实验一 线粒体的超活染色

实验一线粒体的活体染色与观察

一、实验目的

1．观察动物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。

2．学习一些细胞器的活体染色技术。

二、实验原理

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部位，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子的，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它们具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。

线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

詹纳斯绿B（Janus green B）是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

三、实验仪器、材料和试剂

1．仪器：显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、

凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。

2．试剂：

（1）Ringer溶液

氯化钠0.85 g（变温动物0.65 g）

氯化钾0.25 g

氯化钙0.03 g

蒸馏水100 ml

（2）1 %、1/5 000詹纳斯绿B溶液

称取50 mg詹纳斯绿B溶于5 ml Ringer溶液中，稍加微热（30～40 °C），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1 % 原液。取1 % 原液1 ml加入49 ml Ringer溶液，即成1/5 000工作装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。

3．材料：

（1）小白鼠肝细胞。

（2）人口腔上皮细胞。

（3）洋葱鳞茎内表皮细胞。

四、方法与步骤

线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。

詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

1．人口腔粘膜上皮细胞线粒体的活体染色观察

（1）取清洁载玻片放在35～37 ℃恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5 000詹纳斯绿B染液。

（2）实验者用牙签宽头有自己口腔颊粘膜处用力刮取上皮细胞。将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15 min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。（3）在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可

见扁平状上皮细胞的核周围质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。

2．小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察

（1）用颈椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。

（2）在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加1/5 000詹纳绿B溶液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘染成蓝绿色即成（一般需染20～30 min）。

（3）吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。

（4）在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1～2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分状况。

3．洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察（选择）

（1）用吸管吸取1/5 000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎表皮，置于染液中染色10～15 min。

（2）用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。

（3）在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处。仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。

五、作业与思考题

1．绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布。

2．用一种活体染色剂对细胞进行活体染色，为什么不能同时观察到线粒体、高尔基体等多种细胞器？

常用染色剂及配制

常用染色剂及配制 供组织学诊断用的优秀常规染色剂，不仅须使细胞核和细胞浆有选择性着染，也要使结缔组织着色。苏木素-伊红染色的切片适当分色，可使这些结构得以区分，胞核表现为蓝色，胞浆和结缔组织纤维呈各种色调的粉红，因此这是一种最常用的常规染色剂。 一、苏木素-伊红染色的基本原理 苏木素是最早用于生物学上的天然染色剂之一，百余年来，一直是生物学实验室最常用的组织学中细胞核的染料，它是从苏木树的树心中提炼出来的，为浅褐色结晶或淡黄褐色的粉末状物。易溶于乙醇、甘油，也可溶于热水。苏木素本身没有染色能力，它经过氧化后，能产生具有染色能力的苏木红，苏木红又称为氧化苏木素或苏木因。 苏木素变成苏木红的过程叫作“成熟”。成熟的方法一般有两种：一种是把配制好的苏木素液在开口瓶中放置两个月以上，让其在日光和空气中的氧的作用下使之氧化。故一般地盛苏木素的瓶子放在向阳处，时间愈长，染色的效果愈好。常配制一大瓶，备长期使用。另一种方法是在苏木素液中加入氧化剂，如磺酸钠，过锰酸钾，氧化汞，双氧水等。用这种方法成熟与用第一种方法者不同的是，它放置时间愈长，染色的效果愈低。这是因为苏木红被继续氧化可生成无色的化合物，故一次不宜配制过多，还应放置40C冰箱内避光保存以延长使用时间。它的优点是配制后即可使用。 成熟的苏木素对组织并无亲和力，须加入含金属离子的媒染剂，才能达到染色的目的。一般用于明矾苏木素的媒染剂为钾明矾或氨明矾。主要是利用明矾中的铝离子和苏木红结合形成的铝沉淀色素为紫蓝色，对染色质有很大的亲和力，水和酒精都不能使其褪色。用于铁苏木素的媒染剂是三价铁离子，苏木红的铁沉淀色素为黑蓝色，不溶于水，因此，故不能配制大量含媒染剂的混合液，一般用时现配，或在染色过程中，先用铁明矾媒染，然后再染苏木素，如磷钨酸苏木素染色即是。 常规苏木素染色的对比染色是用伊红，也有采用焰红，因为焰红比伊红色泽更鲜明，此外还有采用橘黄G，比布里希猩红，波尔多红等作为对比染色。 苏木素-伊红染色，在组织病理学中，是一种日常使用最为广泛的常规染色方法。一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为病理诊断的确切依据。再根据此染色切片所见，分别进行不同的特殊染色。 二、染液的配制 在实验室内常用的苏木素染液有以下几种，不同的仅是染色时间以及比较每种染色方法彼此的优缺点，不过各有优劣。 （一）苏木素染液的配制方法如下 1.Harris氏苏木素液 甲液：苏木素1g 无水酒精10ml 乙液：硫酸铝钾20g 蒸馏水200ml 丙液：一氧化汞0.5g 经典的配制方法是，先将甲液加热溶解后，密封待用，再将乙液加热溶解至沸，去火，待溶液仍处于小沸腾状态时再将甲液徐徐倾入其中，全部混合后，再使溶液在短时间内加热至沸腾，去火，最后，将氧化汞缓慢倾入溶液中（氧化汞一定要慢慢少量分次加入，切忌急躁。因氧化汞倒入后，溶液会迅速膨胀易沸出容器外而发生危险。）此时液体变为深紫色，待氧化汞全部放入后，再将溶液加温至沸腾片刻，立即将溶液放入流动的冷水中，并缓缓地连续摇晃至溶液完全冷却为止。隔夜后过滤，加入冰醋酸（按5%比例）混匀，再过滤后保存于

