存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达解析
存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞
的表达
[ 08-03-08 14:15:00 ] 编辑：studa20
作者：朱雄鹏，陈志哲，林旭，胡建达，李纯团，杨婷，许贞书，吕璐璐，陈彩平，张浪辉
【摘要】本研究旨在构建含有人存活蛋白（survivin）基因的重组腺病毒载体，并探讨其在转染树突状细胞中的表达。以质粒pcDNA3.0-survivin为模板，通过PCR 扩增获得survivin基因全长序列。PCR产物回收后经酶切，定向插入腺病毒穿梭质粒，获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。通过双酶
切、PCR及插入片段测序鉴定后，将正确重组体pShuttle-CMV-survivin 转化E.coli BJ5183 菌（含腺病毒骨架质粒）并进行同源重组，然后筛选阳性克隆，提取质粒，将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化，用脂质体LipofectamineTM 2000介导转染293 细胞。制备病毒上清并测定其滴度，将病毒上清转染树突状细胞，应用Western blot方法分析survivin的表达。结果表明：成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒，病毒滴度为：
2.65×109pfu/ml。Western blot鉴定显示，经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。结论：含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功，为下一
步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。
【关键词】腺病毒载体；存活蛋白基因；树突状细胞
Construction of Recombinant Adenovirus Vector Containing Human Survivin Gene and Its Expression in Dentritic Cells
Abstract The study was aimed to construct the recombinant adenovirus vectors containing human survivin gene，
and to investigate their expression
in transfected dentritic cells. Full length cDNA encoding survivin was obtained by PCR amplification from plasmid pcDNA3.0-survivin. The PCR product was restricted，and then inserted into pShuttle-CMV. The plasmids of pShuttle-CMV-survivin were
linearized with PmeⅠ，and the fragment containing survivin
was ligated with pShuttle-CMV and transfected into E.coli BJ5183. After homologous recombination in bacteria，the extracted plasmid from the positive bacteria were linearized with PacⅠ，transfected into HEK293 cells with liposome LipofectamineTM 2000. Then，
the harvested adenovirus supernatants were transfected
into dendritic cells. The results showed that the recombinant adenovirus-survivin was constructed successfully and its titer was about 2.65×109 pfu/ ml. The expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. It is
concluded that the recombinant adenovirus vector containing human survivin was constructed successfully，which may provide preliminary laboratory evidence for anti-leukemia immunotherapy.
Key words adenovirus vector; survivin gene; dendritic cell
重组腺病毒载体具有宿主细胞范围广、高转移效率、高滴度和高表达等优点，是目前基因治疗研究中应用最为广泛的载体之一［1-3］。存活蛋白（survivin）基因是肿瘤组织较为特异的基因，因而其编码蛋白survivin成为肿瘤较理想的靶抗原之一。为开展树突状细胞(DC)介导的抗白血病免疫治疗，我们采用一种新的细菌内同源重组制备重组腺病毒的AdEasyTM XL系统，构建了survivin基因重组腺病毒，制备了高滴度的病毒上清，并感染人树突状细胞，为下一步开展DC瘤苗治疗研究提供实验基础。
材料和方法
材料
质粒pcDNA 3.0-survivin由第四军医大学西京医院儿科、全军优生优育研究所成胜权副教授惠赠；浓缩白细胞由省血液中心提供； AdEasyTM XL腺病毒系统为Stratagene公司产品；高保真DNA聚合酶为Invitrogen公司产品；普通Taq酶为晶美公司产品；内切酶KpnⅠ、HindⅢ、PmeⅠ、PacⅠ、T4连接酶为BioLabs产品；纯化试剂盒、小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于中科开瑞公司；质脂体、低熔点琼脂糖为Invitrogen公司产品； PCR纯化试剂盒、β-半乳糖苷酶检测试剂盒为Stratagene公司产品；总蛋白裂解酶、蛋白酶抑制剂为美国Pierce公司产品；兔抗人Survivin多克隆抗体为北京中杉生物技术公司产品；辣根标记山羊抗兔IgG、Western-Blotting lunimol试剂为Santa Cruz公司产品。
引物设计
