黑曲霉Aspergillus niger对人参皂苷Re的微生物转化

黑曲霉Aspergillus niger对人参皂苷Re的微生物转化

目的：筛选长白山人参土壤中的活性微生物，转化单体人参皂苷产生稀有人参皂苷成份。方法：从长白山人参根际土壤中分离各类菌株，对单体人参皂苷Re进行微生物转化，通过硅胶柱层析等方法对转化产物进行分离纯化，采用波谱解析及理化常数对其进行结构鉴定。结果：从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株，3株真菌对三醇组人参皂苷Re具有转化作用，其中黑曲霉Aspergillus niger的转化活性较强，转化产物为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1。结论：首次报道黑曲霉能将人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1这一转化过程。

[Abstract] Objective: Samples of Ginseng root soils, collect from Changbai Mountain, are used to screen active microorganism which can transform Ginsenoside Re, so as to obtain rare anti-tumor components. Methods: The strains were isolated and screened on liquid transfer medium and yield transfer process for active strains. Then the active strains were tested for their biotransformation properties by using Ginsenoside Re. The biotransformation products were separated and purified through different column chromatographies and identified by spectral analysis and physical constants. Results: Total 68 fungal strains were isolated and 3 active strains showed positive activity on Ginsenoside Re. One strain, Aspergillus niger, was found to have the strong activity on Re. Conclusion: This is the first report on the transformation G-Re to G-Rg1, G-Rg2, and G-Rh1 by microorganism Aspergillus niger.

[Key words] Ginsenoside Re; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Rg2; Ginsenoside Rh1; Aspergillus niger; Biotransformation

人参及其制品中的主要活性成分是人参皂苷，由于人参皂苷分子结构中糖基侧链的不同而显示出不同的性质和药理活性[1-2]。例如人参皂苷Rb1有促进神经细胞生长的作用、降低细胞内钙、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注损伤等作用[3]；人参皂苷Rd能促进T细胞增殖，提高天然杀伤细胞（NK）的活性[4]；20（S）-原人参二醇苷元（PPD）具有抗癌活性[5]等。人参皂苷Re是抗心律失常有效成分，可抑制吗啡诱发小鼠产生的耐药性等作用；人参皂苷Rg1具有使中枢神经兴奋、抗疲劳、改善记忆、学习功能等作用[6]；人参皂苷Rg2可抑制兔血小板释放反应等作用。为了获得具有极高药用价值的稀有人参皂苷，从20世纪80年代始，国内外化学及生物技术工程研究人员便开始了人参皂苷的结构改造工程，并取得了很好的结果[7-13]。因此，从高含量人参皂苷成分获得稀有人参皂苷成分的工作备受关注。目前，用于人参皂苷糖基改造的主要方法有化学法、酶法和真菌代谢法[14-15]。真菌代谢法具有条件温和、不破坏皂苷结构、专属性、得率高、无污染等特点，被广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料

人参皂苷的神奇功效

人参皂苷的神奇功效 人参提取物及其衍生物事人参发挥抗致癌作用的物质基础。研究人员对人参皂苷Rh1、Rh2、Rg3、Rg5成分进行了筛选： 1、人参皂苷Rh1预防和抗肿瘤： 人参通过醇类萃取人参总皂苷，再分离人参二醇皂苷和人参三醇皂苷，其中三醇组通过固定话醇素水解分离纯化稀有皂苷Rh1。 单体Rh1具有促进肝细胞增值的作用，治疗和预防肝癌、肝硬化的作用，促进DNA合成。 2、人参皂苷Rh2预防和抗肿瘤： 人参皂苷Rh2是从人参中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体。它是生晒参加工红参时,由于某些原人参二醇组人参皂苷受热分解，配基上糖链断裂降解产生的次皂苷人参皂苷Rh2的提取次级人参皂苷，通常只有降解的办法才能得以实现。 人参皂苷 Rh2单体对癌细胞的生长有抑制作用,能诱导肿瘤细 胞凋亡，逆转肿瘤细胞异常分化，抗肿瘤转移，与化疗药物联用能起到增效减毒的作用。 除去抗肿瘤作用外，人参皂苷具有提高机体免疫力、抗菌、改善心脑血管供血不足、调节中枢神经系统、抗疲劳、延缓衰老等作用。

3、人参皂苷单体Rg3预防和抗肿瘤： Rg3对肿瘤细胞的抑制，首先是通过抑制肿瘤新血管生成。此作用在小剂量应用时即可产生，最适合预防肿瘤发生和肿瘤的复发、转移，并且无其他抗癌药物常见的毒副作用，完全可以长期使用。 Rg3在较大计量时还能抑制肿瘤瘤细胞的增殖、浸润，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，Rg3常常和放疗、化疗同时使用，可明显增强放疗、化疗效果，大大减轻其毒副作用，提高患者生活质量。 4、人参皂苷单体Rg5预防和抗肿瘤： 人参皂苷单体Rg5是二醇皂苷经过水解的产物。人参皂苷Rg5 可以显著降低肺癌的发生率。被认为是红参中抗癌的活性物质。

高效液相法测人参皂苷

以测Re、Rg1为例 1 色谱条件的选择 1.1采用C18（4.6mm×250mm，5um） 1.2流动相乙腈(A) - 水(B)，20:80 1.3流速1.0mL/min 1.4波长的选择（203nm） 以人参皂苷对照溶液在200 ~ 300nm 范围进行光谱扫描测定, 结果人参皂苷在nm 波长处有最大特征吸收, 选择nm作为人参皂苷的测定波长。 1.5温度30 1.6进样量10ul 2 溶液制备 2.1对照品溶液的制备精密称取干燥的人参皂苷Re对照品5.790mg 人参皂苷Rg1对照品6.325mg，置于50mL的容量瓶中，加入甲醇进行溶解并稀释至刻度，摇匀，后静置，即得对照品溶液( 其中含有人参皂苷Rg10.1235mg/mL，人参皂苷Re0.1028mg/mL)。 2.2 供试品溶液的制备取样品2g，至于具塞锥形瓶中，加甲醇5ml,超声10min,离心15min，转速为2500r/min，取上清液过滤，甲醇定容至5ml。加5ml水饱和正丁醇萃取两次，合并正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇定容至5ml。 2.3 阴性样品溶液的制备取缺少人参的其他药材，制成缺