实验室各种染料的配比

实验室常用染料性能介绍及常用药品试剂和培养基的配制 一、生物标本常用染料性能简介 （一）天然染料 1、苏木精苏木精是从南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。 苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。 2、洋红洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。 洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。 （二）人工染料 人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。 1、酸性品红酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。他是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。他跟甲基绿同染，能显示线粒体。 组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。 2、刚果红刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。他能作染料，也用作指示剂。他在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。他用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于他能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。 3、甲基蓝甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。他跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用他染色后不能长久保存。 4、固绿固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。他和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。 5、苏丹Ⅲ苏丹Ⅲ是弱酸性染料，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。 6、伊红这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。 7、碱性品（复）红碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。 8、结晶紫结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度8.75%）。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。 9、龙胆紫龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。 10、中性红中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度1.8%）。它的碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物

小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察实验报告

【实验题目】小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1.试剂：%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2.器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3.材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。

活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到 重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态--蓝绿色）；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原呈无色的色基（即无色状态）。 另外，中性红也属于碱性染料，对植物液泡系的染色有专一性。 【实验步骤】 一、大体流程 剪下合适大小的肝组织小块洗净 用詹纳斯绿B 染色20-30min 取着色部分加 Ringer 溶液制成悬 液 制片，高倍镜观察 断头法处死小 白鼠取肝组织

实验室做细胞常用染色word文档良心出品

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法、爬片前盖玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂（如Decon）浸泡5min,间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1 ％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥（至此即可用于普通染色）。 5、多聚L赖氨酸（1:10溶于去离子水）浸泡5min，振荡。 6入60C烤箱1 h,或室温过夜干燥（用于细胞化学、免疫细胞化学及原 位杂交细胞化学）。 、细胞固定常用方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、 对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。

2. 培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、 悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培 养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞， PBS 漂洗2?3次后，备固定制 对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后， PBS 液漂洗2?3 3. 常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定 称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味 铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇 (锇酸 )。另一类是用两种或 两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如 Mueller 固定液、 Flemming 固液、FAA 固定液、Carnoy 固定液、Rossman 固定液、Altmann 固定 液、Bouing 固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定 效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。 (1) 4%甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含 40%甲醛。在 很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。 4%甲醛-PBS 使组织变硬速 度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定 材料可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀， 能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和 高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用 40%甲 醛水溶液：PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 (2) 丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮 (4 °C )固定细胞内酶效果较 佳。 (3) 乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细 胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好 固定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的 适宜浓度为70%?100%。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。 片； 次， 以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 液， 酸、

线粒体的活体染色

实验四线粒体的活体染色 实验目的： 1.掌握线粒体的活体染色原理及方法。 2.熟悉在耳缘静脉用空气栓塞法处死兔子的方法。 3.了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。 实验原理： 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。 实验用品： 一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。 二、器材和仪器普通光学显微镜、手术器材一套、解剖盘、腊盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、20ml注射器、吸管。 三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、0.9%Ringer氏液(哺乳类用)。 实验内容和方法： 一、兔肝细胞线粒体的活体染色 （一）方法 1.用空气栓塞法处死兔子（见图4-1），置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（约2～3mm3大小）。 2.放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，再用吸管吸去Ringer 氏液。 3.在平皿内滴加1／300詹纳斯绿B（Janus green B）染液，，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成蓝色时即可，一般需要染色30分钟。染色期间翻动组织块几次，使其各表面均有机会接触空气和染液。 4. 染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，去除大组织块，就会

