第1章抗体分子标记技术
第1章抗体分子标记技术
第一节抗体的I125标记法
基本原理
有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α
-diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。
试剂及仪器
●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体
●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1)
●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液
●凝胶过滤柱
●γ-记数器
●100g/L 三氯醋酸
●70% 乙醇
●玻璃纤维滤
●氯胺T (Chloramine T)反应用
* 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）；
* 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。
操作步骤
*注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。
（一）氯胺T法
1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl；
2．加500 μCi 的Na125I ，混匀；
3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀；
4．在室温下培养1分钟；
5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）；
6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分；
7．收集、合并含碘化抗体的各管；
8．将125I标记的抗体管放入同位素保护管中，置4℃保存。
（二）Iodogen-包被试管法
1.Iodogen以0.5μg/ml溶于氯仿；
2.将100μl Iodogen液移入合用的玻璃试管中；
3.试管置通风橱中过夜，在室温下让氯仿蒸发；
4.加入50μl 抗体（0.2-1mg/ml在pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液中）；
5.加500 μCi Na125I 到加有抗体的Iodogen-包被管中，室温保温2分钟；
6.将管中反应液转入1.5ml Eppendof 管（其中已先加有50μl Iodogen 反应终止缓冲液），轻混；
7.通过凝胶过滤层析，将碘化抗体与碘化酪氨酸分离（同前络胺T法）；
8.收集、混合含碘化抗体的各管；
9.将125I标记的抗体置同位素保护管中，放4℃保存。
实验质量监测
应用三氯醋酸沉淀法测定抗体标记效率：
1．取两片玻璃纤维滤纸，用软铅笔写标记；
2．将滤纸平放在试管架的孔部，使其中心部分不接触试管架；
3．将1-5μl含约10000cpm 的样品，准确的点到每一张滤纸的中心，在室温下待干；
4．用平头镊子将一滤纸转入试管，加入2ml 100g/L三氯醋酸；
5．滤纸在三氯醋酸液中浸转10 分钟，倾出溶液；
6．再加入2ml 100g/L 三氯醋酸，重复上述操作；
7．加入2ml 70%乙醇，滤纸浸在乙醇中转动10 分钟后，倾出溶液；
8．测定经过洗过涤与未洗涤滤纸的放射性；
9．由所测定滤纸点样中与抗体结合的125I量，计算与抗体液中与抗体结合的125I总量。
洗后滤纸的cpm
未洗滤纸的cpm × 100 = 结合碘的比率
样品的总量/ 收集的分量×在洗后滤纸中的cpm = 总抗体-结合放射性
*与抗体结合的同位素量应为样品中同位素总量的70-95%。
实验要点及说明
1．用氯胺T法进行碘化，也可在大约pH 7.0的缓冲液中进行。均必需保证反应体系中无还原剂存在。2．如果氧化反应损伤蛋白质，可将氯抗体与异硫氰酸荧光素（ FITC）偶联）胺T量减少到0.02mg/ml, 并将偏重亚硫酸液的浓度降到0.024mg/ml。
3．Iodogen-包被的试管可在干燥器中，室温下，保存多年。
4．125I标记的抗体，在制备后六周内均可使用（125I的半衰期为59.6天）。
5．要注意保证所用的Na125I是新鲜的，陈旧制剂的比活性低。
6．酪氨酸的碘化偶尔会对抗原的抗体结合位点有干扰，因此降低其结合能力，但这种情况很少见。
* 以上同位素标记方法中需用高度纯化的抗体，以保证结果的可靠。
参考文献
1．Fraker, PL .and Speck, JC (1978) Protein and cell membrane iodination with sparkingly soluble chloramines, 1，3，4，6-tetrachloro-3α,6α-diphenyl-glucoluril. Biochem. Biophys. Res. Commun.
80,849-857.
2．Greenwood, FC., Hunter, WM. And Glover, JS. (1963) The preparation of 125I-labeled human growth hormone of high specific radioactivity. J. Biochem. 89, 114-123.