少人参的阴性样品，再按照2.2项下的步骤制成阴性样品溶液。 3 系统适应性试验 取对照品溶液供试品溶液阴性对照品溶液按照1项下的色谱条件，分别将3种溶液以 10ul进样，测定分离度,均应≥1.5，色谱峰对称性，理论塔板数，说明空白对照样品的测定无干扰性。 4 线性关系考察分别精密取2.2项下的供试品溶液1、2、4、6、8、10、12 uL，按照1项下的色谱条件进样测定，以峰面积( Y) 对浓度( X) 进行线性回归，回归方程分别为( r=) 结果表明人参皂苷在g范围内线性关系良好。 5 精密度考察取2.1项下方法制备的对照品溶液10.0u L，在1色谱条件下依法重复进样6次，记录其峰面积，结果表明峰面积的RSD为%，表明其精密度良好。 6 稳定性考察取同一批供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、36、48h，精密吸取溶液10 uL，注入高效液相色谱仪中，按照1项下进行测定，记录色谱峰面积结果峰面积的RSD为%，表明样品溶液在48h内基本稳定。 7 重复性考察取同一批号的样品溶液，按照上述2.2项下方法得供试品溶液5份，按照含量测定法，分别精密吸取10u L，按照1色谱条件，测定峰面积，结果峰面积的RSD为%，表明该含量测定方法重复性良好。

提取人参皂苷并且检验以及在过程的一些注意事项

1.人参皂苷提取 人参为五加科植物人参(Panax ginseng)的干燥根，是传统名贵中药，始载于我国第一部本草专著《神农本草经》。其栽培者称为“园参”，野生者称为“山参”。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功能，用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷、心力衰竭、心源性休克等的治疗。 人参皂甙和稀HCl在醇液中进行温和酸水解，可得到三种皂甙元，齐墩果酸、人参二醇和人参三醇。而不能得到原人参二醇和原人参三醇，这是因为在酸水解过程中侧链的20－位碳原子上的羟基（－OH）与该链上的双键（C＝C）易闭环，而形成带有三甲基四氢吡喃环的人参二醇和人参三醇。水解后，除去醇、氯仿萃取物经硅胶柱层析分离即可得到三种单体皂甙元，经重结晶获得纯品，分别与已知皂甙的红外光谱相一致。 2.人参皂甙提取和甙元分离工艺流程 ①人参皂甙提取工艺： 人参茎叶粗粉20g 热水提取1小时，粗滤，（棉花） 提取液药渣 加0.6g是会乳沉淀，并调至PH9－10，放置10分钟，抽滤 沉淀物滤液 浓硫酸调PH7，放置10分钟。 中性提取液 回收后，上大孔树脂柱，先用水洗至无色，再用 70％氨性醇洗至绿色。 乙醇洗脱液 回收乙醇 人参总皂甙（黄白色） a)人参皂甙元的水解和甙元的分离流程 人参总皂甙 加含5％HCl的50％乙醇液， 加热回流2小时 沉淀水解液 （酸性皂甙元部分）加水稀释，水浴蒸去醇，氯仿萃取 3次（10，5，5ml）

水层氯仿层 干燥， 无水NaSO 4 回收氯仿 总皂甙元 少量苯溶解，硅胶柱 层析，用苯－乙酸乙脂 （8：2）洗脱 组分Ⅰ组分Ⅱ组分Ⅲ95％乙醇重95％乙醇重丙酮结晶 结晶3次结晶3次2次 齐墩果酸人参二醇人参三醇 mp299-301℃mp245-250℃mp244-246℃ 1.操作方法 人参总皂甙的提取：取人参茎叶粗粉20g，放入烧杯用热水（80℃－90℃）提取1小时，然后用棉花粗滤，在所得滤液中加入0.6g水石灰乳除杂并调PH9－10放置10分钟左右，过滤，再将滤液用浓硫酸（少量）调PH7，放置10分钟左右，回收提取液至少量（5－10ml），再上大孔树脂柱（注：此柱应提前洗好，清洗办法略）先用蒸馏水洗至无色，再用70％的乙醇洗至无色，分别用小瓶接收。便得到了乙醇洗脱液，回收乙醇，便得到了人参总皂甙（黄白色）。 人参皂甙的水解 称取人参皂甙（）4－5g（不足时由老师提供），加20倍量含5％HCl的50％乙醇溶液，加热回流2小时，放冷，加倍水，水浴去醇，转入分液漏斗中，用氯仿萃取3此（10，5，5ml），合并氯仿层，加少量无水硫酸钠干燥，回收氯仿即得总皂甙元。 甙元柱层析分离 称取100－200目硅胶（105℃活化30分钟）50g，用苯做洗脱剂湿法装柱，柱顶放一层脱脂棉，压上数个玻璃球，放出多余的苯（至高于吸附剂1cm），计算保留体积。总皂甙元用少量苯溶解上柱，用苯－乙酸乙脂（8：2）洗脱，薄层检识（与甙元标准品对照）相同组分合并，回收溶剂。齐墩果酸、人参二醇用95％乙醇重结晶，人参三醇用丙酮重结晶，纯品80℃干燥，收集于小瓶中。 2.人参皂甙的检验 （一）显色反应

【2018最新】关于人参皂苷体外转化和分析方法的研究进展-word版 (4页)

