(完整word版)高效液相色谱在蛋白质分离中的应用
高效液相色谱在蛋白质分离中的应用
蛋白质是一种长链高分子化合物，相对分子量大，在溶液中扩散系数大，易变性，者增加了普通方式分离蛋白质的困难。高效液相色谱在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备高速、高效、高灵敏度的特点。已被广泛应用于分离蛋白质。
蛋白质在物理、化学及功能上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。根据蛋白质的大小、电荷、疏水性等特性，可以选择不同模式来分离目标蛋白。
反向高效液相色谱在高效液相色谱中应用广泛。由于反相高效液相色谱固相载体的疏水性，它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离。疏水性弱的样品，分子和固定相间的作用弱，因而较快流出。在反相液相色谱中，蛋白质分子在通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠，使得蛋白质分子内部某些疏水残基暴露，并与固定相相互作用。这是反相液相色谱在蛋白质分离中的一个有力因素。同时蛋白质有一个特殊的保留机制，这是由吸附机制与分配机制共同作用的结果。在蛋白质的分离中，初始洗脱条件下洗脱液中有机成分的浓度较低，分子与固定相疏水作用强，几乎完全被固定相吸附；而一旦洗脱液中有机成分达到特定浓度，使得蛋白质与固定相的作用小于它与流动相间的相互作用时，分子完全从固定相上洗脱。正是由于蛋白质的这种特殊的保留机制，洗脱液成分极微小的改变就会大大影响蛋白质的保留行为从而保证蛋白质得以完全分离。蛋白质通常是强极性的化合物，与碳十八色谱柱结合较困难。另外，反相液相色谱常用的流动相，如甲醇、乙腈等都能使蛋白质变性沉积而使色谱柱报废。因此，在反相液相色谱用于蛋白质分离时，一般使用低pH流动相，室温或较高温度以及使用乙腈或异丙醇作为有机部分，三氟乙酸作为流动相添加剂。
离子交换色谱是最早被用于蛋白质分离的一种方法。离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。因为离子交换色谱要求分离样品具有带电性质的差异。而蛋白质等电点的差异，以及在不同pH值溶液中带电性质会发生变化的特性，使得用离子交换色谱分离蛋白质成为可能。离子交换色谱又可分为阴离子和阳离子交换色谱。大多数蛋白质在pH值为6到8时，带负电荷，因此用阴离子交换色谱来分离，如人乳或牛乳中的骨桥蛋白。对于一些等电点较高的蛋白质，如乳铁蛋白，则采用阳离子交换色谱更为有效。在选择离子交换剂时，聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。其中离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）和CM-纤维素（羧甲基纤维素）最常用，它们在生物大分子物质（蛋白质，酶，核酸等）的分离方面显示很大的优越性。一是它具有开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多；二是它具有亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。三是它的回收率高。所以离子交换纤维素已成为蛋白质分离中非常重要的一类离子交换剂。
生物素和亲和素
生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 15M,
洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力,这样可以在较温和的条件下将其从avidin上洗脱下来。另外,可以利用生物素和亲和素间的高亲和力,将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用,通过生物素与亲和素的亲和力,胰岛素就被固定在琼脂糖上,
可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBr活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂(如生物素与NHS生成的酯)作用结合上生物素,并且不改变其生物活性,这使得生物素和
亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。
3.维生素、激素和结合转运蛋白
通常结合蛋白含量很低,如1000升人血浆中只含有20毫克Vit -7-10-B12结合蛋白,
用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力(解离常数为10 16M)而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强,所以洗脱时可能需要较强烈的条件,另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。
4.激素和受体蛋白
激素的受体蛋白属于膜蛋白,利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质,难
于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力(10 6-10? 12M)而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白,如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。
5.凝集素和糖蛋白
-D-甲基葡萄糖苷洗脱。同样,用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。a-D-甲基甘露糖苷或a-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白,麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨
基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合,可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物,就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。如洗脱伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用a-D-吡喃甘露糖苷或a凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白,几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖,因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。
6.辅酶
核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子,利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶,包括AMP、c AMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛,可以用于分离各种激酶和脱氢酶。
7.多核苷酸和核酸
利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离各种RNA、RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。
8.氨基酸
固定化氨基酸是多用途的介质,通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力,或者通过氨基酸
的疏水性等性质,可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如L-精氨酸可以用于分离羧肽酶, L-赖氨酸则广泛的应用于分离各种rRNA。
9.染料配体
结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料Cibacron Blue F3GA是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与NAD+相似的空间结构,所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有亲和力,可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有Procion Red HE3B等。染料作
为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用,使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。
10.分离病毒、细胞
利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用,亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞,胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强,所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如Pharmacia公司生产的Sepharose 6MB,颗粒大、非特异性吸附小,适合用于细胞亲和层析。
。亲和色谱法的基本过程是： 1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和性）。2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来