范围广（包括极性和非极性溶剂）、尺寸稳定性好、耐压、易更换溶剂、流动阻力小，缺点是吸附现象比聚苯乙烯凝胶严重。
4.检测系统
检测器装在凝胶渗透色谱柱的出口，样品在色谱柱中分离以后，随流动相连续地流经检测器，根据流动相中的样品浓度及样品性质可以输出一个可供观测的信号，来定量地表示被测组分含量的变化，最终得到样品组分分离的色谱图和各组分含量的信息。通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合物的检测。主要有示差折光仪检测器、紫外吸收检测器、粘度检测器。
5.示差折光仪检测器
溶剂的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的区别。
6.紫外吸收检测器
在溶质的特征吸波长附近溶剂没有强烈的吸收。
7.选择型检测器
适用于对该检测器有特殊响应的高聚物和有机化合物。有紫外、红外、荧光、电导检测器等。
9.2.2 光散射与GPC联用
图9-5为光散射仪与GPC联用示意图。由于光散射信号直接与分子量大小有关，从而可以直接测出重均绝对分子量，并且还能够获得其它许多有关的信息[10]。
图9-5 光散射与GPC联用
9.3 试验技术
9.3.1 溶剂的选择
1.GPC所适宜的溶剂
在GPC中，常用溶剂及其主要物理性质列于表9-3中，由表9-3可见，经常用于GPC 的溶剂有20多种可供选择。但有机凝胶体系，真正适用的溶剂也只有10多种。选择对试样有良好的溶解能力的溶剂，才能使试样充分溶解，变成具有一定浓度的真溶液，这种均匀透明的分散体系，才有可能实现GPC柱的良好分离。特别对高聚物，由于溶解过程比小分子物质要缓慢，一般需要十几小时、几天甚至几个星期。
表9-3 凝胶渗透色谱常用溶剂的物理性质
溶剂密度
g/ml
沸点
℃
运动粘度
20℃，mm2/s
折光指数
20
D
n
无紫外吸收下限
nm
四氢呋喃0.8892 66 0.51(25℃) 1.4070 220 1,2,4-三氯苯 1.4634 213 1.89(25℃) 1.5717 - 邻二氯苯 1.306 180.5 1.26 1.5516 - 苯0.879 80.1 0.652 1.5005 280 甲苯0.866 110.6 0.59 1.4969 285 N,N-二甲基甲酰胺0.9445 153 0.90 1.4280 295 环己烷0.779 80.7 0.98 1.4262 220 三氯乙烷- 73.9 1.2 1.4797 225 二氧六环 1.036 101.3 1.438 1.4221 220 二氯乙烷 1.257 84 0.84 1.4443 225 间二甲苯0.8676 139.1 0.86 1.4972 290 氯仿 1.489 61.7 0.58 1.4476 245 间甲酚 1.034 202.8 20.8 1.544 - 二甲基亚砜- 189 - 1.4770 - 甲醇0.7868 64.5 0.5506 1.3286 - 水 1.0000 100 1.00 1.3333 - 过氯乙烯 1.623 121 0.90 1.505 - 四氯化碳 1.595 76.8 0.969 1.4607 265 邻氯代苯酚 1.265 175.6 4.11 1.5473(40℃) - 三氟乙醇 1.3823 73.6 1.20(38℃) 1.291 - 二氯甲烷 1.335 40.0 0.440 1.4237 220 己烷0.6594 68.7 0.326 1.3749 210 对二氯苯 1.306 180 1.26 1.5515 - 甲基吡咯烷0.819 202 1.65 1.47 -
1-甲基萘 - 235.0 - 1.618 - 三氯乙烯
1.460
87.19
0.566
1.476
-
2.溶剂的选择规律
由于高聚物结构十分复杂，具体表现在： ① 分子量大并多有分散性；
② 高分子的形状有线形的、支化的和交联的； ③ 高分子的聚集态有非晶态和晶态结构。
特别是晶态高聚物，溶剂分子较难渗入，溶解困难，可采用升高温度的方法使其溶解。例如，高密度聚乙烯的熔点是135℃，它在十氢奈中要在135℃才能很好溶解；全同立构聚丙烯在四氢萘中，也要135℃才能很好溶解。极性晶态高聚物，一般在室温就能溶解在极性溶剂中。例如聚酰胺可溶于甲苯酚、40％硫酸、苯酚-冰醋酸的混合溶剂中；聚对苯二甲酸乙二酯可溶于邻氯苯酚和重量比为1：1的苯酚-四氯乙烷的混合溶剂中；聚乙烯醇可溶于水、乙醇等。
鉴于上述原因，在选择对高聚物溶解的良溶剂时，应遵循以下几个原则进行： 1) “极性相近”原则
极性相近原则是人们长期研究小分子物质溶解时总结出来的，即：溶质和溶剂的极性越相近，二者越易互溶。这种“极性相近”的溶解规律，在一定程度上也适用于高聚物-溶剂体系。例如未硫化的天然橡胶是非极性的，可很好地溶解于汽油、苯、甲苯等非极性溶剂中；聚苯乙烯可溶于非极性的苯或乙苯中，也可溶于弱极性的丁酮等溶剂；聚丙烯腈是极性的，可溶于二甲基甲酰胺、四氢呋喃、卤代烷等极性溶剂中。
2) “内聚能密度或溶度参数(δ)相近”原则 由聚合物溶解过程的热力学分析知道，只有当高聚物与溶剂的内聚能密度或溶度参数接近或相等时，溶解过程才能进行。一般说来，当
21-δδ>1.7-2.0时，高聚物就不溶。因此，
从溶剂和高聚物的内聚能密度或密度参数，可以判定溶剂的溶解能力。
高聚物的溶度参数，除了用实验方法直接测定外，也可从高聚物的结构式利用下式作近似估算：
02M E =∑ρδ （9.21）
式（9.21）中E 为高聚物分子的结构单元中不同基团或原子的摩尔(mol)吸引常数，ρ为高聚物的密度，M 0为结构单元的分子量。
3) 高分子-溶剂相互作用参数X 1小于1/2的原则
从高分子溶液热力学理论的推导，高分子-溶剂相互作用参数X 1的数值可作为溶剂良劣的一个半定量的判据。如果X 1小于1/2，则说明高聚物能溶解在所给定的溶剂中，数值越小，则溶剂的溶解能力越好；如果X 1大于1/2，则高聚物一般不能溶解。因此，X 1值偏差1/2的大小可作为判定溶剂溶解能力的依据。
总而言之，高聚物溶剂的选择，目前还没有一个统一的规律可循，所以在实际工作中碰到这类问题时，要具体分析高聚物是结晶的还是非结晶的；是极性的还是非极性的；分子量大还是分子量小等，然后试用上述几个经验规律来选择适宜的溶剂。
3.溶剂的选择
GPC所使用的溶剂要求对试样溶解性能好，并能溶解多种高聚物、低粘度、高沸点、无毒性、且能很好地润湿凝胶但又不溶解色谱柱中的凝胶、与凝胶不起化学反应，经济易得等。
此外，GPC要求溶剂的纯度较高，溶剂纯度还与检测器的灵敏度有关，检测器越灵敏，则要求溶剂纯度越高。下面就GPC对所需溶剂选择的详细内容和要求加以讨论。
1) GPC溶剂选择的标准
GPC法与其它色谱方法不同之处是，不是用改变流动相溶剂组成的方法来控制分离度。因此，GPC溶剂的选择比其它液相色谱方法较为简单，又因为大多数凝胶均没有表面活性所具有的吸附作用，所以流动相溶剂的吸附作用可不予考虑。GPC常用的某些溶剂的性质及其对某些高聚物的溶解性能列于表9-4。从表9-4可以看出四氢呋喃能溶解的高聚物很多，并且它的折光指数很小，粘度也小，波长在220nm以上紫外吸收不很显著，故可同时适用于示差折光检测器与紫外吸收检测器。
表9-4 GPC常用溶剂的某些性质及其对高聚物的溶解性能
溶剂
沸
点℃
折光
指数
25
D
n
操作
温度
℃
能溶解的高聚物
四氢呋
喃66 1.4040 25-50
聚l-丁烯，丁基橡胶，醋酸纤维素，顺式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，
未固化环氧树脂，聚丙烯酸乙酯，异腈酸酯，三聚氰胺塑料，甲基丙烯
酸甲酯-苯乙烯共聚物，苯酚甲醛树脂，聚丁二烯，聚碳酸酯，聚电解