本文部分内容来自网络，本司不为其真实性负责，如有异议请及时联系，本司将予以删除 == 本文为word格式，下载后可编辑修改，推荐下载使用！== 关于人参皂苷体外转化和分析方法的研究进展 人参是五加科、人参属植物，其作为药材使用己有两千多年的历史，《神农本草经》《本草纲目》等古代医药书籍都详细的记述了人参的医用价值，一直被视为中药中的翘楚。研究发现人参中含有多种化学成分，如人参皂苷、多糖、酚性化合物、多肽及氨基酸、生物碱、维生素、挥发性油、微量元素、甾醇类及酶类等成分。 其中人参皂苷是人参的主要有效成分之一，它是由皂苷元与糖结合而形成的糖苷类化合物，含量约为4%。人参皂苷一般呈白色、无定形粉末，或无色、针状结晶，味微甘苦。人参皂苷按照苷元的结构不同可分为达玛烷型( Dammarene type ) 、齐墩果酸型( Oleanolic acid type) 和奥克梯隆型( Ocotillol type) 。达玛烷型人参皂苷又根据苷元上所连有羟基不同分为原人参二醇型( Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd 等) 和原人参三醇型( Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1) ; 而齐墩果酸型皂苷则是五环三萜型皂苷，人参皂苷R0是目前发现的唯一的该类皂苷。 一般人参所含有的皂苷中，齐墩果酸类皂苷占7% ～10%，原人参二醇类皂苷45 ～60%，原人参三醇类皂苷占12 ～20%。迄今为止，科学家们已分离出来200 多种人参皂苷和非皂苷成分并确定了它们的化学结构。此外，对人参皂苷药理作用的研究也较为广泛，研究表明人参皂苷具有抗肿瘤、抗衰老、抗血栓和动脉硬化、增强机体免疫功能、降血糖等作用。此外，研究发现某些人参皂苷对心肌缺血、烧伤创面愈合、人的精子活力等具有特殊疗效。 近代研究发现，人参中所含有的低极性、稀有人参皂苷具有更强的生物活性，更易被机体吸收，大量制备次级苷和苷元具有明显的药用价值和商业价值。但其在人参中含量极少，单纯的依靠提取分离技术很难满足工业化生产的需求。因此，利用体外转化方法制备人参皂苷具有深远意义。 1 常见的人参皂苷体外转化方法 人参皂苷的体外转化方法主要有物理方法、化学方法、酶水解法以及微生物转化法，其中微生物转化法又包括液体发酵法和固体发酵法。 1. 1 物理方法

人参皂甙体内代谢综述

人参皂甙体内代谢综述 方松 学号：201261930 人参又名人衔、棒锤，首载于《神农本草经》，被列为上品。系五加科植物人参Pana ginseng C．A．Mey．的干燥根。在我国的医药学中应用广泛，素有“中药之王”之称。主要产于吉林省长白山一带，是我国“东北三宝”之一。具有抗肿瘤、降血脂、促进细胞再生等多种生理活性。现就人参皂甙在体内代谢作简要综述。 1、人参皂甙分类 现代研究表明，人参中含有人参皂甙、多种氨基酸、糖类、低分子肽类、脂肪酸、有机酸、维生素B、维生素C、菸酸、胆碱、果胶、微量元素等。皂甙是人参生物活性的物质基础，从其皂甙元母核结构上主要分为以下三大类：（1）以原人参三醇为母体的糖甙，以Rg1为代表，为人参的主要成分。（2）以原人参二醇为母体的糖甙，以Rb1为代表，为西洋参的主要成分。（3）以齐墩果醇酸为母体结构的五元环皂甙Ro。 2、人参皂甙的药理活性 （1）对中枢神精系统的双向调节作用：人参能加强大脑皮质的兴奋过程和抑制过程，使兴奋和抑制二种过程达到平衡，使由于紧张造成紊乱的神经过程得以恢复，人参皂甙小剂量主要表现为对中枢的兴奋作用，大剂量则转为抑制作用。从人参所含的有效成分分折、人参皂甙Rb类有中枢镇静作用Rg类有中枢兴奋作用。 （2）人参的适应原样作用：人参对物理的、化学的、生物的各种有害刺激有非特异性的抵抗能力，可以使紊乱的机能恢复正常、主要表现为对血压、肾上腺、甲状腺机能和血糖等方面的双向调节作用。 （3）对免疫功能的用作：人参能增强机体的免疫功能。 在临床上人参主要用于休克、冠心病、心律失常、贫血、白细胞减少症、充血性心力衰竭，还常用于慢性阻塞性肺病、糖尿病、肿瘤、血小板减少性紫癜、早衰、记忆力减退等辅助治疗。 3、Rg1的体内代谢 早在1983年，日本学者Odani等在无菌大鼠灌胃实验中发现，原人参三醇型皂甙Rg1