根据GenBank中survivin mRNA的系列BC034148及腺病毒穿梭载体（pShuttle-CMV vector）的酶切位点（Kpn1和HindⅢ）分别设计了引物，F：5’-CGGGGTACCATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，R：5’-CCCAAGCTTTCAATCCATGGCAGCCAG-3’。
目的片段的获得
以pcDNA3.0-survivin为模板，用合成的引物作PCR扩增，体系为25
μl，其中含10 ×buffer 2.5 μl，dNTP (10 mmol/L) 0.5 μl，模板质粒0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，Taq 酶0.1 μl。热循环程序为: 94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，30 个循环后，72 ℃再延伸7分钟，4 ℃保存。取10 μl PCR反应液在1%琼脂糖中进行电泳。然后采用的纯化试剂盒，按照说明书对PCR产物进行纯化。
穿梭载体的构建
用Kpn1和HindⅢ两种内切酶对survivin纯化产物和pShuttle-CMV vector进行酶切，将得到的酶切产物用凝胶回收试剂盒进行回收。利用小牛肠碱性磷酸酶对载体酶切片段进行磷酸化处理，得到的产物片段survivin和载体，用T4 DNA连接酶在4℃条件下进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，并通过带有卡那霉素（50 μg/ml）的LB平板筛选出带有重组质粒的细菌。然后以菌液为模板，用腺病毒载体通用引物进行扩增以筛选出带有目的片段的细菌，用小量抽提试剂盒抽提质粒得到重组质粒（pShuttle-CMV-survivin），送泰京公司测序。
腺病毒表达载体的构建
同源重组
将带有正确目的片段的穿梭载体（pShuttle-CMV-survivin）和对照质粒（pShuttle-CMV）分别用Pme1进行线性化，然后从凝胶中回收，并用来分别转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（已含有病毒质粒AdEasy-Vector）。用加卡那霉素（50 μg/ml）的LB平板筛选带有同源重组质粒的E.coli BJ5183，抽提质粒，Pac1酶切鉴定。同源重组成功的质粒，用腺病毒通用引物进行PCR扩增，以确定重组质粒是否带有目的片段。之后用大抽质粒试剂盒HiSpeedTM Plasmid Purification kit，分别从含有同源重组质粒（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV）的菌液进行大量质粒抽提，以备转染293细胞包装病毒时用。
腺病毒的包装
取同源重组质粒5 μg，用3 μl的内切酶Pac1进行线性化，然后用PCR 纯化试剂盒进行纯化，将纯化产物利用质脂体LipofectamineTM 2000进行转染汇合度达到70%的293细胞。到第8天时，细胞大部分飘浮。用滴管把剩下贴壁的细胞吹起，收集细胞，离心，弃掉上清，加入1 ml PBS，重悬细胞，然后移到1.5 ml EP管中。在-70℃冰箱与37℃水浴反复冻融细胞4次，12 000×g 离心10分钟，收集上清，即为原代病毒上清（Ad-CMV-survivin、Ad-CMV），置-70℃冰箱中保存。
腺病毒的扩增、滴度测定
将得到的原代病毒上清转染汇合度为70%的293细胞，按以上方法收集病毒。然后再将得到的病毒上清转染两瓶50 cm2 T形瓶、汇合度为70%的293细胞，利用空斑测定法对收集的病毒上清进行滴度测定，最后放置-70℃冰箱中保存。
腺病毒介导survivin在DC的表达
DC的诱导
利用淋巴细胞分离液从浓缩白细胞中分离出单个核细胞，利用贴壁法得到单核细胞，加入生长因子GM-CSF、IL-4到培养液中混合培养，浓度皆为1 000 U/ml，隔天半换液，并补充生长因子。到第7天加入TNF-α，使其终浓度达50 ng/ml，到第9天收集细胞。
外源基因survivin蛋白表达的Western blot鉴定
在DC培养到第7天加入TNF-α的同时，按MOI为100分别用腺病毒Ad-CMV-survivin、Ad-CMV感染DC。第9天收集转染及未转染Ad-SVV(survivin)病毒的DC，加入总蛋白裂解酶100 μl和蛋白酶抑制剂1 μl，冰浴30分钟，4℃，13 000×g，离心10分钟。取上清直接于凝胶加样孔内，进行电泳（浓缩胶60 V，1小时；分离胶100 V，2小时）。当电泳即将结束时，从电泳槽上取下凝胶，将NC膜放于凝胶上方，滤纸放在NC膜上，置入转膜装置中，120 mA 稳流转移2-3小时。转膜结束后，将膜置封闭液中，用封闭液1∶1 000稀释特异性兔抗人存活蛋白（survivin）抗体。将膜从封闭液中取出，置于抗体稀释液内，4℃振荡杂交过夜。用封闭液稀释酶标二抗；将膜置于稀释的酶标二抗中，室温振荡反应30-60分钟；浸入新鲜配制的显色液中，于暗处显色10-30分钟；显色完全后用大量双蒸水洗涤以终止反应。
结果
目的基因的获得
通过PCR反应，从pcDNA3.0-SVV质粒中扩增的SVV基因片段，其长度为445 bp。
重组质粒pShuttle-CMV-survivin 的鉴定
PCR鉴定
分别以重组质粒pShuttle-CMV-survivin为模板，用合成的腺病毒穿梭载体通用引物进行PCR扩增，得到大约588 bp的目的片段，产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图1。
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建
EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表 达载体的构建 【摘要】目的构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A(LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重组腺病毒表达载体。方法逆转录聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3 的DNA 序列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack CMV 质粒上，在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy1的同源重组，构建融合基因Z2A真核表达载体pAd Z2A。经抗生素培养板筛选重组体，然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd Z2A。