质，聚酯(非线性和不饱和)，多核芳香烃，聚苯乙烯，聚砜，聚醋酸，
乙烯酯，聚醋酸乙烯酯共聚物，聚乙烯醇缩丁醛，聚氯乙烯，聚乙烯基
甲基醚，丁腈橡胶，丁苯橡胶，硅橡胶，苯乙烯-异戊二烯共聚物，聚
乙二醇，聚溴乙烯，聚异戊二烯，天然橡胶，聚甲基丙烯酸甲酯，苯乙
烯-丙烯腈共聚物，聚氨酯预聚体
苯80.1 1.5011
20
D
n
聚l-丁烯，丁基橡胶，顺式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，未固化环氧树
脂，聚丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，聚丁二烯，聚醚，
聚异丁烯，聚异丁烯共聚物，聚异戊二烯，多核芳香烃，聚苯乙烯，丙
烯-1-丁烯共聚物，丁基橡胶，丁腈橡胶，天然橡胶，丁苯橡胶，硅橡
胶，氯丁橡胶，聚乙烯醇缩甲醛
甲苯110 1.4941 80 聚l-丁烯，丁基橡胶，顺式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，未固化环氧树脂，聚丙烯酸乙酯，甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，聚丁二烯，聚醚，聚异丁烯，聚异丁烯共聚物，聚异戊二烯，多核芳香烃，聚苯乙烯，丙烯-1-丁烯共聚物，丁基橡胶，丁腈橡胶，天然橡胶，丁苯橡胶，硅橡
胶，氯丁橡胶，聚乙烯醇缩甲醛
二甲基甲酰胺153 1.4269 60-80
醋酸纤维素，硝酸纤维素，异氰酸酯，聚醚，聚氧乙烯，多核芳香烃，
聚苯乙烯，聚氨酯，聚醋酸乙烯酯，聚乙烯醇缩丁醛，聚氟乙烯，聚碳
酸酯，聚乙烯基甲基醚，苯乙烯-丙烯腈共聚物，聚氨酯预聚体，氯乙
烯-醋酸乙烯酯共聚物
邻二氯
180 1.5515
聚l-丁烯，丁基橡胶，顺式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，聚丙烯酸乙酯，
20D n
烯酸甲酯-苯乙烯共聚物，聚丁二烯，聚碳酸酯，多核芳香烃，聚苯乙烯，聚醋酸乙烯酯，聚醋酸乙烯酯共聚物，丙烯-1-丁烯共聚物，丁基橡胶，丁腈橡胶，天然橡胶，丁苯橡胶，硅橡胶，聚乙烯，聚丙烯
二氯甲烷 40
1.4443
20D
n
主要适用于聚碳酸酯及聚二甲基硅氧烷，多核芳香烃，聚苯乙烯，聚氨
酯
三氯甲烷
61.7
1.446
20D n
主要适用于氯丁橡胶及硅橡胶
1,2,4-三氯苯
213
1.517
135
聚l-丁烯，丁基橡胶，顺式聚丁二烯，聚二甲基硅氧烷，聚丙烯酸乙酯，
聚乙烯-醋酸乙烯酯共聚物，三聚氰胺塑料，聚丁二烯，聚碳酸酯，不
饱和聚酯，聚乙烯（支化），聚乙烯，多核芳香烃，聚苯醚，聚丙烯，聚苯乙烯，聚醋酸乙烯，酯共聚物，聚氯乙烯，丙烯-1-丁烯共聚物，
丁基橡胶，丁腈橡胶，天然橡胶，丁苯橡胶，硅橡胶
水 100
1.333
20D n
葡萄糖，聚电解质，聚乙烯醇
四氢萘
135
聚烯烃
流动相溶剂的选择除了考虑对试样有良好的溶解性外，还应考虑到对色谱仪材料有无腐
蚀性和对凝胶填料有无损害的问题。在凝胶渗透色谱仪中凡接触溶剂的零部件均是用不锈钢制成的。因此，能腐蚀不锈钢的溶剂均不能使用，溶剂中不能含游离的氯离子，在溶剂贮存过程中也不允许逐渐分解出氯离子。水相GPC 控制pH 值用的卤素盐类化合物也会腐蚀不锈钢部件，应尽可能地采用硫酸盐和磷酸盐缓冲液来代替卤素盐。但是，应注意当溶剂成分或电解质的浓度发生改变时，作为电解质的盐的某些分子大小也会发生变化。
溶剂与检测器的匹配也是十分重要的问题，如果使用示差折光检测器近行检测时，所选溶剂的折光指数应与被测试样的折光指数有尽可能大的差别，这样可以给出较大的检测信号，则可在较低的灵敏度挡下，得到基线平稳的响应值；反之，若所选溶剂的折光指数接近被测试样的折光指数时，则需要提高检测器灵敏度方能得到较大的检测响应值。而提高检测器灵敏度的结果往往导致噪声增加，基线不稳，给实验测定结果带来大的偏差。表9-5给出了一些常见聚合物的折光指数，由于一般高聚物的折光指数多在1.4～1.6之间。所以，最经常用的溶剂应该是具有较小折光指数，其中四氢呋喃由于满足上述要求，是GPC 有机凝胶体系应用最为广泛的溶剂之一。
如果用紫外分光光度计作检测器时，所选择的溶剂应在测定波长上没有吸收或吸收极少，即在所选波长是“透明”的。同时要求溶剂在贮存时也不能分解出具有紫外吸收的化合物。表9-6列举了部分常用溶剂紫外吸收特征波长。由表9-6可见，对于在紫外区有强烈吸收的苯系芳香烃溶剂，应考虑用通用检测器检测的可能性。
在GPC实验中，配样所用的溶剂应与流动相溶剂尽可能地保持一致。也就是说，用于溶解试样的溶剂应取自GPC仪的流动相溶剂，否则谱图可能会因杂质的折光指数比溶剂的折光指数大或小而出现正负杂质峰，造成检测或定量测定方面的困难。
实验所选用溶剂的粘度应尽可能地低，因为粘度的高低直接影响和限制扩散作用，在一定线速度下，色谱柱的压降正比于溶剂的粘度。当溶剂的粘度增加两倍时，分离所需要的时间也相应增加两倍。同时高粘度溶剂需要较高的色谱传质能力，造成柱压相应增高，试样的传质扩散速度小，不利于传质平衡，将会降低色谱的分离度。如果由于被测试样只能在一些高粘度的溶剂中溶解时，可以适当提高测试温度，以达到降低溶剂粘度的目的。但是溶剂的粘度也不宜过低，过低粘度的溶剂往往沸点较低。易造成色谱系统接口的泄露，有时甚至在色谱柱或泵中产生气泡，干扰实验结果。
2) GPC更换溶剂须知
为了避免更换不同批号和性质的溶剂而引起的示差折光检测器的基线漂移，一般都采用大容量的溶剂贮瓶，这样有利于溶剂的均一性。此外为了整个色谱系统能被所换溶剂置换填充完全，需要一定量的溶剂冲洗色谱系统及柱子，冲洗时应采用较大流量为宜，例如对参比池可先用5 mL/min流速冲洗5 min-8 min后，再以2 mL/min的流速冲洗10 min即可。色谱柱的冲洗平衡费时较长，一般若以2 mL/min或1 mL/min的流量冲洗，达平衡尚需2h-3h 的时间。
更换不同溶剂有可能引起标定曲线的变化是个值得注意的问题，对于填装刚性凝胶的柱子影响不大，但对半刚性凝胶柱就有所不问。因此色谱柱的溶剂一旦被更换后应该重新用标定标样或其它校正方法来标定色谱柱，并用新的标定曲线来计算聚合物的分子量分布。
3) 常用溶剂的毒性及与凝胶填料的适应性
GPC常用的溶剂大都具有一定的毒性，并且都是易燃易爆的有机化合物。长期接触这些溶剂会对人体各器官的健康带来危害，特别象苯、四氢呋喃、氯苯等有机溶剂，对人的皮肤、肝、肺及视觉器官均产生有害的影响。这就要求从事GPC工作的人员应特别注意，加
强安全防护措施。表9-7汇总了常用的GPC溶剂的性质，具体使用时应十分谨慎小心，以防不安全事故的发生。
9.3.2 激光光散射与凝胶色谱仪联用
传统的光散射法只能确定平均分子量，旋转半径及第二维里系数，而GPC又受泵流速的限制，再加上寻找与待测物结构相似的标准品不易，对低浓度高分子量的部分不敏感。而多角度激光光散射仪(MALLS)与GPC结合，通过相互补充，不仅能直接测得绝对分子量，而且还可以对样品的组成，从低浓度高分子量到高浓度低分子量，都能解析的很清楚，更可以得到许多有用的信息，如分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量，分子的形状，分枝状况，聚集态及动力学参数，反应速率等，其功能与应用普及性正与日俱增。
图9-6 18角度激光光散射仪-DAWN HELEO
实验室使用的是多角度激光光散射仪（MALLS）与凝胶色谱（GPC）联用系统，如图