人参皂苷的提取

第一章综述 人参皂苷的简介 人参为五加科植物人参(Panax ginseng)的干燥根，是传统名贵中药，始载于我国第一部本草专著《神农本草经》。其栽培者称为“园参”，野生者称为“山参”。人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神之功能，用于体虚欲脱、肢冷脉微、脾虚食少、肺虚喘咳、津伤口渴、内热消渴、久病虚羸、惊悸失眠、阳痿宫冷、心力衰竭、心源性休克等的治疗。 人参的化学成分很复杂，有皂苷、挥发油、糖类及维生素等。经现代医学和药理研究证明，人参皂苷为人参的主要有效成分，它具有人参的主要生理活性。 人参皂苷（ginsenoside，GS)是人参的主要有效成分，现已明确结果的GS单体约有40余种；在人参中的含量在4%左右。其中研究最多且与肿瘤细胞凋亡最为相关的为Rg3与Rh2。众多研究表明，它具有较高的抗肿瘤活性，对正常细胞无毒副作用，与其他化疗药物（如顺铂）联合应用有协同作用。人参皂苷通过调控肿瘤细胞增殖周期、诱导细胞分化和凋亡来发挥抗肿瘤作用。将肿瘤细胞诱导分化成正常细胞有利于控制肿瘤发展，诱导肿瘤细胞凋亡使细胞解体后形成凋亡小体，不引起周围组织炎症反应。Popovich等研究认为，人参皂苷可以促进人白血病细胞的凋亡，其途径与地塞米松相识，均为受体依赖性。目前我国对人参皂苷的提取分离方法、制剂工艺、抗肿瘤作用机制以及临床应用等方面做了大量研究，而且已经有人参皂苷的新产品推向市场。 人参皂苷成分 人参的根、茎、叶、花及果实中均含有多种人参皂苷(ginsenosides)。到目前为止，文献报道从人参根及其它部位已分离确定化学结构的人参皂苷有人参皂苷-Ro、-Ra1、-Ra2 、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc、-Rd、-Re、-Rf、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-Rh1、-Rh2及-Rh3 等50余种人参皂苷。 Rh2：具有抑制癌细胞向其它器官转移，增强机体免疫力，快速恢复体质的作用。对癌细胞具有明显的抗转移作用，可配合手术服用增强手术后伤口的愈合及体力的恢复. Rg：具有兴奋中枢神经，抗疲劳、改善记忆与学习能力、促进DNA、RNA合成的作用。 Rg1：可快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用。 Rg2：具有抗休克作用，快速改善心肌缺血和缺氧，治疗和预防冠心病。 Rg3：可作用于细胞生殖周期的G2期，抑制癌细胞有丝分裂前期蛋白质和ATP的合成，使癌细胞的增殖生长速度减慢，并且具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用。

人参皂苷的提取与分离 论文

人参皂苷的提取与分离 学生姓名 专业 班级

学院 摘要 首先认识人参和人参皂苷，了解人参皂苷的详细作用和功效，接着研究了人参茎叶总皂苷含量提取方法，用详细的工艺提取人参皂苷，并且用对显色反应和薄层层析对提取物进行鉴定，为以后的人参茎叶的开发利用奠定基础。 关键词：皂苷；人参茎叶；鉴定。 Abstract . The first ginseng and ginseng saponin, understanding the role and efficacy of ginseng saponin in detail, then study the effect of ginseng stem leaf total saponin extraction method, with the detailed process of extraction of ginseng saponin, and used for color reaction and thin-layer chromatography to extract were identified, for the future of ginseng stem and leaf development lays a foundation. key words: saponin; ginseng stems and leaves; appraisal;

目录 摘要 (1) Abstract ................................................................................................ 错误！未定义书签。1绪论 (3) 1.1人参概述 .............................................................................. 错误！未定义书签。 1.2人参的化学成分 (1) 1.2.1人参皂苷 (1) 1.2.2 人参蛋白 (1)

保健食品中人参总皂苷的含量测定方法研究

保健食品中人参总皂苷的含量测定方法研究 发表时间：2014-08-26T15:20:35.077Z 来源：《医药前沿》2014年第20期供稿作者：张高飞于玥邬晓鸥李军 [导读] 本文建立的方法简单、便捷，准确性、重复性好，可用于保健食品中人参总皂苷的含量测定。 张高飞于玥邬晓鸥李军 (深圳市药品检验所 518057) 【摘要】目的建立保健食品中人参总皂苷含量的测定方法。方法用水提取人参总皂苷类成分，经水饱和正丁醇萃取、氨试液洗涤除杂后，试样中的人参皂苷类成分在高氯酸的作用下与香草醛反应，产生特征的紫红色，在560nm下测定吸光度。结果人参总皂苷在0.0722～0.2165mg质量范围内与吸光度线呈良好的线性关系，平均回收率为95.9%。结论本文建立的方法简单、便捷，准确性、重复性好，可用于保健食品中人参总皂苷的含量测定。 【关键词】保健食品人参总皂苷分光光度法 【中图分类号】R93 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）20-0217-02 皂苷类成分是参类中的主要活性物质, 具有滋补强壮，增强免疫，抗疲劳的功效[1]，常用的检测方法为紫外分光光度法[2-5]。目前市售含参类的保健食品有片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等，均是以总皂苷含量来评价其产品的质量和功效。其测定方法大多都是按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中的方法检测[6]，在实际应用中，主要存在以下问题：1、固定的树脂柱载样量与不确定的样品总皂苷含量之间的矛盾，部分样品存在柱容量超载的情况，测定结果偏差严重。2、部分样品经过大孔树脂柱除杂后，仍存在干扰比色测定的杂质。3、操作步骤欠规范，导致测定结果重现性差。本文针对总皂苷的提取方式、以及测定过程中的参数进行研究，建立了保健食品中人参总皂苷的测定方法。 1 仪器、材料与试药 岛津UV2450紫外分光光度计；瑞士梅特勒XS105DU电子天平；上海一恒电热恒温水浴锅；人参皂苷Re(中检所，批号110754-200822，含量88.8%)；儿童装高丽红参液，舒灵胶囊，舒慰快牌胃肠液均购自市场；水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1供试品溶液的制备 固体试样：称取1 g样品，置100 mL容量瓶中，加水80 mL，超声提取30 min，放冷至室温，用水定容至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，进行萃取。 液体试样：吸取试样10 mL至分液漏斗中(含乙醇的保健食品，水浴挥尽乙醇)，加水至约25 mL，进行萃取。 在已处理好的试样中加入20 mL水饱和正丁醇，振摇萃取3次，取正丁醇层(必要时可离心)，合并提取液，用20 mL氨试液洗涤3次，置蒸发皿中100℃水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至25 mL量瓶中，甲醇定容，即得。 2.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取人参皂苷Re标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞比色管中，水浴挥干溶剂，加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸，使残渣溶解，于60℃水浴加热10 min，冰浴冷却后，精密加入冰乙酸5 mL，摇匀，于560 nm波长处测定吸光度。取供试品溶液1 mL于10 mL具塞比色管中，自“水浴挥干溶剂”起操作。 3 方法学考察 3.1线性关系 取人参皂苷Re对照品0.01804 g，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，作为标准溶液，精密量取标准溶液0.4、0.6、0.8、 1.0、1.2 mL分别置10 mL比色管中，水浴蒸干，显色，以对照品的质量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程：y=4.4807x－ 0.0886，r=0.9997。结果表明，人参皂苷Re对照品质量在0.0722～0.2165 mg之间与吸光度呈良好的线性关系。 3.2 萃取次数 取舒灵胶囊、儿童装高丽红参液，按2.1制备样品水提取液，用水饱和正丁醇分别萃取3、4、5次，结果表明，萃取3次可将人参总皂苷提取完全(表1)。 表1 萃取次数比较结果 3.3热稳定性考察 由于正丁醇沸点较高，为此对人参皂苷的热稳定性进行考察，以便选取合适的水浴温度。取人参皂苷Re标准溶液0.6 mL，分别按60℃、100℃水浴蒸干、100℃水浴蒸干后继续放置30 min处理，测定结果分别为0.663、0.658、0.653，表明人参皂苷的热稳定性良好，因此水浴温度选为100℃。 3.4显色稳定性 取人参皂苷Re标准溶液0.3 mL，显色后每隔10 min测定其吸光度，结果表明，显色后的紫红色溶液不稳定，吸光度呈下降趋势，因此显色完成后需在10 min内完成测定。 3.5重复性试验 取舒灵胶囊按2.1下方法制备6份供试品溶液，分别测定，结果表明本方法重复性良好(表2)。