结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb 两条DNA条带，测序鉴定结果表明序列正确；从感染重组腺病毒vAd Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体，为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。 【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A 基因BZLF1 基因融合表达载体 ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct Z2A recombinant adenovirus vector and study the effect of Z2A expression on EBV associated tumor. MethodsBoth LMP2A and BZLF1 cDNA were cloned from B958 cell line by RT PCR, and the fusion gene (LMP2A linker BZLF1) was
腺病毒载体的构建-体外连接法快速高效构建表达
体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体 作者：王家宁, 王传成郭凌郧, 黄永章 [摘要] 目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法: PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb 的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl 密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果: PCR扩增可见312 bp特异性条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论: 体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。 [关键词] 体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠ Abstract: Objective To construct recombinant adenoviral v ector expressing β-galactosidase by in vitro ligation and provide a basis for construction of recombinant adenovirus vector expressing therapeutic gene of interest.Methods pShuttle2-LacZ was digested with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰand 4.6 Kb fragment of LacZ gene expression cassette was recovered .This fragment was ligated to predigested Adeno-X viral DNA with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ. The ligated product was digested with Swa Ⅰ.The resultant DNA was transformed into E. Coli. DH5α.The correct recombinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,was identified by PCR and PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰdigestion. The Pac I-digested, linearized pAdeno-X-LacZ was transfected into AD293 cells by Lipofectamine. Recombinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. HVSMC was infected with Adeno-X-LacZ. X-gal staining was performed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There was a specific band of 312bp when pAdeno-X-LacZ was amplified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ was packaged successfully within AD293 cells and the expression of β-galactosidase gene in HVSMC. Conclusion In vitro ligation is a simple, rapid and efficient method for constructing recombinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of recombinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by recombinant adenovirus. K ey words: In vitro ligation; Adenovirus; β-galactosidase; PI-Sce Ⅰ; I-Ceu Ⅰ
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版)
合同编号：YT-FS-4484-56 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书 (完整版) Clarify Each Clause Under The Cooperation Framework, And Formulate It According To The Agreement Reached By The Parties Through Consensus, Which Is Legally Binding On The Parties. 互惠互利共同繁荣 Mutual Benefit And Common Prosperity