3．孙册，朱正美及顾天爵放射性标记凝集素《糖复合物生化研究技术》浙江大学出版社 1999 pp.501-504
（朱正美）
抗体的酶标记法
基本原理
本法是应用偶联剂使酶与抗体结合。即通过应用单、双或多功能基试剂，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应，生成酶－抗体偶联复合物。不同的酶-抗体复合物制备方法中，最广泛应用的是第一步加入戊二醛的方法，本法与其它偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和，及实用面广等长处。
试剂及仪器
●亲和纯化的多克隆抗体或生物化学纯的单克隆抗体（5mg/ml PBS液或0.1 mol/L磷酸缓冲液 pH6.8）
●用以标记的酶（EIA级，有商品供应）：
辣根过氧化物酶( HRP,纯度为A430/A275 > 3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶（AKP），或大肠干菌β－D－半乳糖苷酶均可选用，但以HRP最为常用。
●2５％戊二醛液（电镜级）
●０.1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH6.8）
●PBS ( 见附录 )
● 2 mol/L 甘氨酸液
●蒸溜甘油
●透析袋（分子量6000-8000）
●电磁搅拌器和搅拌棒
操作步骤
一．抗体与过氧化物酶偶联
1．将5mg抗体与10mg酶在总体积1ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；
2．在4℃对0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）透析过夜；
3．用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）稀释戊二醛至1%；
4．向透析混合液中加入50μl 稀释过的戊二醛，在室温下轻1轻搅拌三小时；
5．加入2 mol/L甘氨酸液使最终浓度达到0.1 mol/L，混合液室温放置2小时，以封闭残存的醛基6．混合液在4℃对PBS透析过夜；
7．10000 × g 4℃离心30分；
8．将上清移入另一管中，按体积1：1加入甘油，使终浓度达50%；
9．置-20℃保存。
二．抗体与AKP偶联
1．将5mg抗体与10mg酶在总体积2ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；
2．其它操作同HRP标记法。
三．抗体与葡萄糖氧化酶偶联
按HRP偶联法操作，仅加入的1%戊二醛改为150 μl。
四．抗体与β－D－半乳糖苷酶偶联
按HRP偶联法操作，但见偶联反应总体积改为2ml，１%戊二醛用量改为的100μl。
反应质量测定
可用抗原包被的微量板通过直接酶免疫试验测定偶联度。（具体方法见-----）
实验要点及说明
１．如果参与偶联的氨基位于抗体和抗原的结合位点，则在偶联反应中，被标记抗体的亲和性能会不同程度的受到破坏；
２．主要影响偶联成功率的原因是在反应混合液中有游离氨基存在，游离氨基容易和戊二醛反应，因而干扰蛋白质的交连。因此，必须用绝对不含有机物的水配置缓冲液，并且反应混合液要在偶联前对该缓冲液充分透析，是反应成功的要点。
３．反应不能应用Tris-甘氨酸缓冲液。
参考文献
１．Avrameas,S. (1969) Coupling of enzymes to protein with glutaraldehyde. Use of the conjugates for the detection of antigens and antibody. Immunochemistry 5, 43-52 ２．Avrameas,S. and Ternyck, T. (1971) Peroxidase labelled antibody and Fab congugates with enhanced intracellular penetration. Immunochemistry. 8(12): 1175-1179
（朱正美）
第三节抗体的生物素化标记
基本原理
本法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基通过手臂与酰化的生物素共价结合。其后，生物素化的分子可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来检测。小分子的水溶性生物素对细菌蛋白链霉亲和素具有高度亲和力是本法的设计基础。
试剂及仪器
●NHSB：N-羟基琥珀酰亚胺生物素（有商品供应）
●0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液，pH 8.0（见附录）
●双蒸水（注意去除游离氨基），用以配制碳酸氢钠缓冲液或硼酸缓冲液
●DMSO（二甲亚砜，有毒试剂）
● 1 mol/L NH4Cl
●叠氮钠（有毒试剂）
●PBS（见附录）
●10g/L牛血清白蛋白（W/W）PBS液
●分子筛柱（如G25）
●电磁搅拌器
●透析袋（MW CO 8000）
●铝铂
●微量移液器
操作步骤
１．将待生物素化的蛋白质用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6）稀释到1mg/ml,一般实验室应用的生物素化体积为1-2.5ml;
２．交互用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 8.0）或0.5 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.6），对蛋白质充分透析；３．用1ml DMSO 溶解NHSB 1mg；
４．向1ml蛋白质溶液（即含蛋白质1mg）加入120μl NHSB溶液（即含NHSB 120 μg）；
５．在室温下持续搅拌，保温2-4小时；
６．加入9.6μL1 mol/L NH4Cl (每25 μg NHSB 加1 μl)，在室温下搅拌10分钟；
７．在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；
８．将样品上1ml的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1ml/管，蛋白质在1-3ml之间洗下；
９．最后，样品加入叠氮钠（终浓度0.5g/L）及1.0g/L BSA。将结合产物置4℃，避光保存，亦可加入50%重蒸甘油，置―20℃保存。
质量监测
与酶-或荧光染料-结合的亲和素、链霉亲和素或中和亲和素（neutravidin），通过标准方法（Western blotting 或免疫荧光染色法）测定交联率。
实验要点及说明
１．如在反应混合液中有叠氮钠或游离氨基存在，会抑制标记反应。因此，蛋白质在反应前要对0.1 mol/L 碳酸氢钠缓冲液或0.5 mol/L硼酸缓冲液充分透析；
２．所用的NHSB及待生物素化蛋白质之间的分子比按蛋白质表面的ε-氨基的密度会有所不同，选择不当则影响标记的效率，应先用几个不同的分子比来筛选最适条件；
３．用NHSB量过量也是不利的，抗原的结合位点可能因此被封闭，导致抗体失活；
４．由于抗体的氨基不易接近可能造成生物素化不足，此时可加入去污剂如Triton X-100,Tween 20等。
５．当游离ε-氨基（赖氨酸残基的氨基）存在于抗体的抗原结合位点时，或位于酶的催化位点时，生物素化会降低或损伤抗体蛋白的结合力或活性。此时，应试用其它交联方法；
６．生物素还可能与不同的功能基团，如羰基、氨基、巯基、异咪唑基及苯酚基，也可与糖基共价结合（详见参考文献1）；
７．交联反应后，应充分透析，否则，残余的生物素会对生物素化抗体与亲和素的结合产生竞争作用；
８．在细胞的荧光标记实验中，中和亲和素的本底低，但由于链霉亲和素含有少量正电荷，故对某些细胞可导致高本底。
参考文献
１．Bayer,EA. And Wilchek, M. (1980) The use of avidin-biotin complex as a tool in molecular biology. Meth. Biochem. Anal. 26, 1-45.
２．Guesdon, JL., Ternynck, T. And Avrameas, S. (1979) Thr use of avidin-biotin interaction of immuenzymatic techniques. J. Histochem. Cytochem. 27, 1131-1139.