天然产物的生物转化研究进展_冯冰

[20]　Liu N F,M eng https://www.docsj.com/doc/c06915904.html, paris on of inh ibitory effects on nonen zymatic glycosylation of in vitr o by Ginkgo biloba ex- tr act and other four drugs[J].Chin J New Dru gs Clin Rem (中国新药与临床杂志),2002,21(12):705-708. [21]　Liu X S,Xu Y J,Zh ang Z X,et al.Effect of ligus trazine on protein kin as e C signalin g path way in human peripheral blood lymph ocytes[J].Chin J P athop hosiol(中国病理生理杂志), 2003,19(4):507-510. [22]　Xu M B,Huang Y P,Sh eng S S,et al.Th e effect of admin- istered ligus trazine for the intracellu lar free calcium ([Ca2+])concentration in pancreatic acin ar cell[J].Chin J Tr adit West Med(中华中西医杂志),2003,4(5):655-657. [23]　Huang Y,Chen S Q,Zh ang G,et al.Effect of tetrom ethyl- pragin e and amin og uanidine on renal nitric oxide of diabetic rats[J].Chin J I ntegrated T rad it Wes t Nep hrol(中国中西 医结合肾病杂志),2003,4(5):265-267. [24]　Xi X H,J iang D Y,T ang L S,et al.T he protection of s ily- marin and anis odamine on growth and DNA ch an ges of b ovine retinal capillary pericytes cultured in glycos ylation products [J].J T rad it Chin O p thal(中国中医眼科杂志),2000,10 (4):187-190. [25]　Pu Y L,Liang X C.Effect of traditional Chinese med icine on diabetic nephropathy[J].J Chin Pr actical Med(中华实用医 学),2003,5(13):41-43. [26]　Zhao T F,Den g H C,Zhao J P,et al.Effect of s odium feru- late on nonenzymatic glycation of aortic collagen in diabetic rats[J].Chin J End ocriol Metab(中华内分泌代谢杂志), 2003,19(2):139-140. 天然产物的生物转化研究进展 冯　冰,马百平X (军事医学科学院放射医学研究所,北京　100850) 摘　要:以植物细胞培养、微生物和游离酶为生物催化剂的生物转化技术,广泛用于天然产物的合成和对先导化合物的结构改造,其反应包括水解、羟化、糖基化、酯化等多种类型,在生物转化体系的筛选、转化条件的优化、转化率的提高及酶的分离纯化方面取得了一些进展。这对于增加天然产物结构多样性、寻找药物先导化合物、促进珍稀物种资源可持续利用、提高生产效率、降低成本等多个环节均有广泛的应用价值。 关键词:天然产物;生物转化;微生物;游离酶;细胞培养 中图分类号:R282.1 文献标识码:A 文章编号:02532670(2005)06094105 Advances in studies on biot ransformat ion of natural pr oducts FENG Bing,MA Bai-ping (I nstitute of R adiation M edicine,Aca demy of Military Medical Sciences,Beijing100850,China) Key wor ds:natural products;biotr ansfor mation;microorganism;free enzyme;cell cultur e 生物转化(biotr ansfor mation)是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器,以及游离酶对外源性化合物(exogenous substrat e)进行结构修饰的生化反应。近年来,随着基因工程、细胞工程、酶工程技术的不断发展和完善,使该项技术广泛用于天然化合物的结构修饰和合成、有机化合物的不对称合成、药物前体化合物的转化、光学活性化合物的拆分和药物代谢研究等诸多领域。 酶及酶体系能将许多天然化合物转化为具有较高生物活性的物质。近年来开展的采用植物细胞、微生物和游离酶对天然化合物如人参皂苷、三七皂苷、大豆皂苷、甘草皂苷、甾体化合物等进行结构修饰的研究已取得可喜的进展。 1　水解作用 研究显示,糖链的结构对皂苷生物活性起着非常重要的作用。如含有从黄山药中提取的8种甾体皂苷的中药制剂——地奥心血康胶囊对冠心病、心绞痛、心肌缺血等症有显著疗效,其中皂苷结构上的差异只是糖链的不同;它们的苷元与薯蓣皂苷元类似,而薯蓣皂苷元却不具有上述疗效,反而有明显的细胞毒性作用。甾体皂苷是植物中一类重要的生物活性物质,具有多种生理活性。目前对其生物活性的研究已从溶血、抗生育等方面转向更有应用前景的抗癌、抗真菌、治疗心血管疾病、调节免疫以及治疗糖尿病等方面。由于甾体皂苷结构的复杂性,合成难度较大。通过生物转化的方法得到高活性、低毒性的甾体皂苷已成为该领域的发展趋势。 人参皂苷是人参中的主要活性成分。近年来,人参皂苷以其独特的生理和药理活性,特别是在抗癌、抗氧化及抗衰老方面的疗效使其成为最有开发潜力的化合物之一。由于含有不同糖链的人参皂苷生物活性和毒性不同,因此,希望通过酶的水解作用来对其进行结构改造,以获得高活性的人参皂苷。金东史等[1]利用人参皂苷-B-葡萄糖苷酶将人参中含量较高的皂苷——R b、Rc和Rd等原人参二醇类皂苷转化,得到具有高抗癌活性的人参皂苷R h2;董阿玲等报道了利用49种微生物菌株对人参皂苷Rg1进行生物转化研究,发现 X收稿日期:2004-09-20 *通讯作者　马百平(1966—),男,山东德州市人,博士学位,现于军事医学科学院放射医学研究所从事中药有效成分研究及新药研究开发。　T el:(010)66930265　E-mail:ma bp@s https://www.docsj.com/doc/c06915904.html,