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书(完整版) 备注：该合同书文本主要阐明合作框架下每个条款，并根据当事人一致协商达成协议，同时也明确各方的权利和义务，对当事人具有法律约束力而制定。文档可根据实际情况进行修改和使用。 服务方（甲方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______ e-mail：_____ 开户银行：_____ 帐号：______ 委托方（乙方）：_____ 地址：______ 邮编：______ 电话：______ 传真：______
甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称 甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_____腺病毒，腺病毒滴度_____pfu/ml。 第二条费用及价格（人民币） 1．病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买； 2．合同总价_____元，（大写）_____。 第三条乙方责任 1．乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利（直接或间接）为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2．未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） 1、目的及适用范围 该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。 2、主要仪器及试剂 电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿 3、操作步骤 3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。 3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。 3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。 3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。 3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。 3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。 3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。 3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。 3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。电泳检测酶切是否完全。 3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。 3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。 3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB 101
pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT
腺病毒载体疫苗
什么是腺病毒载体疫苗 腺病毒载体疫苗是指以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，使用能表达保护性抗原基因的重组腺病毒制成的疫苗。 腺病毒载体疫苗特点 研究发现，携带各种抗原的腺病毒载体能刺激机体产生很强的体液免疫或细胞免疫。此外，由于腺病毒载体能感染呼吸道和肠道细胞，可以方便地通过黏膜进行免疫，并能诱导机体产生黏膜和系统免疫应答。 腺病毒载体疫苗的临床研究 1、腺病毒载体诱导的天然免疫反应 腺病毒载体本身的病原相关分子模式与细胞表面模式识别受体结合，促进炎性细胞因子的分泌和未成熟树突状细胞分化为专职抗原呈递细胞，激活宿主的天然免疫系统。研究表明，通过静脉给小鼠注射大剂量的表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒，6h即可检测到IL-6、IL-1和TNF-α的分泌，脾脏边缘也有树突状细胞和巨噬细胞聚集，在恒河猴中也观察到类似现象。 2、腺病毒载体疫苗能迅速刺激机体产生高水平的体液免疫 很多疫苗是通过刺激机体产生中和抗体来发挥保护机体预防疾病作用的。腺病毒载体疫苗能有效产生针对相应靶抗原的高水平抗体。如携带狂犬病毒糖蛋白的复制缺陷型或复制型的5 型重组腺病毒载体疫苗，都能诱导高水平中和抗体，保护动物抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击。 3、腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的细胞免疫 特异性T细胞免疫在对抗寄生虫病、病毒性疾病及肿瘤治疗中都具有重要作用。大量的临床前和临床研究发现，腺病毒载体疫苗能刺激机体产生很强的针对外源基因的特异性T 细胞反应。有研究报道，携带恶性疟原虫抗原的腺病毒载体疫苗能刺激小鼠产生很强的CD8+T 细胞免疫反应，最高能达到92％的保护率。 4、腺病毒载体疫苗可方便地通过黏膜进行免疫 能通过黏膜免疫诱导局部或全身体液免疫反应是腺病毒载体疫苗的一个重要特点。黏膜免疫与全身免疫相比有许多不同，注射免疫诱导的全身免疫虽然可以清除其感染，但通常不能保护黏膜表面；而经黏膜接种疫苗可以非侵入性地诱导机体产生黏膜和系统免疫应答，从而可以保护机体免受通过黏膜表面和其他途径的感染。研究发现，在多种动物模型中，口服或滴鼻接种肺炎球菌、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、乙肝病毒的重组腺病毒载体疫苗，都能刺激机体产生很强的体液免疫和局部的黏膜反应，并保护机体免受相应病原的侵害。
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务合同书样本
编号：JS-20213689 甲 方：______________________________ 乙 方：______________________________ 日 期：_________年________月_______日 腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技 术服务合同书样本 Promises resulting from either express or an implied agreement can be enforced.