（朱正美）
第四节抗体的荧光标记法
基本原理
许多蛋白质分子在其表面含有较多的赖氨酸残基。这些赖氨酸残基的游离ε-氨基可与FITC（其激发波长为492nm, 发射光波长为525nm）共价结合。与FITC结合的抗体可用为特异性的探针，以测定细胞相应抗原的存在。FITC具有很高的量子产量（发射光与吸收光的比值,0 .85），而且形成的偶联物的稳定性很好。FITC是应用最广的荧光染料，流式细胞仪就按FITC的特性，设计了激光波长为488 nm,很接近于FITC的最大激发波长492nm）。
偶联反应是在pH 9.8条件下，赖氨酸残基的游离ε-氨基与FITC发生的亲核反应，由此形成硫脲连接。
试剂及仪器
●待偶联抗体
●碳酸氢钠缓冲液：25m mol/L Na2CO3 / NaHCO3缓冲液pH9.8 (新鲜配制，配法见附录)
●PBS (见附录)
●叠氮钠（有毒试剂）
●异硫氰酸荧光素（I型异购体，有商品供应）
●电磁搅拌器
●铝铂
操作步骤
１．用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/ml，或抗体对该缓冲液充分透析，以足以使赖氨酸不解离（去其正电荷），但注意保持大部分蛋白质仍未变性；
２．将透析袋放入100ml 含0 .1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液（新配制）的烧杯中，用铝铂包烧杯以避光，4℃搅拌过夜；
３．上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应。其间至少更换PBS液三次，直致480nm 的吸收为零；４．加入0.5g/L 的叠氮钠。此后，结合物在4℃避光保存，或分装后在－2０℃冻存。
荧光偶联质量的检测
用标准免疫荧光染色试验以测定偶联率。
或用F/P值测定对其FITC标记质量进行鉴定：
取结合物液0.2ml，加PBS 2.8ml（或两者均改用半量），测定其A490/A280，查 FITC标志曲线得其浓度μg/ml值，按IgG的消光系数（mg/ml约A280 1.2）,可计算其F/P值，即每mg抗体所标记的μgFITC的比值，可以此鉴定及比较各批标记物的质量。
实验要点及说明
１．偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行，而且注意在反应过程中要保持此pH水平；
２．要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基（Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应，因此会降低蛋白质与FITC的偶联率）；
３．FITC与蛋白质的比值（F/P）,可通过测定495nm与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为０.3－１.0（方法见前）；
４．FITC唯一的缺限是易被光淬灭，因此复合物必须始终避光保存；
５．如果FITC－复合物对PBS透析不充分，可能造成高本底，对免疫荧光染色产生干扰；
６．如果被标记的蛋白质是第二抗体或通用的第一抗体，则从商品购置可能更方便可取。
参考文献
１．The, TH and Feltkamp, TEW. (1970) Conjugation of f luorescein isothiocyanate to antobodies.
I. Experiments on the conditions of conjugation. Immunology 18, 865-873.
２．The, TH and Feltkamp, TEW. (1970) Conjugation of fluorescein isothiocyanate to antobodies.
II. A reproducible method. Immunology 18, 875-881
（朱正美）
第五节生物合成过程的标记
基本原理
对生物合成过程进行标记，主要是为了研究蛋白质的生化性质、合成、加工、细胞内传送、分泌和降解过程。通常将细胞放在含有充足营养成分和放射性标记氨基酸的培养基中，虽然蛋氨酸和半胱氨酸在蛋白质中的含量较低，但其35S标记物具有特异性高(>2.93 ×1013Bq/mmol) 、容易检测的特点，因此是进行生物合成标记的首选氨基酸。下列步骤是对悬浮液中细胞（脾或胸腺的单细胞悬浮液或者培养物）进行短期标记的方法。
注意事项：
实验室应具备进行放射性化合物操作的各种相关设备。
1. 放射性工作专用的水浴槽，保温箱和离心机；
2. 在进行标记操作的时候，用盖革氏计数器监测操作区域；
3. 做好35S 固体与液体废物的处理工作；
4. 在实验开始之前，要得到相关部门的批准；操作中，要严格地遵照国家管理条例的要求。
试剂与设备
●在培养基中的细胞
●冰冷却的 PBS (参见附录 A)
●标记培养基:不含蛋氨酸、半胱氨酸的RPMI 1640 培养基，水浴预热到 37 ℃
●[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸(800-l200 Ci/mmol = 2.93-4.44 ×1013 Bq/mmol)
●15或 50 ml 锥形聚丙烯离心管
●对标记培养基充分透析的胎牛血清（FCS）
●L-谷氨酸.