总皂苷的测定方法

总皂苷的测定方法（分光光度法） 本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定。 本方法人参皂苷Re的最低检出量为2μg/mL。 一、方法提要 样品中总皂苷经提取、PT—大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色化合物，以人参皂苷Re为对照品，于560nm处比色测定。 二、仪器 1.722分光光度计。 2.PT—大孔吸附树脂柱（河北省津杨滤材厂）。 3.超声波振荡器。 三、试剂 1.甲醇（分析纯）。 2.乙醇（分析纯）。 3.人参皂苷Re标准品（中国药品生物制品检定所）。 4.5％香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至l00mL。 5.高氯酸（分析纯）。 6.冰乙酸（分析纯）。 7.人参皂苷Re标准溶液：精确称取人参皂苷Re标准品20.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，即每1mL含人参皂苷Re2.0mg。 8.重蒸水。 四、测定步骤 1.样品处理： （1）固体样品 称取1.0g左右样品于100mL烧杯中，加入20～40mL 85%乙醇，超声波振荡30min，再定容至50mL，摇匀，放置，吸取上清液1.0mL挥干后以水溶解残渣，进行柱分离。 （2）液体样品 含乙醇的酒类样品：准确吸取1.0mL样品放于蒸发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析；非乙醇类液体样品：准确吸取1.0mL样品（如浓度高或颜色深，需稀释一定体积后再取1.0mL）直接进行柱分离。 2.柱层析

以PT—大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取上述已处理好的样品溶液1.0mL上柱，用15mL水洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用20mL85%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，于水浴上蒸干，以此作显色用。 3显色 在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL 5％香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加0.8mL高氯酸，混匀后移入l0mL比色管中，塞紧盖子于60℃以下水浴上加温15min取出，冷却后准确加入冰乙酸5.0mL，摇匀后以1.0cm 比色皿、于560nm处与人参皂苷Re标准管同时比色。 4标准曲线的绘制： 吸取人参皂苷Re标准溶液（2.0mg/mL）0、20、40、60、80、100μL（相当于人参皂苷Re0、40、80、120、160、200μg），于10mL比色管中，用氮气吹干，同4.（3）显色步骤测定吸光度。并绘制标准曲线。 人参总皂苷浓度为20～200μg/mL之间与吸光度值呈线性关系，相关系数（r）0.999。 五、结果计算 式中X——样品中总皂苷（以人参皂苷Re计）（g/kg或g/L）； m——试样质量或试液体积（g或mL）； V1——样品提取液总体积（mL）； V2——样品提取液测定用体积（mL）； m1——从标准曲线查得待测液中人参皂苷Re量（μg）。

从西洋参中提取分离纯化人参皂苷Rb1和人参皂苷Re 的研究

从西洋参中提取分高纯化人参皂苷Rb1和人参皂苷Re的研究2.1 西洋参粗提液的制备 称取100g西洋参,粉碎成粗粉,用70%乙醇12倍量水浴加热回流提取3次(400mL×3),每次时间2h。提取液减压浓缩至50mL,得西洋参粗提液。HPLC检测发现,提取液中含有大量杂质,其主要成分有两种:人参皂苷Re(保留时间29.1min左右)和人参皂苷Rb1(保留时间50.3min左右)。人参皂苷Re与Rb1的质量分数分别为10%和60%。见图2。 2.2 人参皂苷Re与Rb1的初步纯化 西洋参粗提液用15倍量水(V/W)溶解上已处理好D101大孔吸附树脂柱(50×4cm,树脂为200g)。先用水洗柱,以去除大部分杂质, 再用2%NaOH溶液洗柱以除去色素,后用2% HCl溶液洗柱,再用水洗柱至流出液中性。最后用90%乙醇淋洗,收集流出液。回收溶剂至干,60℃减压干燥,得干燥疏松黄白色粉末6.0g,为西洋参总皂苷。HPLC检测, 人参皂苷Re与Rb1的质量分数分别为12.5%和65% 。 2.3 人参皂苷Re与Rb1的进一步纯化 西洋参总皂苷6.0g,用30mL70%乙醇溶解,加300mL丙酮搅拌, 析出大量沉淀,放置,过滤,沉淀干燥,得棕黄色干燥疏松粉末4.2g,为A部分。母液回收溶剂至干,得棕黄色疏松粉末1.8 g,为B部分。A部分中人参皂苷Rb1的质量分数提高到80%(人参皂苷Re下降为4.5% ),B部分中人参皂苷Re的质量分数提