培养细胞常用染色与固定方法

培养细胞常用染色与固定方法 培养细胞常用染色与固定方法 一、普通染色观察 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般 形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS 或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴 于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min， 10min)，弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。（一）HE染色法 1.染液配制 (1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5.0g 铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用 很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。 (2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或 蒸 馏水即成工作液。 2.染色程序 （1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。 （2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。 （3）入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min，脱去胞质的着色。此时核呈紫红色。（4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱

碱性)长时间浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。 （5）蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。 （6）入伊红染液30s～1 min。 （7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％(2次) 各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。 （8）用二甲苯透明2次，各5min。 （9）树胶封固。 3.染色结果 细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。 （二）吉姆萨染色法 此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。 1.吉姆萨(Giemsa)染液的配制 （1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。 （2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。 （3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染 液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。 2.染色程序

常用染色液配方

实验室常用染色液配方 1、吕氏(Loeffler)美蓝染色液 A液：美蓝(Methylene blue) 0.3 克95%酒精毫升 B液：氢氧化钾(KOH) 0.01 克蒸馏水100 毫升分别配制A液和B液，然后混合即成。 2、齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液 A液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 克95%酒精10.O 毫升 B液：石炭酸(苯酚) 5.0 克蒸馏水95 毫升 将碱性复红溶于95%酒精中，配成A液。将石炭酸溶于蒸馏水中，配成B液。将两者混合即成。 3、结晶紫染色液(Huclker改订)A液：结晶紫(Crystai violet) 2.5 克95%酒精25.0 毫升 B液：草酸铵(NH4)2C2O4H2O 1.0 克蒸馏水100 毫升 将结晶紫研细后，加入95%酒精，使之溶解，配成A液。将草酸铵溶于蒸馏水，配成B液。两液混合即成。 4、路戈氏(LugoI)碘液(革氏鉴别染色用)碘1.0克碘化钾2.0克蒸馏水300毫升 先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，溶时可稍加热，最后加足蒸馏水量。 5、番红染色液(革氏鉴别染色用)番红O(Safranin O) 2.0克蒸馏水100毫升 6、孔雀绿染色液(芽孢染色用)孔雀绿(Malachite green) 5.0克蒸馏水100毫升先将孔雀绿研细，加少许95%酒精溶解，再加蒸馏水。 7、Dorner黑素液(英膜染色用)黑素(Nigrosin) 10.0克蒸馏水100毫升福尔马林(40%甲醛) 0.5毫升将黑素在蒸馏水中煮沸5分钟，加入福尔马林作为防腐剂，用玻璃棉过滤。 8、刚果红染色液刚果红(Congo red) 2.0克蒸馏水100毫升 9、稀释结晶紫染液(放线菌染色用)结晶紫染色液(同3) 5.0毫升蒸馏水95.0 10、乳酸石碳酸棉蓝染色液（真菌制片，短期保存）石炭酸10.0克甘油20.0毫升乳酸(比重l.21) 10.0毫升棉蓝0.02克蒸馏水10.0毫升将碳酸加在蒸溜水中加热溶化，加入乳酸和甘油，最后加入棉蓝，溶解即成。 11动物组织石蜡切片染色方法 苏木精-伊红(HE)染色：二甲苯Ⅰ, Ⅱ各10 min，依次进入无水乙醇、950 mL/L, 900 mL/L, 800 mL/L及700 mL/L的酒精各5 min，蒸馏水洗；入苏木精染液10 min，盐酸酒精分色4 s，自来水洗10 min；依次入700 mL/L, 800 mL/L及900 mL/L酒精各5 min，入伊红染液染色 10 min；入950 mL/L及无水乙醇Ⅰ, Ⅱ各5 min, 以二甲苯透明，中性树脂封片. 一、常用染色液的配制 ⒈碘-碘化钾（I2-KI）溶液能将淀粉染成蓝紫色，蛋白质染成黄色，也是植物组织化学测定的重要试剂。 配方：碘化钾2g ；蒸馏水300ml ；碘1g 先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300mL，保存在棕色玻璃瓶内。用时可将其稀释2-10倍，这样染色不致过深，效果更佳。 ⒉苏丹Ⅲ（sudanⅢ或Ⅳ）能使木栓化、角质化的细胞壁及脂肪、挥发油、树脂等染成红色或淡红色，是著名的脂肪染色剂。 配方：（1）苏丹III或苏丹Ⅳ干粉0.1g ；95％酒精10ml ；过滤后再加入10ml甘油（2）先将0.1g苏丹III或IV溶解在50ml丙酮中，再加入70%酒精50ml。 （3）苏丹III 70%乙醇的饱和溶液。 ⒊1％醋酸洋红（aceto carmine）酸性染料，适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。

高中生物 线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察 【实验目的】 掌握一 ...