●微量吸管
●恒温箱
●离心机 (冷冻)
操作步骤
（一）细胞的准备工作
1.在室温下, 以300 ×g 离心5 分钟，收集到 107-108个细胞；
2.在锥形离心管中，用10ml 37 ℃的标记培养基洗涤细胞，然后300 × g 离心5 分钟；
3.丢弃上层清液；
4.细胞沈淀加入标记培养基，重复洗涤一次。
（二）前脉冲Prepulse
1.洗涤后的细胞, 用37 ℃预热的标记培养基重新悬浮 (4 ml含 20 ×106个细胞) ，在37 ℃孵育 30分
钟，间歇漩涡振荡，以耗尽细胞内原有的蛋氨酸和半胱氨酸；
2.室温解冻[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸；
3.注意: [35S] 蛋氨酸容易挥发，请在专用的、装有活性炭过滤器的通风橱内，打开[35S] 蛋氨酸储存液。
目前，不易挥发的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸均有商品出售。
4.细胞液在室温下, 以300 × g 离心5 分钟，弃上清。
（三）脉冲Pulse
1.将细胞团重新悬浮于标记培养基中 (浓度20 ×106个细胞/1 ml) ；
2.加入250 μCi 的[35S] 蛋氨酸和 [35S] 半胱氨酸 (9.25 ×109 Bq)；
3.细胞放入37 ℃恒温箱中，孵育30 分钟到 3 小时，孵育期间经常振荡，以保持细胞悬浮；
4.细胞液在室温下, 以300 ×g 离心5 分钟，弃上清；
5.警告: 使用过的培养基和洗涤液均含有放射性，因此，请按规定方法操作和处理放射性物质；
6.用10ml 冰冷的 PBS 重新悬浮细胞，反复洗涤两次；
7.按“细胞提取液的制备”（见Protocol 43）中的方法进行细胞处理和分析，或者-20 ℃冻存细胞。
质量要点
1.如果脉冲需要持续1小时以上，需要在无菌的条件下，向标记培养基中添加2% 的胎牛血清和2%的 L-
谷氨酸；
2.对于大多数类型的细胞，可以采用带螺口的组织培养瓶，并在湿润的、含5% CO2的培养箱中进行孵育；
3.孵育必须在37 ℃进行，温度低会显著地减少掺入到蛋白质中的放射性；
4.也可以使用14C-标记的氨基酸作标记，其半衰期长，有利于在较长的时间（几个星期）内使用标记的蛋
白质, 例如标记杂交瘤B细胞分泌的单克隆抗体，就常采用14C-标记的氨基酸混合物(丝氨酸，亮氨酸，缬氨酸)。
参考文献
1.Coligan, J.E., Gates, F.T., III, Kimball, E.S. and Maloy, W.L. ( 1983) Radiochemical sequence
analysis of biosynthetically labeled proteins. Meth. Enzymol. 91,413-434.
2.Meisenhelder, J. and Hunter, T. ( 1988 ) Radioactive protein labelling techniques. Nature
(London) 335, 120.
（李京华朱正美）
第六节免疫胶体金标记抗体及检测抗原
基本原理
胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物，可以检测单一和多重抗原。胶体金在电解质中不稳定，但被蛋白质包被的胶体金是稳定的。一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金，可作标记二抗进行免疫检测，本方法应用范围广，染色后的样品可以长期保存。
试剂和设备
●超速离心机
●显微镜
●温箱
●分光光度计
●0.2 um 微孔滤膜
●载玻片，盖薄片,滤纸
●氯金酸钠
●1％柠檬酸钠水溶液
●山羊抗鼠Ig抗体
●对T淋巴细胞特异的鼠抗人单克隆抗体
●自人外周血分离的白细胞悬液
●10％氯化钠
●1％聚乙二醇
●0.01mol/L pH7.2的PBS
●1% 戊二醛乙醇溶液
●50％硝酸银溶液（提前一天配制）
●明胶显影液，2g明胶溶解于99ml蒸馏水中，加1 ml甲酸
操作步骤
（一）胶体金溶液制备
1．称取0.1g 氯金酸钠，溶解于1L去离子水中；
2．加热煮沸，剧烈搅拌下，迅速加入25ml新配的1％柠檬酸钠溶液；
3．继续煮沸5分钟，至溶液变成桔红色；
4．用蒸馏水将溶液的525 nm波长下的光密度吸收值调到0.8。
（二）胶体金的包被
1．将山羊抗鼠Ig抗体以36 900 g 离心30分钟；
2．上清液经0.2 nm 滤膜过滤；
3．确定蛋白质包被的最佳浓度：将蛋白质作连续10倍稀释各1ml，加入5ml胶体金溶液，1分钟后加入1ml 10％氯化钠溶液，静止5分钟；以胶体金溶液为空白对照测定光吸收度，选择最低吸收值的蛋白质浓度用于正式包被。
4．取50ml胶体金溶液，用0.2M K2CO3调pH值为7.6，按照确定的最佳比例将蛋白质加入并快速混合，让蛋白质吸附2分钟后，加0.5ml 1%聚乙二醇，防止非特异性凝集；
5．5000?g 离心1小时，弃上清液，将胶体金悬浮于含1％聚乙二醇的PBS中；重复一次；
6．弃去上清液，将包被的胶体金溶液用5 ml含1% BSA的PBS稀释, 经微孔滤膜过滤后，4℃保存。
(三) 抗原检测
1．取20ul人外周血白细胞与5μl T淋巴细胞特异的单克隆抗体在4℃下孵育30分钟；
2．1000 r/分离心清洗细胞5分钟，2次；
3．将洗涤后的细胞与20μl(一般效价1:20)胶体金标记的山羊抗鼠Ig抗体在室温下孵育30-60分钟；
4．1000 r/分离心清洗细胞5分钟，2次；
5．将细胞涂片于载玻片，用1% 戊二醛固定细胞10分钟，清洗多余固定液；
6．将载玻片细胞面向上置于放有湿润滤纸的培养皿中，加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显色液，覆以盖玻片，放入60-65℃的温箱中，显色3-4分钟，直至玻片标本呈现金褐色为止；
7．移出盖玻片，用蒸馏水迅速漂洗数秒，晾干；
8．光学显微镜下观察。
对照试验
可以用未加一抗的细胞作为对照试验组。
试验要点及说明
1．所使用的器皿均应非常洁净，需经过硅烷化处理；
2．使用高纯度多次蒸馏去离子水；
3．胶体金颗粒的形成、大小和速度，均决定胶体溶液的稳定性，水质和玻璃表面对启动还原和稳定胶体十分重要，本过程制备的胶体金颗粒直径约为18-20 nm；
4．因为胶体金在电解质中不稳定，本实验全部操作过程要严格、迅速，注意液体颜色；
5．蛋白质包被胶体金时的相对最佳浓度要事先测定，测定最佳浓度时，胶体金溶液的pH值也要调节到pH7.6；
6．一抗和胶体金标记二抗的稀释浓度应事先经预试验以最佳效价。
参考文献
1．杨汉民主编（1997）《细胞生物学实验》第二版高等教育出版社
2．杨景山主编（1990）《医学细胞化学和细胞生物技术》北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社
（葛常辉）
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；
3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；
荧光素标记抗体方法
荧光素标记抗体技术 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓
收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g，NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！
免疫标记技术讲解
课程名称：临床免疫学检验技术课题名称：免疫标记技术 组员：朱恩鹏拉巴卓嘎 张燕培汪婷婷