高到40% (人参皂苷Rb1下降为30% )。见图3、图4。 2.4 人参皂苷Re和Rb1的再进一步纯化 A部分用20mL水溶解,加200mL丙酮搅拌,析出大量沉淀,静置, 过滤, 沉淀再用20mL水溶解,加200mL丙酮同法处理,静置过滤,60℃减压干燥,得黄白色干燥疏松粉末2.6g,为人参皂苷Rb1。HPLC 检测, 人参皂苷Rb1的质量分数为95% (人参皂苷Re为0.2% ), 见图6。A部分丙酮沉淀的母液回收溶剂至干, 得量1. 6 g, 与B 部分合并,用30mL95%乙醇溶解,加300mL丙酮搅拌, 析出沉淀,静置,过滤,母液回收至干,再用20 mL95%乙醇溶解,加200mL丙酮同法处理,过滤,溶液回收至干, 再用丙酮同法处理一次,过滤,回收溶液至干,60℃减压干燥, 得黄白色干燥疏松粉末0.5g, 为人参皂苷Re。HPLC 检测,人参皂苷Re的质量分数为92% (人参皂苷Rb1为3% ),见图7。 2.5 人参皂苷Re和Rb1晶体的制备 取质量分数为95%的人参皂苷Rb1 2.6 g, 用甲醇少量加热溶解, 冰箱放置析晶, 过滤, 甲醇再重结晶一次, 过滤, 60℃减压干燥,得2.0g白色沙状粉末。HPLC检测,质量分数为98.5% (收率2.0%)。取质量分数为92%的人参皂苷Re 0.25 g,用70%乙醇少量加热溶解,冰箱放置析晶,过滤,甲醇再重结晶一次,过滤,60℃减压干燥,得0.25g无色结晶。HPLC 检测, 质量分数为97.5%(收率0.25%)。

绞股蓝人参皂苷的提取工艺研究

收稿日期:2009-02-12;修回日期:2009-05-22 作者简介:李全良(1978-),男,河南商水人,讲师,硕士,从事有机合成方面的研究. 第26卷第5期周口师范学院学报 2009年9月Vol.26No.5Jo ur nal o f Zhoukou Normal University Sep.2009 绞股蓝人参皂苷的提取工艺研究 李全良,谢东坡 (周口师范学院化学系,河南周口466000) 摘 要:以沸水提取100g 绞股蓝茎叶,将提取液浓缩蒸干,得粗产品2107g.用95%的乙醇进行重结晶,可得纯绞股蓝人参皂苷1175g ,收率为1175%.用红外光谱、薄层色谱、熔点测定和定性分析对结果进行验证,结果表明,所得到的物质为绞股蓝人参皂苷.关键词:重结晶;绞股蓝;提取工艺 中图分类号:O 652 文献标识码:A 文章编号:1671-9476(2009)05-0076-02 绞股蓝(Gy nistemma P entap hy llum M ak in )又名七叶胆,属葫芦科植物,为多年蔓生草本植物,含有丰富的绞股蓝皂苷、黄酮、多糖、人体必需的8种氨基酸和多种微量元素[1,2].绞股蓝中所含的绞股蓝皂苷具有较高的药理性质.临床证明,它降血糖、降血脂显著,总有效率超过94%,效果超过德国进口药必降脂;治疗冠心病、心肌梗塞、心肌炎、心肌坏死显著;防治粥样动脉硬化,平衡血压效果显著;防治糖尿病显著[3].所以绞股蓝素有/小人参0的美称,因此绞股蓝有效成分的提取具有重要的意义. 目前,人们提取绞股蓝中有效成分(绞股蓝皂苷)的方法主要有:色谱柱法、回流法和超声波提取法[4-6] .这些方法虽能得到较好的收率,但是也存在明显的缺陷:色谱柱法程序多,操作复杂,浪费化学试剂等;回流法和超声波提取法对仪器的要求较高;等等.本文采用了热水溶液浸提,乙醇除杂、重结晶制得绞股蓝皂苷.该方法所用仪器简单,溶剂无毒性,提取出的人参皂苷纯度高、收率高,为以后的工业提取提供了一定的理论基础. 1 实验部分 111 实验仪器 旋转蒸发仪RE -52AA;傅立叶变换红外光谱 仪WQF -510;精密显微熔点测定仪X -6A .112 实验过程 称取绞股蓝干茎叶100g,用600m L 的沸水 浸泡3次,每次时间约为30min.将浸泡液在旋转蒸发仪上减压蒸发,得到黑色粘稠状浓缩液.向黑色粘稠状浓缩液中加入50m L,95%乙醇进行重结 晶,然后静置5h,有沉淀析出,过滤,干燥,得浅黄色粉末状物质2107g,再用95%乙醇进行重结晶,得土黄色提取物1175g ,收率为1175%. 2 结果与讨论 211 薄层检识 取适量土黄色干燥粉末,加入蒸馏水溶解,配成溶液.以氯仿-醋酸乙酯-乙醇-水(115B 4B 212B 1)作为展开剂[7] ,在薄层板上展开,对制得的土黄色物质进行纯度分析,把薄层硅胶板放入碘瓶中,所得结果显示土黄色物质为纯物质(一个点).通过薄层检识,分析所得土黄色物质为一个纯净物.212 熔点测定 取土黄色粉末状物质少许,利用X -6A 精密显微熔点测定仪测定其熔点大于380e .绞股蓝中含有十几种皂苷,其熔程比较宽,为139~303e ,而土黄色物质熔点则高于380e .由于混合物的熔点通常要低于其中任一种组分纯净物的熔点,可以分析出土黄色粉末是绞股蓝皂苷中一种熔点较高的纯净物. 213 绞股蓝人参皂苷定性分析 氯仿-浓硫酸反应法:取土黄色物质011g,放在50mL 烧杯中,加入氯仿1m L,使样品溶解,再滴加浓硫酸数滴,在氯仿和浓硫酸接触的两相界面