9-6所示，型号规格：18角度激光光散射仪-DAWN HELEO，由美国Wyatt公司和美国Waters 公司生产。主要性能参数：OPTILAB rEX 示差检测器（dn/dc仪）和Waters 515单元泵各一套，分子量范围：103-107（与GPC联机实验），均方根旋转半径：10-500nm（典型范围），可测量分子量和分子量分布、均方根旋转半径分布、构象及枝化等。主要技术特点：无需标样和做校正曲线，直接获得绝对分子量（重均分子量）及其分布，构象和枝化等数据，操作简便，信息量大，是对高分子表征的最先进方法和手段之一。
实验操作步骤如下：
(1)、样品的制备和处理
称取适量样品，溶解在合适的溶剂中，以容量瓶定容，配成一定浓度的稀溶液，高速离心后取上清液，经0.2～0.45μm的尼龙微孔膜过滤，备用。
(2)、色谱分析条件
18角度激光光散射仪-DAWN HELEO，OPTILAB rEX 示差检测器（dn/dc仪），凝胶柱Shodex804，光源气体氦气和氖气。选定合适的流动相（如四氢呋喃，色谱纯），流速（如1mL/min），色谱柱温（如30℃），定量环(如50～200μL)，试样溶液浓度（如20～60mg·mL-1），选定合适的波长。
(3)、具体步骤
①根据所作实验需要认真配制样品；
②开机后，不论单机还是联机测试，都要对仪器进行充分清洗平衡，打开泵的电源，自检通过后，以0.1mL/min的起始流速，每1～2分钟提高0.1mL的速度，将流速调整至实验流速；
③打开HELEOS的电源，3～4分钟后通过自检，自动进入实验界面，用泵或注射器将溶剂注入仪器，基线冲洗成一条直线（噪音在最佳状态下一般小于十万分之5V），即可开始实验；
④示差OPTILAB rEX，在清洗平衡过程中，要打开PURGE，充分清洗参比和样品池；清洗过程中不时打开、关上PURGE，赶出气泡，然后关上PURGE，回零（ZERO）即可开始实验；
⑤如做GPC联机实验，在软件设置好前，将进样阀扳至LOAD状态；
⑥在软件中选择正确的试验模版，设置参数，点击RUN，开始实验；
⑦采集、处理数据；
⑧充分清洗仪器；
⑨将流速以0.1mL/1～2min的速率下调至0；
⑩关机。
9.3.3 实验要求及注意事项
1.实验要求
①对于样品处理、溶解要严格按照要求完成。
②样品和溶剂都要严格过滤。
激光光散射实验中必须对样品严格除尘，溶液中的灰尘会产生强烈的光散射，严重干扰聚合物溶液光散射的测量。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应进行精馏，并经过0.20 μm～0.45 μm超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.20 μm～0.45 μm的超滤膜过滤。另外，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水强力冲洗。
③示差结构特殊，不要忘记打开PURGE冲洗。
④替换溶剂要注意溶剂之间的互溶性。
⑤泵流速升降一定要慢，否则会造成柱子的损坏。柱子为耗材，不在保修范围之内。
⑥做单机实验最好选择进口滤头，国产滤头易破，会造成管路堵塞。
2.测量角度
在低角度的时候，有杂质所产生的噪音信号干扰会很大，如图9-7所示，所以只取低角度，加上九十度两个角度，其误差就会相对很大；若只取九十度则只能求得分子量，无法测得旋转半径，所以最起码要加上一组高角度来修正，则误差会小很多。
图9.7 杂质较多的GPC层析图
实验室仪器mini DAWN TREOS如图9-8所示，在与入射光成45度、90度、135度角配置三组光电二极管检测器，同时检测不同角度的光散射强度，而激光经由样品槽的毛细管通道，样品槽为石英材质。
图9-8 三个检测角度
如果要增加测量角度，可以如DAWN HELEOS在样品槽的两侧以不对称的方式增加检测器的数目，如图9-9所示可高达18个角度之多。
图9.9 十八角度检测器
9.4 应用
9.4.1 高分子聚合物特性
图9-10和图9-11显示高分子混合物经分离后MALLS及RI的洗脱体积对照图。由图中可以看出RI 对大分子量浓度低的物质较不敏感，而对低分子量高浓度者较敏感。
图9-10 由ASTRA软件得到的miniDAWN（上）和Optilab示差检测器（下）信号
1、BSA：67000，64300±700，1%；
2、溶解酵素：14300，14,600±300，1%；
3、缓激肽：1060，1090±10，2%；
4、亮氨酸脑啡肽：556，592±6，3%
图9-11 分子量对洗脱体积图
9.4.2 蛋白质及其聚合体
在各种工业应用中，测定蛋白质的绝对特性不仅严格而且必要，例如在生化工程应用上，以蛋白质为基质的产品必须很纯而且无任何聚集存在。而测定蛋白质的分子量和是否有聚集态存在，光散射法是最理想的工具之一。
以往，在水相中用低角度光散射测量法（LALLS）受到溶剂中不纯的物质干扰相当大。而MALLS 的多角度测量大大降低了背景噪音的干扰，并能提供完整的信息和良好的重现性结果。图9-13显
示蛋白质混合物的MALLS 和RI 的信号。样品在0.1M NaCl 中含0.05M 的磷酸盐缓冲液中进行RI 为Wyatt Optilab 903，流速为0.1mL/min ,色谱柱为Shodex KW-803 和KW-804。虽然此样品为标准样品，但MALLS 仍很清楚地检测到聚集现象，此现象在RI 几乎无法辨认。
图9-13 蛋白质洗脱体积及聚集体信号图
9.4.3 分枝
高分子聚合物的分枝程度和分布是影响其物理和化学性质的一个重要因素。采用多角度激光光散射系统（MALLS ）与GPC 系统联用是唯一决定分枝系数g M 的方法。虽然也有一些其他确定分枝的方法，但是都不够直接且需要众多假设及“虚拟因子”。
由传统的RI 或Viscometer （粘度检测器）测定的高枝化分子的分子量与绝对值有很大的差别，若欲做有效的色谱柱校正，则需以一系列与待测物成分相同的标准品作校正。若标准样品与待测物的成分或组分不同，则会产生很大的误差。例如分子量相同的球形高分子的洗脱时间比无规则线团状分子要长。
图9-14为由MALLS 测得的分枝状和长链形的高分子（PS ）的旋转半径和分子量对照图。可看出，虽然其分子量相同，但分布明显不同。图9-15为r g 对 Mw 做图，可以看出样品（藻酸钠）在辐射后分子构型的变化。
图9-14 PS 线形与枝化分子的对照图
图9-15 旋转半径对分子量图（分子构型图）
9.4.4 动力学/反应速率
使用MALLS，可研究抗原-抗体反应，反应发生时就可决定聚集粒子的大小。当改变温度，浓度或催化剂时，MALLS可记录下反应发生时，分子的特殊变化。
图9-16 浓度变化对蛋白聚集的影响
使用DAWN 检测器研究了浓度对分子量为75 KD单分子蛋白质聚集作用的影响。图9-16描述了这种特殊蛋白质从30 ug/mL到1 mg/mL范围内得到的浓度相关性。如图所示，该蛋白质在低浓度作为单一分子而在浓度大于700 ug/mL时聚集为六聚体。该结果与由gluteraldehyde高度交联技术所得结果完全相符。
9.4.5 低分子量的测定
DAWN HELEOS或mini DAWN TREOS的固定光电二极管检测器可以捕捉到很微弱的光散射信号，使得分子量的测定成为可能。使用DAWN 系列标准配制的任何一款激光器，都可以轻易地测量分子量低于2000D的聚合物，并具有相当的准确性。
由于DAWN HELEOS 或mini DAWN TREOS具有三个以上的多角度同时捕捉散射信号的能力，即使极微弱的信号，如只比背景值略高的低分子量样品所散射出的信号也可以从不同的角度去捕捉，累计在一起就可以计算出相当准确的结果。这是单角度或者两角度检测器所无法做到的。
GPC凝胶渗透色谱理论和应用