线粒体(Mitochondrion)的活体染色 及电镜照片观察 【实验目的】 掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。 【实验用品】 一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。 二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml 注射器、吸管。 三、试剂 l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。 【实验内容】 一、兔肝细胞线粒体的活体染色 （一）原理 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 （二）方法 用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。 染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。 将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。 (三)结果 显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。 二、线粒体的光镜切片观察 用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。 三．线粒体的电镜照片观察 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。 这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长

分子实验室、细胞实验室常用配方

分子实验室、细胞实验室常用配方

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(一)WB相关试剂及常用缓冲液 ●RIＰA（１０0mI）(最后要调pH为７.4） 终浓度分子量称取 50mM 1２1.14 60５．7mg Ｔｒｉs-HCI（pH ７.4) NaCI １50 ｍＭ５8.4４87６.６ｍg TritｏnＸ-1０0 1% 1mI 脱氧胆酸钠1％１g EDTA １mM 292.24８２９.224８mｇSＤS 0．1％０.1g ＰMSF（１00ｍM) 使用时每1ｍl加１ ０ｕl ●10%过硫酸铵溶液AP（分装保存于-20度) AP粉末 1ｇ ddＨ2０ 10mｌ ●1０%SDS(十二烷基硫酸钠）： SＤＳ粉末１0g ｄdH20定容到 100ml 注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡 ●6X蛋白质sample buffer Tris-HCl(１M,ｐH6.８) 30ｍL ＳＤＳ10ｇ 甘油 30ｍL DTT（1５4.２5）９.3g 溴酚蓝０．０6g dd H2０定容至10０mＬ ●10XPBＳ缓冲液的配制： ＮaCｌ 80g KCl 2g Ｎa2ＨPＯ4 14．4ｇ(十二水合36g） KH２PO40 2.４g 加800 mLddH2O,根据开始的pH用ＮaOH或ＨCL调pH到７.4,调好pH再定容到1升。配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度 ●PBSＴ(1X) ＰBS(1X） 500ml Tweeｎ 2０５０0μｌ ●5０×Tris－乙酸（TＡE）缓冲液配制1Ｌ溶液各成分的用量 Ｔris粉末 2４2ｇ 冰醋酸 57.１ｍl Nａ2EDTA·2H2O 3７.２g

常用染色液的配制

常用染色液的配制 1.吕氏（Loefflev）美蓝染色液 A液：2%美蓝（Methylene blue）95%酒精溶液 B液：10%KOH溶液 取A液30ml、B液0.1ml与100ml蒸馏水混合。 2.石炭酸复红染色液 A液：4%碱性复红（basic fuchsin）95%酒精溶液 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解、 配成A液。 B液：5%石炭酸溶液 取A液10ml、B液90ml混合即可。一般可将此溶液稀释5-10倍使用。 但稀释液易变质失效，一次不宜多配。 3.革兰氏（gram）染色液 （1）草酸铵结晶紫染液： A液：1%结晶紫（Crystal violet）95%酒精溶液 B液：1%草酸铵（Ammonium oxalate）溶液 取A液20mlB液80ml，静置48/小时后使用。 （2）路哥氏（Lugol）碘液： 碘片1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液另，待碘全部 溶解后，加够水即成。 （3）95%酒精溶液 （4）蕃红（沙黄）复染液： 2.5%蕃红（Safranlne O）95%酒精溶液。 取此液10ml与90ml蒸馏水混匀即成。 4.芽孢染色液 （1）5%孔雀绿(Malachite green)溶液。 （2）0.5%蕃红溶液。 （3）苯酚品红溶液 称取11g碱性品红溶于100ml无水酒精中。 再取上述溶液10ml与100ml 5%的苯酚溶液混合，过滤备用。 （4）黑色素(nigrosin)溶液 10%黑色素溶液，置沸水浴中30min后，滤纸过滤二次，补加水到100ml，