免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。 第一节放射免疫技术 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高（可检测出毫微克（ng）至微微克（pg），甚至毫微微克（fg）的超微量物质，特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 （一）放射免疫测定（RIA） 放射免疫测定（Radio immunoassay , RIA）是1959 年Yalow 和Berson 首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30 多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 （二）免疫放射测定（IRMA）
标记抗体技术
标记抗体技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗 体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。 一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2──────→D＋2H2O b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，
抗体标记技术汇总
第1章抗体分子标记技术 第一节抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α -diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 ●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 ●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) ●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 ●凝胶过滤柱 ●γ-记数器 ●100g/L 三氯醋酸 ●70% 乙醇 ●玻璃纤维滤 ●氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 2．加500 μCi 的Na125I ，混匀； 3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 4．在室温下培养1分钟； 5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 7．收集、合并含碘化抗体的各管；
酶标记抗体
酶标记抗体 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 (一)酶制剂及其底物 凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。 由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O 供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex
G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效
荧光素FITC标记抗体的方法
荧光素FITC标记抗体的方法 当FITC在碱性溶液中与抗体蛋白反应时，主要是蛋白质上赖氨酸的r氨基与荧光素的硫碳胺键(thiocarbmide)结合，形成FITC-蛋白质结合物，即荧光抗体或荧光结合物。一个IgG分子中有86个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个，一个IgG分子可结合2～8个分子的FITC，其反应式如下 FITC-N=C=S + N-H2-蛋白质→ FITC-NS-C-N-H2-蛋白质 常用Marsshall(1958)法标记荧光抗体，也可以根据条件采用Chadwick等标记法或Clark等(1963)的透析标记法。 1．Marsshall法 (1)材料抗体球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小烧杯、4℃冰箱、电磁搅拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步骤①抗体的准备取适量已知浓度的球蛋白溶液于烧杯中，再加人生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后免疫球蛋白浓度为
20mg／ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1／10，混匀，将烧瓴置电磁搅拌器上(速度适当以不起泡沫为宜)5～10min。 ②荧光素的准备根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg荧光色素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。也可用下述公式计算出免疫球蛋白、荧光素的量，还可以算出需加缓冲液的量。 a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容积Bml。 b．总蛋白量(AXB)＝Crag。 c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)。 d．荧光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。 e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸盐缓冲液D／10＝Fml。 f．PBS量D-(B+F)=Gml。 注：A为蛋白含量，mg／ml；B为蛋白质溶液的容积；C为蛋白总量，mg；D为常数，mg；正为荧光素的量，mg；F为碳酸盐缓冲液的容积，ml；G为PBS的容积，ml。 ③结合(或标记) 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于烧瓶壁(大约在5—10min内加完)，加完后，
HRP标记抗体的方法
HRP标记抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠发。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法 1、原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白结合物。 2、标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于12.5mL/L戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/min，收集棕的流出液。如体积大于5mL，则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体112.5mg用生理盐水稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M pH9.5碳酸盐缓冲液0.25mL，继续搅拌3~4小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25mL，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 （7）3000rpm/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中。 （8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M、pH7.4的PB缓冲液透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000rpm/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3、结果判定 （1）定性及效价测定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散实验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA（或正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（见（三）工作浓度的选择）。 （2）本法标记步骤比较简单，重复性好，缺点是酶的利用率低，一般只有2%~4%的酶与蛋白质结合。 4、试剂和器材 （1）0.1M、pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS）：取0.2M Na2HPO4 49mL ，0.2M NaH2PO4 51mL, NaCl 1.8g，加蒸馏水至200mL。 （2）12.5mL/L戊二醛液：取250mL/L戊二醛50mL与pH6.8的PBS确？mL混合。 （3）1M、pH9.5碳酸盐缓冲液（PBS）：取1M Na2CO3 3mL 与1M NaHCO3 7mL混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M、pH9.5碳酸盐缓冲液1mL中。 （5）0.15M、pH7.4的PBS及生理盐水。 （6）pH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇（PEG、MW2000）。 （8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。 （9）HRP（RZ>3.0）。 （10）SephadexG-25层析柱（2cmX50cm）。 （11）搅拌器、分光光度计、离心机。 （12）透析袋、大小烧杯，试管，吸管等。
第十六章 标记抗体技术
第十六章标记抗体技术 1、免疫荧光标记技术的概念/所用荧光素的要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用 （一）概念：免疫荧光标记技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法（二）荧光素要求：作为蛋白质标记用的荧光素须具备①有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，而不形成有害产物②荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很小③结合物一般在储存条件下稳定，结合后不影响抗体的免疫活性④作为组织学标记，结合物的荧光必须与组织的自发荧光有良好的反衬，以便能清晰地判断结果⑤结合程序简单，能制成直接应用的商品，可长期保存。可用于标记的荧光素有FITC,RB200,四甲基异硫氰酸罗丹明。 （三）基本原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 （四）操作步骤：
①标本制备： 涂片或压印片：细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣 冰冻切片或低温石蜡切片：组织学、细胞学和感染组织 盖玻片：上面培养单层细胞 首要要求是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。标本要相当薄，有适当的固定处理方法 ②固定：常用丙酮和95%乙醇，室温固定15-30min后，用PBS反复冲洗，干后即可染色。 目的：防止被检材料从玻片上脱落，消除抑制抗原抗体反应的因素。检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。 ③检测： A、直接法：直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区，置湿盒中，于37度染色30min左右，然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min，干燥、封载，显微镜镜检 B、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37度作用30min，PBS漂洗5min后，再加入FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37度作用30min，PBS漂洗5min，干燥、封载，显微镜观察
免疫组化常用抗体标记物
免疫组化常用抗体标记物 （一）上皮源性标记物 1、一般性标记物（1） CK（角蛋白）CK亚型：CK5/6、CK7、CK8、CK10/13、CK18、CK19、CK20 （2） EMA（上皮膜抗原） 2、特异性和（或）相对特异性上皮标记物 （1）CEA（癌胚抗原，标记胃肠道癌、肺腺癌等）（2）CA242（肿瘤相关粘液抗原、标记胰腺癌、结、直肠癌等）（3）TG（甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌）（4）PSA（前列腺特异性抗原，主要用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断）（5）PSAP（前列腺特异性酸性磷酸酶，主要用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断）（6）34βE12（高分子量细胞角蛋白，标记前列腺基底细胞）（7）AFP（甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌等）（8）Hepatocyte （标记肝细胞癌）（9）β-HCG（β绒毛膜促性腺激素，标记胎盘滋养叶细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤）（10）CA125（卵巢癌抗原） （二）间叶源性标记物肌源性标记物 1、 Desmin（Des，结蛋白） 2、 Actin（肌动蛋白） 3、 SMA（平滑肌肌动蛋白） 4、 MSA （肌特异性肌动蛋白） 5、 Myosin（肌球蛋白） 6、 Myoglobin（MG，肌红蛋白） 7、 Myogen （肌浆蛋白） 8、 MyoD1（肌调节蛋白） （三）血管源性标记物 1、 FVⅧRAg（第8因子相关抗原） 2、 CD31 3、 CD34 4、 UEA-1 5、 BNH9 （四）组织细胞源性标记物 1、 CD68/KP-1 2、 Lysozyme（溶菌酶） 3、α-AT（α1-抗胰蛋白酶） 4、α1-ACT（α1-抗胰糜蛋白酶） 5、 Mac387 （五）淋巴造血组织源性标记物 1、全淋巴细胞（1）CD45/LCA（白细胞共同抗原）（2）TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）（3）CD30/ki-1 2、全B细胞（1） Igκ（2） Igλ（3） CD20/L26 （4） CD79α（5） BLA36（B淋巴细胞抗原）（6） Pax-5（B细胞系特异性激活蛋白） 3、 B细胞亚型（1） CD10 （2） CD21（标记滤泡性树突状细胞）（3） CD23 （4） CD35（标记滤泡性树突状细胞）（5） CD38 4、全T细胞（1） CD3 （2） CD5 （3） CD43 （4） CD45RO/UCHL-1 5、 T细胞亚型（1） CD1α（2） CD4 （3） CD8 6、 NK细胞（1） CD56 （2）CD57/Leu-7 （3） CD16/Leu-11 7、粒细胞和单核细胞（1） CD11c/LeuM5 （2） CD15/LeuM5 （3） Lysozyme（溶菌酶）（4）α-AT（α1-抗胰蛋白酶）（5）α1-ACT（α1-抗胰糜蛋白酶）（6） CD68 （7） S-100蛋白（8） Mac387 8、其他（1） EMA（上皮细胞膜抗原）（2） CD99（尤因肉瘤标记物）（3） ALK-1（间变性淋巴瘤激酶）（4） HLA-DR （5） Bcl-2 （6） Bcl-6 （7） Bcl-10 （8） Ki-67 （9） CyclinD1（周期素D1）（10） CD25 （11） CD34. 六）神经源性标记物
胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理