GPC、NMR测定超支化聚合物理论及运用 GPC凝胶渗透色谱 凝胶渗透色谱自20世纪60年代问世以来，在高聚物分子量及分子量分布测试中得到了广泛的应用。以往有关GPC在聚丙烯腈共聚物分析方面的工作，一般采用普适校正法[ ]和渐进法[2]对凝胶色谱柱进行校正。普适校正法和渐进法需要一系列的标样，而聚丙烯腈的标样系列很难得到。如果制备聚丙烯腈共聚物标样则需要耗费大量的时间和精力。宽分布校正法[卜I]可以采用单一宽分布标样对色谱柱进行标定，这种方法在分析难以制备标样的共聚物时，显示出很大的优越性。Purdon[6]认为，宽分布校正法只有在标样与待测样品分子量相近时结果较为准确，而标样与待测样品分子量相差较大时结果误差很大。在本试验中应用宽分布校正法时，比较了扣除色谱峰扩展效应前后的测试结果，数据表明，在应用宽分布校正法校正色谱柱时，必须扣除色谱峰扩展效应的影响才能得到较为准确的结果。Purdon的测试结果不准确，是因为没有扣除色谱峰扩展效应。本法在生产线上聚丙烯腈分子量监测中得到了实际应用，结果满意。 GPC凝胶渗透色谱（缩写：Gel Permeation Chromatog-raphy ），又称为尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography,简称SEC），它是基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，用来分离相对分子质量较小的物质，并且还可以分析分子体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物。 凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography、GPC)1964年，由J.C.Moore首先研究成功。不仅可用于小分子物质的分离和鉴定，而且可以用来分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物。
凝胶色谱法
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同 的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗 粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在 凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过 程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分 子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后 流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大， 完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应 的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变 凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子， 在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而 分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小
第九章凝胶渗透色谱讲解
凝胶色谱分析二〇一一年九月九日
第九章凝胶色谱分析 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]： 1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。 近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。 入射光 散射光 图9-1光散射现象 9.1 基本原理 9.1.1凝胶渗透色谱分离原理 让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后，不同相对分子质量的物质就被区分开了，相对分子质量大的在前面流出（其淋洗时间短），相对分子质量小的在后面流出（淋洗时间长）。从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分
J2 Scientific GPC凝胶渗透色谱操作指导
J2 Scientific GPC凝胶渗透色谱操作指南 应用部分 在您阅读本指南之前，最好先熟悉仪器的操作，并已经掌握<软件中文操作手册>中的内容。本指南旨在帮助新用户掌握仪器的维护，方法建立及简单的故障排除，北京绿绵巨贸科贸有限公司对此指南保留全部权力，任何未经允许的复制、转载及其他以赢利为目的的商业行为均构成对本公司的侵权。 凝胶渗透色谱原理简介 Accuprep系统结构及工作框图 注意事项 如何建立适合我的应用的方法 GPC柱的维护和重新装填 如何备份数据 常见故障分析
凝胶渗透色谱原理简介 凝胶渗透色谱，简称GPC，是一项比较传统的分离技术，GPC的柱子由化学惰性的中空小球组成，利用空间排阻的原理对样品进行分离，详见下图： 小分子通过填料“球”中的孔大分子不能从孔中通过 由于小分子化合物会从填料的孔中穿过，而大分子从填料周围的空间穿过，会造成小分子与大分子之间的行程差距，这样大分子与小分子会先后从柱中馏出，起到分离的作用。由于这一分离技术不受样品极性的影响，所以对于色谱用户来说，是一种非常有效解决色谱柱不能分开的样品的手段，尤其是对于脂肪类，蛋白及色素类大分子干扰物，这些物质对于色谱柱，进样口来说非常危险，而在生物源样品当中的含量一般又比较高，那么在进行样品分析之前进行一步GPC净化就显得非常必要了。
Accuprep 系统结构及工作框图 Accuprerp TM 是由美国J2 Scientific 公司生产的凝胶渗透样品净化系统，早在上世纪80年代就引入中国，目前其产品型号主要有手动AccuPrepJr 和自动AccuPrep 两种，在2005年该公司又推出了新型的Accuprerp TM MPS 系统，体积进一步小型化，并能整合计算机及在线浓缩，SPE 等多种技术，更加趋于成熟。由于目前大家采购这一仪器主要是为了提高效率，本指南将重点放在对自动仪器的介绍方面。 一台完整的GPC 系统包括几个部分：触摸屏，控制模块，输送泵，检测器，自动进样器和软件部分。 让我们先来认识一下仪器各部分： AccuPrep MPS 自动系统 Accuprerp TM 自动系统 Accuprerp TM 手动系统 AccuPrep MPS +AccuVap GPC 在线浓缩系统
凝胶渗透色谱(GPC)的原理及在样品前处理中的应用
体积排阻色谱SEC在样品前处理中，有着独特的作用，今天小编就带您一起探寻一下GPC 的原理，以及它在样品前处理中的出色应用，一起来学习吧！ 1.定义 体积排阻色谱法（Size exclusion chromatography，SEC）是利用多孔凝胶固定相的独特特性，而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法，它又称为空间排阻色谱法（Steric exclusion chromatography）。 2.分类 流动相：水；凝胶过滤色谱（GFC） 流动相：有机相；凝胶渗透色谱（GPC） 3.固定相 填料：多孔凝胶（软性凝胶和刚性凝胶）； 特点1：表面分布大小不一的小孔（如图） 特点2：凝胶颗粒间存在空隙 4.分离 特点1： 化合物按照分子量大小，分为小分子，中等分子、大分子。
小分子：能通过小孔、中孔、大孔、空隙； 中等分子：能通过中孔、大孔、空隙； 大分子：被排阻在外，只能通过填料空隙。 特点2： 分子量越小，越能通过更多不同的孔径的孔，分子量越大，只能通过一些较大孔径的孔，分子量足够大完全被排斥在外，而不能通过孔，只能通过填料间的空隙。 特点3： 能通过的孔越多，所走的距离越长，出峰越慢；能通过的孔越少，所走的距离越短出峰越快。 5.原理 基于分配理论：