黑曲霉Aspergillus niger对人参皂苷Re的微生物转化

黑曲霉Aspergillus niger对人参皂苷Re的微生物转化 目的：筛选长白山人参土壤中的活性微生物，转化单体人参皂苷产生稀有人参皂苷成份。方法：从长白山人参根际土壤中分离各类菌株，对单体人参皂苷Re进行微生物转化，通过硅胶柱层析等方法对转化产物进行分离纯化，采用波谱解析及理化常数对其进行结构鉴定。结果：从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株，3株真菌对三醇组人参皂苷Re具有转化作用，其中黑曲霉Aspergillus niger的转化活性较强，转化产物为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1。结论：首次报道黑曲霉能将人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1、Rg2和Rh1这一转化过程。 [Abstract] Objective: Samples of Ginseng root soils, collect from Changbai Mountain, are used to screen active microorganism which can transform Ginsenoside Re, so as to obtain rare anti-tumor components. Methods: The strains were isolated and screened on liquid transfer medium and yield transfer process for active strains. Then the active strains were tested for their biotransformation properties by using Ginsenoside Re. The biotransformation products were separated and purified through different column chromatographies and identified by spectral analysis and physical constants. Results: Total 68 fungal strains were isolated and 3 active strains showed positive activity on Ginsenoside Re. One strain, Aspergillus niger, was found to have the strong activity on Re. Conclusion: This is the first report on the transformation G-Re to G-Rg1, G-Rg2, and G-Rh1 by microorganism Aspergillus niger. [Key words] Ginsenoside Re; Ginsenoside Rg1; Ginsenoside Rg2; Ginsenoside Rh1; Aspergillus niger; Biotransformation 人参及其制品中的主要活性成分是人参皂苷，由于人参皂苷分子结构中糖基侧链的不同而显示出不同的性质和药理活性[1-2]。例如人参皂苷Rb1有促进神经细胞生长的作用、降低细胞内钙、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注损伤等作用[3]；人参皂苷Rd能促进T细胞增殖，提高天然杀伤细胞（NK）的活性[4]；20（S）-原人参二醇苷元（PPD）具有抗癌活性[5]等。人参皂苷Re是抗心律失常有效成分，可抑制吗啡诱发小鼠产生的耐药性等作用；人参皂苷Rg1具有使中枢神经兴奋、抗疲劳、改善记忆、学习功能等作用[6]；人参皂苷Rg2可抑制兔血小板释放反应等作用。为了获得具有极高药用价值的稀有人参皂苷，从20世纪80年代始，国内外化学及生物技术工程研究人员便开始了人参皂苷的结构改造工程，并取得了很好的结果[7-13]。因此，从高含量人参皂苷成分获得稀有人参皂苷成分的工作备受关注。目前，用于人参皂苷糖基改造的主要方法有化学法、酶法和真菌代谢法[14-15]。真菌代谢法具有条件温和、不破坏皂苷结构、专属性、得率高、无污染等特点，被广泛应用。 1 材料与方法 1.1 材料

人参总皂苷

人参总皂苷 Renshen Zongzaogan TOTAL GINSENOSIDE GINSENG ROOT 本品为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根及根茎经加工制成的总皂苷。 【制法】取人参，切成厚片，加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，煎液滤过，合并滤液，通过D101型大孔吸附树脂柱，水洗脱至无色，再用60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.08(80℃)的清膏，干燥，粉碎，即得。 【性状】本品为黄白色或淡黄色的粉末；微臭，味苦；具吸湿性。 本品在甲醇或乙醇中易溶，在水中溶解，在乙醚或石油醚中几乎不溶。 【鉴别】(1)取本品0.1g，置试管中，加水2ml，用力振摇，产生持久性泡沫。 (2)取本品0.1g，加甲醇10ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参对照药材1g，加水100ml煎煮2小时，滤过，滤液通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1cm，柱高为15cm)，用水洗至无色，弃去水液，再用60％乙醇20ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇10ml 使溶解，作为对照药材溶液。再取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg1对照品与人参皂苷Re 对照品，加甲醇溶解制成每1ml各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录VI B)试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15：40：22：10)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置，日光下显相同颜色的斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点。 【检查】粒度依法检查(附录ⅪB第二法)，能通过120目筛的粉末不少于95％。 干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0％(附录ⅨG)。 总灰分不得过6.0％(附录ⅨK)。 炽灼残渣不得过6.0％(附录ⅨJ)。 重金属及有害元素照铅、镉、砷、汞、铜测定法(附录ⅨB)测定，铅不得过百万分之三；镉不得过千万分之二；砷不得过百万分之二；汞不得过千万分之二；铜不得过百万分之二十。 有机氯农药残留量照农药残留量测定法(附录ⅨQ有机氯农药残留测定)测定：六六六(总BHC)不得过千万分之一；滴滴涕(总DDT)不得过百万分之一；五氯硝基苯(PCNB)不得过千万分之一。 【特征图谱】照高效液相色谱法（附录VI D)测定。 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm，载碳量11％)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为每分钟1.3ml；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷’Re峰计算应不低于6000，按人参皂苷Rd峰计算应不低于200 000。 时间（分钟）流动相A(%) 流动相B(%) 0～30 30～35 35～60 19 19→24 24→40 81 81→76 76→60 参照物溶液的制备取人参皂苷Rg l对照品、人参皂苷Re对照品和人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，分别加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.3mg、人参皂苷Re 0.5mg和人参皂苷Rd 0.2mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备取本品30mg，精密称定，置10ml量瓶中，加甲醇超声处理使溶解