胶体金标记的全定量免疫层 析技术的原理 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理 从定性、半定量向全定量是即时检验（POCT）技术发展的一个趋势。全定量的POCT检测技术有多种原理。本文主要介绍胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理。 一、胶体金标记的全定量免疫层析POCT试剂装置结构示意图及作用 1、吸收垫：吸收多余液体。 2、 PVC底板：提供试剂封装外壳。 3、 C1、C2：标准质控区。羊抗鼠抗体结合于硝酸纤维膜上。 4、 T：检测区。鼠源性单克隆二抗。 5、硝酸纤维素膜：提供抗原抗体反应的固相载体。 6、胶体金垫：含胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。 7、样品吸收垫：吸收样品液体。 二、原理 该方法的免疫学原理是一个双抗体夹心法。 样品加入样品吸收垫，样品中的液体首先溶解胶体金垫中含有的胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。其次样品中待测抗原与胶体金颗粒标记的鼠源性单克隆抗体结合，形成抗原-抗体*胶体金复合物，并靠毛细作用向检测线移动。在硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一鼠源性单克隆二抗。当样品层析至检测线时，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。无显色反应则表示样品中无抗原存在。而胶体金的量反应了待测抗原的量。从加样垫中泳动过来的过量胶体金标记的单克隆抗体是鼠源性的，无论携带抗原与否，均可被固定于标准的羊抗鼠抗体所捕获，形成显色反应，这种显色反应，既代表了整个反应体系是正确的，同时C1、C2区的显色反应的深浅，与检测区中被测抗原的量呈对应关系。胶体金颗粒在特定波长下，对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关，通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，从而获得待测抗原的量。 三、讨论 全定量是POCT的发展趋势，采用两点定标法是全定量的一个重要标志，只有两点定标才有可能实现真正的全定量。 2
抗体HRP标记方法
HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法) 一、戊二醛二步法戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成 酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 二、简易过碘酸钠法本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的 HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失， 是目前最常用的方法。 1. 原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 （7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定 （1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节(三)工作浓度的选择)。（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 （3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材 （1）0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO449ml, 0.2M NaH2PO451ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 （2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。 （3）1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 （5）0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 （6）PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
抗体
一、单体 Porter等对血清IgG抗体的研究证明：Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即：由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的分子量较大的肽链(重链)组成。 轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为氨基端(N端)和羧基端(C端)。 二、轻链和重链 1、轻链（light chain，L链） 由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量为24kD，有两个由链内二硫键组成的环肽，L链可分为：Kappa（κ）与lambda（λ）2个亚型。 2、重链（heavy chain，H链）
由450-550个氨基酸残基组成，分子量55-75kD，含糖数量不同，4-5个链内二硫键，可分为5类，μ、γ、α、δ、ε链，不同的H链与L链（κ或λ）组成完整的Ig分 子。分别称为：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。
三、可变区和恒定区 通过对H链或L链的氨基酸序列比较分析，发现： 其N-末端序列变化很大，称此区为可变区（V区）； C-末端氨基酸则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区（C区）。 1、可变区（Variable region，V区） L链N端1/2处（VL）108-111个氨基酸残基，H链N端1/5-1/4处（VH）118个氨基酸残基，V区有一个肽环65-75个氨基酸残基。
可变区可分为高变区（hypervariable region ，HVR ）和骨架区（framework region ，FR ），VL 的HVR 在24-34，50-56，89-97氨基酸位置。VH 的HVR 在31-35， 50-56，95-102氨基酸位置。分别称为VL 和VH 的HVR1，HVR2，HVR3。
I标记单克隆抗体技术
125I标记单克隆抗体技术 同位素标记是一种重要的抗体标记技术，牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外，还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。 (一) 原理 氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠，在水溶液中生成次氯酸，为一种温和氧化剂，当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中，可将I２氧化为I＋并结合到氨基酸上。如标记条件温和，标记后的McAb仍具有良好的结合活性，通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。 (二) 方法 在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg／100μl， 再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液 再加入10μl(含1mCi)125I ↓ 加入10μl氯胺-T(5mg／ml溶于0.05M 磷酸盐缓冲液)，孵育时间不超过30秒 ↓ 加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg／ml溶于 0.05M磷酸缓冲液) ↓ 加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M 磷酸缓冲液＋4％牛血清白蛋白) ↓ 用PD10柱(Sephadex G25)除去游离125I 用4％BSA PBS洗脱 ↓ 分部收集，0.5ml／管 每管取5μl进行γ计数，计算标记抗体的比活性和标记率 结合于McAb１２５I放射性强度(cpm) 标记率(％)＝─────────────────── 总放射性强度(cpm) 结合于某一管McAb上的放射性强度 比活性(μCi／μgMcAb)＝──────────────── 某一管McAb总量