6.确定分子量大小 如同色谱质谱的定量分析一样，通过标准曲线法来定量未知样品的分析物质的浓度。在GPC 中组分从柱中的洗脱体积（Ve）与分子量（M）存在对应关系lgM- Ve，我们可先通过配置好的已知分子量的化合物分子，进样后，在凝胶柱上存在对应的洗脱体积，来配制标准曲线，在相同色谱条件下，未知的物的分子量，可以通过其洗脱体积，在准曲线上找到对应的分子量。 A: 分子量为106，对应洗脱体积为V0 B：分子量为103 , 对应洗脱体积为V0+V P X: 未知物，对应的洗脱体积为V x，可求得其分子量大小 7.两个极限 极限一：排阻极限 如果要分离的物质，分子量足够大，比填料的最大孔径都大，所有分子都将被排斥。 极限二：渗透极限 如果要分离的物质，分子量足够小，比填料的最小孔径都小，所有分子都被渗透。
凝胶渗透色谱法
实验6 凝胶渗透色谱法 测定聚合物的分子量和分子量分布 聚合物分子量具有多分散性，即聚合物的分子量存在分布。不同的聚合方法、聚合工艺会使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。分子量对聚合物的性能有十分密切的关系，而分子量分布的影响也不可忽视。当今高分子材料已向高性能化发展，类似分子量分布等高一层次的高分子结构的问题，越来越引起人们的重视。 自高分子材料问世以来，人们不断探索分子量分布的测定方法，直到60年代凝胶渗透色谱诞生，成为迄今为止最有效的分子量分布的测定方法。 一．实验目的 1.了解凝胶渗透色谱的原理； 2.了解凝胶渗透色谱的仪器构造和凝胶渗透色谱的实验技术； 3.测定聚苯乙烯样品的分子量分布。 二．实验原理 凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）也称为体积排除色谱（Size Exclusion Chromatography，简称SEC）是一种液体（液相）色谱。和各种类型的色谱一样，GPC/SEC的作用也是分离，其分离对象是同一聚合物种不同分子量的高分子组份。当样品中不同分子量的各组份的分子量和含量被确定后，就可得到聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。 一般认为，GPC/SEC是根据溶质体积的大小，在色谱中由于体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。 凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、
葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。由于微孔尺寸与高分子的体积相当，高分子的渗透几率取决于高分子的体积，体积越小渗透几率越大，随着淋洗液流动，它在色谱中走过的路程就越长，用色谱术语就是淋洗体积或保留体积增大。反之，高分子体积增大，淋洗体积减小，因而达到依高分子体积进行分离的目的。基于这种分离机理，GPC/SEC 的淋洗体积是有极限的。当高分子体积增大到已完全不能向微孔渗透，淋洗体积趋于最小值，为固定相微球在色谱中的粒间体积。反之，当高分子体积减小到对微孔的渗透几率达到最大时，淋洗体积趋于最大值，为固定相微孔的总体积与粒间体积之和，因此只有高分子的体积居于两者之间，色谱才会有良好的分离作用。对一般色谱分辨率和分离效率的评定指标，在凝胶色谱中也沿用。 图16－1是GPC/SEC 的构造示意图，淋洗液通过输液泵成为流速恒定的流动相，进入紧密装填多孔性微球的色谱柱，中间经过一个可将样品送往体系的进样装置。聚合物样品进样后，淋洗液带动溶液样品进入色谱柱并开始分离，随着淋洗液的不断洗提，被分离的高分子组份陆续从色谱柱中淋出。浓度检测器不断检测淋洗液中高分子组份的浓度响应，数据被记录最后得到一张完整的GPC/SEC 淋洗曲线。如图16－2。 图16－1 GPC/SEC 的构造 淋洗曲线表示GPC/SEC 对聚合物样品依高分子体积进行分离的结果，并不是分子量分布曲线。实验证明淋洗体积和聚合物分子量有如下关系： e BV A M ?=ln 或 e V B A M log ''log ?= （16－1） 式中M 为高分子组分的分子量，A 、B （或A’、B’）与高分子链结构、支化以及溶剂温度等影响高分子在溶液中的体积的因素有关，也与色谱的固定相、体积和操作条件等仪器因素有关，因此（1）式称为GPC/SEC 的标定（校正）关系。（1）式的适用性还限制在色谱固定相渗透极限以内，也就是说分子量过高或太低都会使标定关系偏离线
凝胶渗透色谱法
凝胶渗透色谱法（GPC） 一、凝胶渗透色谱 凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。 柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。 图1 GPC分离原理 不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。 二、测定原理 凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各
种分子流体力学提及的不同进行分离的。比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。（见图2） 图2 GPC淋出曲线 溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。 凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。 三、分子量校正曲线（LogM-V曲线） 凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数
凝胶渗透色谱概述
1. 凝胶渗透色谱的简单回顾 凝胶渗透色谱[GPC（Gel Permeation Chromatography）][也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。Mc Bain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。1959年Porath和Flodin 用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。 2. 凝胶渗透色谱的应用 三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。另外，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的绝对分子量检测器（如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。 凝胶渗透色谱作为一门新兴的科学，随着各种新型检测器的出现（如UV、FT-IR、LS、Viscometer等），它的应用范围也逐步从生物化学、高分子化学、无机化学等向其它领域渗透，成为化学领域内必不可少的分析手段。 二、凝胶渗透色谱的基本概念 1. 凝胶渗透色谱的分离机理 目前关于凝胶渗透色谱的分离机理存在着以下几种基本理论：1.立体排斥理论； 2.有限扩散理论； 3.流动分离理论。除上述理论外，尚有分子热力学理论和二次排斥理论等。由于应用立体排斥理论解释凝胶渗透色谱中的各种分离现象与事实比较一致，因此立体排斥理论已为人们普遍采用。即：它的分离基础主要依据溶液中分子体积（流体力学体积）的大小来进行分离。 凝胶渗透色谱的分离过程是在装有多孔物质为填料的色谱柱中进行的，一个填料