[标签:titlecontent] 服务方(甲方)：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ e-mail：_________ 开户银行：_________ 帐号：_________ 委托方(乙方)：_________ 地址：_________ 邮编：_________ 电话：_________ 传真：_________ 甲乙双方根据《中华人民共和国合同法》等法律法规，在平等互利的原则下，经协商一致，订立本合同，以兹双方共同遵照执行。 第一条病毒名称
甲方接受乙方的委托，为其载体构建、重组、扩增和纯化_________腺病毒，腺病毒滴度_________pfu/ml。 第二条费用及价格(人民币) 1.病毒的载体构建、重组、扩增和纯化所需的原料由甲方自行购买; 2.合同总价_________元，(大写)_________。 第三条乙方责任 1.乙方所购买的甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品将只供乙方或乙方所能控制的实验组中进行实验研究，在任何情况下决不用于人类，决不用于以谋利(直接或间接)为目的的生物制药以及临床分析等方面。 2.未征得甲方授权或同意，乙方不能以任何名义将购买的腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品转移、出售或租借给他人使用。 3.保证乙方应用甲方腺病毒产品及其一切复制品、衍生产品进行的研究符合现行的法律法规，不得应用甲方腺病毒产品进行有损于人类安全或其它非法目的的研究。 4.所有在研究过程中经本产品及其一切复制、衍生产品处理过之动物、植物、蛋类以及乳制品等均应妥善处理，决不可食用或出售。 5.乙方及乙方的课题组在发表文章中注明该重组腺病毒购自甲方，并将已发表文章复印一份给甲方。 6.甲方的腺病毒产品是由人5型腺病毒改造而来，在特殊情况下仍可能具有一定的致病性，乙方必须遵守国家安全使用腺病毒原则。
pAAV-CAG-GFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CAG--‐GFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10004 pAAV--‐CAG--‐GFP pAAV--‐CAG--‐GFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CAG--‐GFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CAG (CMV e nhancer/chicken β--‐actin p romoter) 载体大小: 5439 b p 5' 测序引物及序列: pCAG f wd p rimer 5’CAACGTGCTGGTTATTGTG 3’ 3' 测序引物及序列: cggcttctggcgtgtgac 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: EGFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CAG--‐GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CAG--‐GFP载体序列: ORIGIN 1 C TTCCGCTTC C TCGCTCACT G ACTCGCTGC G CTCGGTCGT T CGGCTGCGG C GAGCGGTAT 61 C AGCTCACTC A AAGGCGGTA A TACGGTTAT C CACAGAATC A GGGGATAAC G CAGGAAAGA 121 A CATGTGAGC A AAAGGCCAG C AAAAGGCCA G GAACCGTAA A AAGGCCGCG T TGCTGGCGT 181 T TTTCCATAG G CTCCGCCCC C CTGACGAGC A TCACAAAAA T CGACGCTCA A GTCAGAGGT 241 G GCGAAACCC G ACAGGACTA T AAAGATACC A GGCGTTTCC C CCTGGAAGC T CCCTCGTGC 301 G CTCTCCTGT T CCGACCCTG C CGCTTACCG G ATACCTGTC C GCCTTTCTC C CTTCGGGAA 361 G CGTGGCGCT T TCTCATAGC T CACGCTGTA G GTATCTCAG T TCGGTGTAG G TCGTTCGCT 421 C CAAGCTGGG C TGTGTGCAC G AACCCCCCG T TCAGCCCGA C CGCTGCGCC T TATCCGGTA 481 A CTATCGTCT T GAGTCCAAC C CGGTAAGAC A CGACTTATC G CCACTGGCA G CAGCCACTG 541 G TAACAGGAT T AGCAGAGCG A GGTATGTAG G CGGTGCTAC A GAGTTCTTG A AGTGGTGGC 601 C TAACTACGG C TACACTAGA A GAACAGTAT T TGGTATCTG C GCTCTGCTG A AGCCAGTTA 661 C CTTCGGAAA A AGAGTTGGT