(三) 试剂器材 1. 纯化后的McAb 2. 0.05M磷酸缓冲液，氯胺桾，偏重亚硫酸钠，KI，BSA 3. 125I 4. 有通风装置的超净台，γ计数仪 5. PD10柱(Sephadex G25) (四) 注意事项 1. 严防同位素污染，工作人员必须穿着工作衣，戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用125I和标记物应妥善保管。 2. 如标记细胞因子、激素等，应选用更温和的标记方法，使保持更好的生物学活性。
抗体标记标准化步骤
抗体标记标准化步骤 以h-FABP抗体（NP24）标记AE、BIO为例 标记步骤： ①300ul的反应体系 1、抗体解冻后，混匀离心10s，取50ul于离心管，然后取1ul AE（原倍AE不需要吹打）于离心管壁，最后用99ul标记液CB将AE向下冲散混合(如果AE 已预先和抗体混合，弃用)； 2、37℃水浴标记1小时后取出，在此之前将透析袋提前浸泡，然后将离心管内液体吸出，加入至透析袋，再加150ul 20mM PBS，混匀后，扎好透析袋进行透析（透析液为PH 7.4 20mM PBS，体积为2L）； 3、4-8小时更换透析液一次，在每次换透析液前要先测量上一次透析液中残留AE发光值，当测量发光值在3000左右即可停止透析； 4、收集：将透析袋里的抗体取出至EP管中，用20mM PBS补充至一个定值，按标记抗体：抗体储存液=4:1的体积比例加入抗体储存液，再按加完储存液后的体积1：1加入甘油，然后贴好标签，并加上透明胶带，最后放置-20℃冰箱保存； 5、以标记好的抗体NP24-AE和NP24-BIO进行样品测试，验证标记抗体是否可用，并考察信噪比。 ② 150ul的反应体系 1、抗体解冻后，混匀离心10s，取50ul于离心管，然后取1ul AE（原倍AE不需要吹打）于离心管壁，最后用49ul标记液CB将AE向下冲散混合(如果AE 已预先和抗体混合，弃用)； 2、37℃水浴标记1小时后取出，在此之前将透析袋提前浸泡，然后将离心管内液体吸出，加入至透析袋，再加50ul 20mM PBS，混匀后，扎好透析袋进行透析（透析液为PH 7.4 20mM PBS，体积为2L）； 3、4-8小时更换透析液一次，在每次换透析液前要先测量上一次透析液中残留AE发光值，当测量发光值在3000左右即可停止透析； 4、收集：将透析袋里的抗体取出至EP管中，用20mMPBS补充至一个定值，按标记抗体：抗体储存液=4:1的体积比例加入抗体储存液，再按加完储存液后的体积1：1加入甘油，然后贴好标签，并加上透明胶带，最后放置-20℃冰箱保存； 5、以标记好的抗体NP24-AE和NP24-BIO进行样品测试，验证标记抗体是否可用，并考察信噪比。 所用试剂： 标记液：PH 9.5 50mM CB 抗体储存液：PH 7.4 0.1M PBS+2％BSA+1‰Tween-20+2‰NaN3 注意事项： 1、加AE和BIO时应注意，应将AE和BIO加至离心管壁上，然后用CB将其冲散，最后与抗体混合，如果AE或BIO从管壁滑落与抗体结合，应弃用；
AP标记技术
碱性磷酸酶（AKP）标记抗体（戊二醛法） 1．取0.2ml AKP（含2mg），与0.1ml纯化的IgG（含1mg）混合，加PBS到0.5ml。2．在0.5ml AKP/抗体混合液中加4μl 25％戊二醛，室温放置2小时。 3．向反应物中加PBS到2ml，4℃中对PBS透析过夜。透析物用Tris缓冲液 （0.5mol/L Tris-HCl pH7.4，1mmol/L MgCl 2，0.04％ NaN 3 ，5％ BSA）稀释 到5ml，4℃可保存1年以上。 辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（过碘酸钠法） 1．取5mg HRP溶于0.5ml双蒸水中，加0.5ml新鲜配制的60mmol/L NaIO 4 水溶液，4℃中避光搅拌30分钟，加0.5ml 160mmol/L乙二醇水溶液，室温中继续搅拌30分钟。 2．加1ml纯化的IgG（5mg）水溶液，混匀后置透析袋中，对50mmol/L pH9.5的碳酸钠缓冲液透析6小时或过夜。 3．向透析物中加0.2ml 5mg/ml NaBH 4 水溶液，4℃搅拌2小时。继续4℃搅拌，20分钟内逐渐加入等体积饱和硫酸铵，再4℃搅拌30分钟。 4．4000×g离心30分钟，去上清液。用1ml 20mmol/L pH7.4磷酸缓冲液溶解沉淀物，对20mmol/L pH7.4磷酸缓冲液透析过夜。4000×g离心20分钟，除去不溶物。加上述磷酸缓冲液到5ml。鉴定标记物。 5．分装后冻干保存或加甘油到40％（v/v）分装后4℃或－20℃保存。1～2年活性不变。 6．测定标记物的OD 403和OD 280 。 标记率＝OD 403/OD 280 标记率应是0.3～0.6，即每个IgG结合1～2个HRP分 子。 酶含量（mg/ml）＝OD 403 ×0.4 IgG含量（mg/ml）＝（OD 280－OD 403 ×0.42）×0.94×0.62 标记物的克分子比值＝酶含量×4/IgG含量比值应在1～2之间。 用半乳糖苷酶标记抗体 1．取1mg纯化的抗体蛋白，溶于1ml含50mmol/L NaCl的0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液中。立即加入10μl含0.25mg MBS的四氢呋喃，30℃水浴1小时。
抗体FITC标记操作流程记录
1.目的 规范单克隆抗体标记荧光FITC (快速标记法）标准操作程序 2.适用范围 适用于本公司抗体标记荧光FITC (快速标记法）操作 3.术语和定义 单克隆抗体采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)。其标记原理: FITC 是在荧光素的基础上通过化学反应增加（异）硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记。 4.职责和权限 实验员负责实施本规范，主管负责人监督执行。 5.实验试剂. 5.1溶液配制
5.2其他试剂 6.操作流程 6.1抗体活化 将抗体用0.01mol/L PBS稀释为1mg/mL，加入mL 活化液(体积比为抗体溶液：反应活化液=10:1），旋涡振荡器混匀后，室温避光反应10min。 6.2与FITC反应形成共轭物 将抗体混合液（步骤6.1）加入mg FITC荧光素中（加入量：抗体与荧光素质量比为1:1），在室温条件下避光反应3小时，反应开始时间：至结束时间：；（或2-8度条件下避光过夜）。 6.3荧光淬灭 向共轭物（步骤6.2）中加入mL 淬灭剂（淬灭剂添加量按抗体体积：淬灭剂体积=10:1添加）。混匀后，室温孵育30分钟，去除游离的荧光素的荧光效应。淬灭开始时间：至结束时间：。
6.4透析 PBS中4度避光透析，3小时换液一次，连续透析8小时。或者PBS中4度避光透析过夜后换液一次，继续透析三小时。 6.5保存 收集得到的标记抗体（步骤6.4），上机测试后根据效价，用Storage Buffer 按比例稀释后，4℃避光保存，有效期一年。
荧光素标记抗体方法
荧光素标记抗体技术 (一)原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓ 收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素
计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。