多角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术
多角度激光光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术 仪器组成： Wyatt DAWN HELEOS Ⅱ（十八角度激光光散射检测器） Wyatt ViscoStar Ⅱ(粘度检测器) Wyatt Optilab rEX （示差折光检测器） 配一套Waters 515单元泵和柱温箱。 检测原理： 光散射法是测定高分子物质重均分子量的绝对方法。高分子溶液可视为不均匀介质，当光通过它时，入射光的电磁波诱导高分子成为振荡偶极子，并产生强迫振动作为二次光源发出散射光。高分子溶液的散射光强度远远高于其溶剂，并且强烈依赖于高分子的分子量、链形态、溶液浓度、散射光角度和折光指数增量（dn/dc值）等基本参数，从而得到高分子物质的绝对分子量。 凝胶渗透色谱可将溶剂中的高分子物质按照分子量的大小依次洗脱出来。利用光散射仪与凝胶渗透色谱联用技术，除了可以得到物质的平均分子量，还可以测得不同的高分子物质的分布及其相应分子量大小，并且不需要使用结构相似的标准样品做标准曲线。在直接测定
高分子物质的绝对分子量的同时，由于联用了粘度检测器和示差折光检测器，还可得到特性粘数、均方根旋转半径等重要参数。 应用： 光散射强度与分子大小直接相关，凝胶渗透色谱能分离不同分子量大小的高分子物质，结合次两种特性，可得到许多重要信息，已经被广泛应用于高分子化学、生物化学等众多研究领域。 第一，高分子物质的分子量的测定。不需要标准品、校正曲线以及任何假设，即可直接求得高聚物、多糖、蛋白质等多种高分子物质的绝对分子量。测定范围广泛，可达103～107，且采用十八角度激光光散射检测器，准确度高。 第二，多组分高分子物质的平均分子量及其相应组分对应的绝对分子量的测定。不仅可以单机操作测定混合物质的平均分子量，还可结合凝胶渗透色谱分离技术，测定各个分子量不同的各个不同组分的绝对分子量。 第三，高分子物质的折光指数增量（dn/dc值）、均方根旋转半径（Rg）、第二维里系数（A2）等重要参数和重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）等多种不同分子量的测定，可得到分子的分枝程度等形态特征，研究高分子物质与溶剂的相互作用，研究高分子物质的聚合与降解作用等。 具体检测工作： 第一，化学品、药品的合成过程中的质量控制，通过测定分子量的变化，控制反应的进程与方向，确定药品的含量品质。例如，以某一高聚物为母体，在其上进行聚合反应，通过分子量的测定，控制反应的进行程度。 第二，食品生产过程中的质量控制。通过测定分子量的变化，控制反应的进程与方向，确定食品的品质。例如，在高蛋白牛奶中的蛋白质的分子量，当蛋白质过大时是不利于人体吸收的，通过测定其分子量，对食品的品质进行鉴定。 第三，医疗器材材料的降解聚合作用的研究。例如，聚乳酸被广泛应用于心血管支架、假牙的医学材料中，在医疗器材申报的过程中要求对其降解作用进行研究。 标准： 1、GB/T 21864-2008 聚苯乙烯的平均分子量和分子量分布的检测标准方法高效体积排 阻色谱法 2、GB/T 21863-2008 凝胶渗透色谱法(GPC) 用四氢呋喃做淋洗液 3、SH/T 1759-2007 用凝胶渗透色谱法测定溶液聚合物分子量分布
凝胶渗透色谱分析的工作原理
SEC/GPC 凝胶渗透色谱分析的工作原理 PS-OBG 用作尺寸排除色谱（size exclusion chromatography ，又称凝胶渗透，gel permeation chromatography ）测量大分子分子量时的标准样品。 首先介绍尺寸排除色谱（SEC/GPC ）的工作原理： 如图三所示，红色和紫色两种颗粒代表不同尺寸的两种高分子，蓝色月牙形颗粒代表色谱柱内的填料。通常色谱柱填料是经过设计的具有不同孔径的高分子凝胶珠。当红色和紫色的高分子进入色谱柱以后，以一定速度流动的流动相在不停地冲洗色谱柱的同时，带动高分子颗粒在色谱柱内的移动。当高分子与凝胶珠填料接触时，尺寸大的高分子不能进入凝胶珠填料的孔，如图三中红色的大分子。所以红色的大分子在流动相的冲洗下先流出色谱柱。而紫色的尺寸较小的高分子可以进入凝胶填料珠的小孔，好像暂时被填料保留住了一样，最后由于流动相不停的冲洗，紫色高分子也会流出色谱柱，但是流出的时间较红色分子长了很多。图三右下方给出红色高分子和紫色高分子的凝胶色谱图，横坐标为保留时间，可以看出红色高分子的保留时间明显小于紫色高分子，这说明红色高分子分子量较大，比紫色高分子先流出色谱柱。 色谱柱的工作原理告诉我们，尺寸排除色谱可以将尺寸不同的高分子按照保留时间分开。保留时间越小的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越短的高分子）的分子量越大，相反，保留时间越大的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越长的高分子）的分子量越小。
懂得了这个原理，我们就可以用SEC/GPC来测分子量了！ 但是，如何根据保留时间来确定高分子的分子量呢？也就是说，怎么将不同的保留时间与分子量一一对应起来呢？这时我们需要制定一条标准工作曲线。标准工作曲线的目的是建立保留时间和分子量的关系，当我们用SEC/GPC测定了一个未知的高分子，得到这个高分子的流出时间（保留时间），有了工作曲线，我们就可以很快知道这个未知高分子的分子量。 标准工作曲线的制定 标准工作曲线由一系列分布很窄，分子量已知的高分子标样做出，同时标样的结构和分子链的构象要与未知高分子尽可能的接近。 1．首先选用与被测样品类型相似的单分散性(d≤1.1)标样。先用其他方法精确测定其绝对分子量（百特纯使用激光光散射的方法测得PS-OBG的绝对分子量）。 2．然后将PS-OBG标样进行SEC/GPC分析，得到每个窄分布标样的峰位淋洗体积(V e),也就是每个标样在色谱柱内的保留时间 流速。 3．以V e为X轴，logM为Y轴作图，这样就可以得到校正曲线。 式中,A,B为常数，A表示排斥极限, B表示渗透极限4．将待测高分子进行SEC/GPC分析，得到待测高分子的峰位淋洗体积V’。 在标准曲线上将V’推回Y轴得到logM’，此M’即为待测高分子的分子量。 百特纯大分子（武汉）科技有限公司是由供职于加拿大联邦政府农业部国家实验室科学家及其他投资人共同创办。目前主要从事碳水化合物大分子领域新品研发及应用。百特纯的目标是向高等研究单位、院校提供高质量、高纯度、高均一性（极窄分子量分布），特定结构的医药及功能性碳水化合物大分子标准品及凝胶色谱标样,燕麦葡聚糖标样,1%精制燕麦OBG水溶液。