A GCTCTTGAT C CGGCAAACA A ACCACCGCT G GTAGCGGTG 721 G TTTTTTTGT T TGCAAGCAG C AGATTACGC G CAGAAAAAA A GGATCTCAA G AAGATCCTT 781 T GATCTTTTC T ACGGGGTCT G ACGCTCAGT G GAACGAAAA C TCACGTTAA G GGATTTTGG 841 T CATGAGATT A TCAAAAAGG A TCTTCACCT A GATCCTTTT A AATTAAAAA T GAAGTTTTA 901 A ATCAATCTA A AGTATATAT G AGTAAACTT G GTCTGACAG T TACCAATGC T TAATCAGTG 961 A GGCACCTAT C TCAGCGATC T GTCTATTTC G TTCATCCAT A GTTGCCTGA C TCCCCGTCG 1021 T GTAGATAAC T ACGATACGG G AGGGCTTAC C ATCTGGCCC C AGTGCTGCA A TGATACCGC 1081 G AGACCCACG C TCACCGGCT C CAGATTTAT C AGCAATAAA C CAGCCAGCC G GAAGGGCCG 1141 A GCGCAGAAG T GGTCCTGCA A CTTTATCCG C CTCCATCCA G TCTATTAAT T GTTGCCGGG 1201 A AGCTAGAGT A AGTAGTTCG C CAGTTAATA G TTTGCGCAA C GTTGTTGCC A TTGCTACAG 1261 G CATCGTGGT G TCACGCTCG T CGTTTGGTA T GGCTTCATT C AGCTCCGGT T CCCAACGAT 1321 C AAGGCGAGT T ACATGATCC C CCATGTTGT G CAAAAAAGC G GTTAGCTCC T TCGGTCCTC 1381 C GATCGTTGT C AGAAGTAAG T TGGCCGCAG T GTTATCACT C ATGGTTATG G CAGCACTGC 1441 A TAATTCTCT T ACTGTCATG C CATCCGTAA G ATGCTTTTC T GTGACTGGT G AGTACTCAA 1501 C CAAGTCATT C TGAGAATAG T GTATGCGGC G ACCGAGTTG C TCTTGCCCG G CGTCAATAC 1561 G GGATAATAC C GCGCCACAT A GCAGAACTT T AAAAGTGCT C ATCATTGGA A AACGTTCTT 1621 C GGGGCGAAA A CTCTCAAGG A TCTTACCGC T GTTGAGATC C AGTTCGATG T AACCCACTC 1681 G TGCACCCAA C TGATCTTCA G CATCTTTTA C TTTCACCAG C GTTTCTGGG T GAGCAAAAA 1741 C AGGAAGGCA A AATGCCGCA A AAAAGGGAA T AAGGGCGAC A CGGAAATGT T GAATACTCA 1801 T ACTCTTCCT T TTTCAATAT T ATTGAAGCA T TTATCAGGG T TATTGTCTC A TGAGCGGAT 1861 A CATATTTGA A TGTATTTAG A AAAATAAAC A AATAGGGGT T CCGCGCACA T TTCCCCGAA 1921 A AGTGCCACC T AAATTGTAA G CGTTAATAT T TTGTTAAAA T TCGCGTTAA A TTTTTGTTA 1981 A ATCAGCTCA T TTTTTAACC A ATAGGCCGA A ATCGGCAAA A TCCCTTATA A ATCAAAAGA 2041 A TAGACCGAG A TAGGGTTGA G TGTTGTTCC A GTTTGGAAC A AGAGTCCAC T ATTAAAGAA 2101 C GTGGACTCC A ACGTCAAAG G GCGAAAAAC C GTCTATCAG G GCGATGGCC C ACTACGTGA 2161 A CCATCACCC T AATCAAGTT T TTTGGGGTC G AGGTGCCGT A AAGCACTAA A TCGGAACCC 2221 T AAAGGGAGC C CCCGATTTA G AGCTTGACG G GGAAAGCCG G CGAACGTGG C GAGAAAGGA 2281 A GGGAAGAAA G CGAAAGGAG C GGGCGCTAG G GCGCTGGCA A GTGTAGCGG T CACGCTGCG 2341 C GTAACCACC A CACCCGCCG C GCTTAATGC G CCGCTACAG G GCGCGTCCC A TTCGCCATT 2401 C AGGCTGCGC A ACTGTTGGG A AGGGCGATC G GTGCGGGCC T CTTCGCTAT T ACGCCAGCT 2461 G CGCGCTCGC T CGCTCACTG A GGCCGCCCG G GCAAAGCCC G GGCGTCGGG C GACCTTTGG