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱 凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography、GPC)) 1964年，由J.C.Moore首先研究成功。不仅可用于小分子物质的分离和鉴定，而且可以用来分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物。(聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开） [编辑本段] 1.基本原理 1.1.分离原理： 让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙 （较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进 入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在 后面（即淋洗时间长）。自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。 当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。 （1） 体积排除 （2）限性扩散 （3） 流动分离 1.2.校正原理： 用已知相对分子质量的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质量对应关系曲 线，该线称为“校正曲线”。聚合物中几乎找不到单分散的标准样，一般用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下，做一系列的GPC标准谱图，对应不同相对分 子质量样品的保留时间，以lgM对t作图，所得曲线即为“校正曲线”。通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信 息。聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并不多，没有标准样的聚合物就不可能有校正曲线，使用GPC方法也不可能得到聚合物的相对分子质量和相对分子质量 分布。对于这种可以使用普适校正原理。 1.2.1.普适校正原理:由于GPC对聚合物的分离是基于分子流体力学体积，即对于相同的分子流体力学体积，在同一个保留时间流出，即流体力学体积相同。 两种柔性链的流体力学体积相同： [η]1M1=[η]2M2
凝胶渗透色谱正确选择检测器的重要性
凝胶渗透色谱正确选择检测器的重要性 作者：Stephen Ball, 马尔文仪器纳米颗粒及分子表征产品市场经理 凝胶渗透色谱分析法或尺寸排除色谱法（GPC/SEC）是高分子、大分子和蛋白质常用的主要分析手段，其中最主要的原因是它能对分子量和分子量分布数据进行定量表征。人们通常将上述分析方法分 为两步。第一步：利用含有适当特性微孔填充材料的色谱柱对溶解样品按照分子大小/体积进行分离；第二步：利用适当的检测仪器对被分离的样品进行分析。本文中，来自马尔文仪器的产品市场经理Stephen Ball将向您阐述可以采用的检测器技术及其提高分析效率的潜在可能。 GPC/SEC系统的传统配置为：采用单个折光指数 (RI) 检测器对浓度进行测量，在这种配置下，利用 参照校准数据可以得到相对分子量分布数据。这对某些常见的高分子材料和/或质量控制比较适合， 但分析者越来越多地倾向于采用具有如下特点的多检测仪组合GPC/SEC 系统： ?无需色谱柱校准即可取得所有材料的绝对数据， ?极大提高数据处理效果 目前市面上有很多可用于GPC/SEC的检测仪。由于分析具有两阶段的特性，因此在选择合适的系统 时有很多问题需要考虑。完全一体化的单一检测器固然有优势，但我认为它与选择最佳检测仪组合解 决方案相比只能说是次优方案。对检测器的选择进行优化是一种既直接又高效的方法，具有较多优势，比如可以仅通过一次实验就获得能确定分子量、流体力学尺寸和分子结构的表征。 这就提出了一个问题：如何才能为以应用为基础发掘最佳的检测器系统？这个问题牵涉很广，但却为 我们初步了解不同检测器的优势提供了一个良好的契机。 首先从粘度计开始，它可以测量各种粘度参数，而对于聚合物溶液而言，它可以建立起与样品分子量 之间的关联。当与RI检测器一同使用时，粘度计可以实现普氏校准，系统无需再寻找与待测样品十 分接近的标准样品，同时也提高了分子量分布数据的完整性。粘度测量还可以确定结构方面的信息， 比如可以对聚合物分支进行定量分析。 接下来让我们来看看静态光散射检测器，它们可以对绝对分子量进行直接测量。由于市场上存在着各 种不同的检测仪，如LALS、RALS和 MALS，因此问题就开始变得复杂了。上述所有这些检测仪都 通过测量散射光的能量来得到分子量，但散射光能量随角度各不相同，比如，小角度光散射检测仪(LALS) 以7o的角度检测入射光线，直角光散射 (RALS) 以90o测量入射光线，此外还有多角度测量 光散射仪 (MALS)。
凝胶渗透色谱简介
凝胶渗透色谱简介 1. 凝胶渗透色谱的简单回顾 凝胶渗透色谱[GPC（Gel Permeation Chromatography）][也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。Mc Bain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。1959年Porath和Flodin用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。 2. 凝胶渗透色谱的应用 三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。另外，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的绝对分子量检测器（如：LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。 凝胶渗透色谱作为一门新兴的科学，随着各种新型检测器的出现（如UV、FT-IR、LS、Viscometer等），它的应用范围也逐步从生物化学、高分子化学、无机化学等向其它领域渗透，成为化学领域内必不可少的分析手段。 二、凝胶渗透色谱的基本概念 1. 凝胶渗透色谱的分离机理 目前关于凝胶渗透色谱的分离机理存在着以下几种基本理论：1.立体排斥理论；2.有限扩散理论；3.流动分离理论。除上述理论外，尚有分子热力学理论和二次排斥理论等。由于应用立体排斥理论解释凝胶渗透色谱中的各种分离现象与事实比较一致，因此立体排斥理论已为人们普遍采用。即：它的分离基础主要依据溶液中分子体积（流体力学体积）的大小来进行分离。 凝胶渗透色谱的分离过程是在装有多孔物质为填料的色谱柱中进行的，一个填料的颗料含有许多不同尺寸的小孔（这些小孔具有一定的分布），这些小孔对于溶剂分子来说是很大的，它们可以自由地扩散出入。由于高聚物在溶液中以无规线团的形式存在，且高分子线团也具有一定的尺寸，当填料上的孔洞尺寸与高分子线团的尺寸相当时，高分子线团就向孔洞内部扩散。显然，尺寸大的高聚物分子，由于只能扩散到尺寸大的孔洞中，在色谱柱中保留的时间就短；而尺寸小的高聚物分子，几乎能够扩散到填料的所有的孔洞中，向孔内扩散的较深，在色谱柱中保留的时间就长。因此，不同分子量的高聚物分子就按分子量从大到小的次序随
Waters-1515-2414-凝胶渗透色谱(GPC)操作规程
Waters 1515-2414 凝胶渗透色谱（GPC）操作规程 一、溶剂和样品准备 1. 选择溶剂：尝试和选择对聚合物具有良好溶解性的THF或者DMF 作为溶剂； 2. 溶剂处理：采用溶剂过滤系统（真空抽滤）对色谱纯溶剂进行过滤和脱气处理； 3. 样品配制：选用处理后的溶剂配置待测样品溶液，样品体积≥4mL；样品浓度根据估算的分子量确定（Mw＝103～104，浓度为1.5～2mg/mL；Mw＝104～105，浓度为1～1.5mg/mL；Mw＝105～5 x 105，浓度为0.5～1mg/mL；Mw ＝5 x 105～106，浓度为0.1～0.5mg/mL；Mw＞106，浓度为0.05～ 0.1mg/mL）； 4. 样品溶解：提供足够时间使聚合物完全溶解（一般在室温下静止过夜）；注：可轻微摇动样品以促进溶解但不可剧烈摇动； 5. 样品过滤：样品溶解后，采用一次性微孔滤膜（孔径0.22μm）对样品溶液进行过滤，保存滤液待用； 注意：每个样品需要准备两个样品瓶（分别用于溶解样品和放置过滤后的溶液）和两个注射器（分别用于过滤和进样） 二、仪器启动 1. 将经过真空抽滤的溶剂倒入溶剂存贮瓶中； 2. 依次打开稳压电源－计算机－泵－柱温箱－示差折光检测器开关； 3. 启动Breeze软件，输入用户名Breeze；选择1515-2414系统，确定；
4. 在Breeze软件系统中点击运行样品－点击流量图标设置泵流速0.2mL/min，注意：设置变化时间为2min，即以0.1mL/min缓慢增加流速，使色谱柱所受压力缓慢变化； 5. 在示差折光检测器面板上，点击Temp oC设置温度40 oC （set/control）；再点击Home－Shift 1－显示Purge图标；此时示差检测器为Purge流路，冲洗示差检测器的样品池及参比池；点击平衡系统/监视基线图标－调用PS-purge方法－点击平衡/监视器，监控基线；Purge时间为10h； 6. 10h后（此时基线已稳定），在运行样品界面点击设置泵流速1mL/min（设置变化时间8min，以0.1mL/min缓慢增加流速），平衡0.5h； 7. 在示差折光检测器面板上，点击Shift 1，取消Purge（回到正常测样流路），平衡3～5min；再依次点击Diag－Optimize LED(16~17正常) －Enter－Home； 三、样品测试 1. 点击Breeze软件系统中的单进样图标－输入待测样品名－选择功能（宽分布进样）－选择方法组PS－输入进样体积（20μL）及样品测试时间（45min）－点击单进样，准备进样；此时窗口显示等待进样； 2. 选用1mL注射器，安装色谱专用平头针头，采用过滤后样品溶液润洗进样注射器后，再抽取过滤后的样品溶液；将针口朝上排出气泡（注意针头不要有液珠，否则会污染进样口，必要时用镜头纸擦拭）；将进样阀门拨到Inject位置（即垂直状态），将进样注射器插入进样器内并插到底（不用过于用劲），进样；进样结束后迅速将进样阀门拨到Load位置；此时窗口显示进样正在运行；注意：进样结束后，使用抽滤后的溶剂及时清洗针头； 3. 到设定的运行时间后，仪器自动停止数据采集，此时窗口显示单进样结束；20min后，按步骤1和2进下一个样品；
凝胶渗透色谱
凝胶渗透色谱 1. 凝胶渗透色谱的简单回顾 凝胶渗透色谱[GPC（Gel Permeation Chromatography）][也称作体积排斥色谱(Size Exclusion Chromatography)]是三十年前才发展起来的一种新型液相色谱，是色谱中较新的分离技术之一。利用多孔性物质按分子体积大小进行分离，在六十年前就已有报道。Mc Bain用人造沸石成功地分离了气体和低分子量的有机化合物，1953年Wheaton和Bauman用离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质。1959年Porath和Flodin用交联的缩聚葡糖制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品。而对于有机溶剂体系的凝胶渗透色谱来说，首先需要解决的是制备出适用于有机溶剂的凝胶。二十世纪60年代J.C.Moore在总结了前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。 2. 凝胶渗透色谱的应用 三十多年来，凝胶渗透色谱的理论、实验技术和仪器的性能等方面有了突飞猛进的发展。尤其是随着新型柱填料的诞生、高效填充柱的出现(目前其理论塔板数已超过10000/米)以及计算机的普及，凝胶渗透色谱在工业、农业、医药、卫生、国防、宇航以及日常生活的各个领域得到了广泛的应用。特别是近年来，随着各种高分子材料的问世，人们对高分子科学的不断探索，高聚物的分子量及其分布的测定显得尤为重要，成为科研和生产中不可缺少的测试项目之一。例如：常见的聚苯乙烯塑料制品，其分子量为十几万，如果聚苯乙烯的分子量低至几千，就不能成型；相反，当分子量大到几百万，甚至几千万，它又难以加工，失去了实用意义。科研和生产上通过控制高聚物的分子量及其分布宽度指数D(D=Mw/Mn)、分子量微分分布曲线、分子量积分分布曲线来生产出性能最佳的高聚物产品。另外，除了快速测定分子量及其分布以外，凝胶渗透色谱还广泛用于研究高聚物的支化度，共聚物的组成分布及高聚物中微量添加剂的分析等方面。如果配以在线的绝对分子量检测器（如：LALLS、 Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶渗透色谱可以测定高聚物的绝对分子量。 凝胶渗透色谱作为一门新兴的科学，随着各种新型检测器的出现（如UV、FT-IR、LS、Viscometer等），它的应用范围也逐步从生物化学、高分子化学、无机化学等向其它领域渗透，成为化学领域内必不可少的分析手段。 二、凝胶渗透色谱的基本概念 1. 凝胶渗透色谱的分离机理 目前关于凝胶渗透色谱的分离机理存在着以下几种基本理论：1.立体排斥理论；2.有限扩散理论；3.流动分离理论。除上述理论外，尚有分子热力学理论和二次排斥理论等。由于应用立体排斥理论解释凝胶渗透色谱中的各种分离现象与事实比较一致，因此立体排斥理论已为人们普遍采用。即：它的分离基础主要依据溶液中分子体积（流体力学体积）的大小来进行分离。 凝胶渗透色谱的分离过程是在装有多孔物质为填料的色谱柱中进行的，一个填料的颗料含有许多不同尺寸的小孔（这些小孔具有一定的分布），这些小孔对于溶剂分子来说是很大的，它们可以自由地扩散出入。由于高聚物在溶液中以无规线团的形式存在，且高分子线团也具有一定的尺寸，当填料上的孔洞尺寸与高分子线团的尺寸相当时，高分子线团就向孔洞内部扩散。显然，尺寸大的高聚物分子，由于只能扩散到尺寸大的孔洞中，在色谱柱中保留的时间就短；而尺寸小的高聚物分子，几乎能够扩散到填料的所有的孔洞中，向孔内扩散的较深，
凝胶渗透色谱法测定聚合物的分子量分布
凝胶渗透色谱法测定聚合物的分子量分布合成聚合物一般是由不同分子量的同系物组成的混合物，具有两个特点：分子量大和同系物的分子量具有多分散性。目前在表示某一聚合物分子量时一般同时给出其平均分子量和分子量分布。分子量分布是指聚合物中各同系物的含量与其分子量间的关系，可以用聚合物的分子量分布曲线来描述。聚合物的物理性能与其分子量和分子量分布密切相关，因此对聚合物的分子量和分子量分布进行测定具有重要的科学和实际意义。同时，由于聚合物的分子量和分子量分布是有聚合过程的机理所决定，通过聚合物的分子量和分子量分布与聚合时间的关系可以研究聚合机理和聚合动力学。测定聚合物分子量的方法有多种，如粘度法、端基分析法、超离心沉降法、动态/静态光散射法和凝胶色谱法（GPC)对等；测定聚合物分子量分布的方法主要有三种： (1)利用聚合物溶解度的分子量依赖性，将试样分成分子量不同的级分，从而得到试样的分子量分布，例如沉淀分级法和梯度淋洗分级法。 (2)利用聚合物分子链在溶液中的分子运动性质得出分子量分布．例如：超速离心沉降法。 (3)利用聚合物体积的分子量依赖性得到分子量分布，例如：体积排除色谱法（或称为凝胶色谱法）。 凝胶色谱法具有快速、精确、重复性好等优点，目前成为科研和工业生产领域测定聚合物分子量和分子量分布的主要方法。 一、实验目的和要求 1、了解凝胶渗透色谱的测量原理，初步掌握GPC的进样、淋洗、接收、检测等操作技术。 2、掌握分子量分布曲线的分析方法，得到样品的数均分子量、重均分子量和多分散性指数。 二、实验装置与原理 1、分离机理 GPC是液相色谱的一个分支，其分离部件是一个以多孔性凝胶作为载体的色谱柱，凝胶的表面与部含有大量彼此贯穿的大小不等的空洞。色谱柱总面积Vt由载体骨架体积Vg、载体部孔洞体积Vi和载体粒间体积V0组成。GPC的分离机理通常用“空间排斥效应”解释。待测聚合物试样以一定速度流经充满溶剂的色谱柱，溶质分子向填料孔洞渗透，渗透几率与