常用染色剂

常用染色剂 实验室常用染料性能介绍及常用药品试剂和培养基的配制 生物标本常用染料性能简介 （一）天然染料(Natural Dyestuff) 1、苏木精苏木精是从南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。 苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。 2、洋红洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。 洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。 （二）人工染料(Synthetic dyestuff) 人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。 1、酸性品红酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。他是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。他跟甲基绿同染，能显示线粒体。 组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。 2、刚果红刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水和酒精，遇酸呈蓝色。他能作染料，也用作指示剂。他在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。他用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可

常用染色液的配制

附录二：常用固定液和染色液的配制 常用染色液的配制 1. 番红水液 番红0.1g溶入蒸馏水,定溶至100ml。 2. 番红酒液 番红0.5g或1g溶入50%酒精,定溶至100ml。 3. 固绿染液 固绿0.1g溶入95%酒精，定溶至100ml。 4. 碘-碘化钾染液 碘化钾溶入100ml蒸馏水，再加入1g碘，溶解后即可使用。 5. 苏丹Ⅲ（或Ⅳ）染液 将0.1g苏丹Ⅲ或Ⅳ溶解在50ml丙酮中，再加入70%酒精50ml。6.改良苯酚品红染液 原液A：将3g碱性品红溶入100ml 70%酒精，此液可长期保存。原液B：将10mlA液加入到90ml 5%苯酚水溶液中。 原液C：将55mlB液加入到6ml的冰醋酸和6ml的38%的甲醛中。染色液：取C液20ml，加45%冰醋酸80ml，充分混匀，再加入1g 山梨醇，放置14天后使用，可保存3年。 7. 间苯三酚染液 将5g间苯三酚溶入100ml 95%酒精（若溶液呈黄色，即为失效）。 8. 中性红染液

将0.1g中性红溶入100ml蒸馏水，用时稀释10倍。 9. 钌红染液 将5~10mg钌红溶入25~50ml蒸馏水，现用现配。 10.龙胆紫染液 将0.2g龙胆紫溶入100ml蒸馏水。现常用结晶紫代替。必要时可将医用紫药水稀释5倍后代用。 11.铁醋酸洋红染液 先将100ml 45%醋酸水溶液置入200ml的锥形瓶中煮沸，移去火苗，然后慢慢地分多次加入1g洋红粉末（切记不可一次倒入）。待全部倒入后，再煮沸1~2min，并悬入一生锈的小铁钉于染液中，过1min 后取出，使染色剂略含铁质，以增加染色性能。静置12h后过滤于棕色瓶中备用（置于避光处）。 12.苏木精染液 苏木精的配方很多，常用的有如下3种： 配方Ⅰ：苏木精水溶液 0.5g苏木精溶入100ml煮沸的蒸馏水中，静置24h后可使用。 配方Ⅱ：代氏苏木精（Delarfield’s haematoxylin） 甲液：苏木精1g + 无水酒精6ml 乙液：硫酸铝铵（铵矾）10g + 蒸馏水100ml 丙液：甘油25ml + 甲醇25ml 分别配制甲、乙两液，将甲液一滴滴地加入乙液中，充分搅拌后，放入广口瓶中用纱布蒙住瓶口，置于温暖和光线充足处7~10天，再加

线粒体詹姆斯绿染色

线粒体染液-詹姆斯绿B Janus green B的使用及其原理60 JanusgreenB中文名称：詹纳斯绿B英文名；小鼠肝细胞线粒体的JanusgreenB染色及观；1.实验目的：学习超活染色的原理及方法，用詹纳斯；（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、；（2）实验药品：蒸馏水、Ringer液、詹纳斯绿；（1）活体染色又称超活染色，是指对生命有机体的细；目的：显示生活中细胞的某种结构，不影响细胞的生命；应用：研究 Janus green B 中文名称：詹纳斯绿B 英文名称：Janus green B 别名：健那绿；双氮嗪绿。苏铁木精英文别名: Janus green；Diazine green；Diazine green S 。化学式：C30H31N6Cl 定义：主要用于生物活体染色的一种碱性偶氮吖嗪染料。能穿过细胞膜，进入细胞特异地显示线粒体。詹纳斯绿B是一种活体染色剂，专一用于线粒体的染色。它可以和线粒体中的细胞色素C氧化酶结合，从而出现蓝绿色。原理是线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。必须指出的是，只有具有活性的细胞色素C氧化酶才能够把詹纳斯绿B氧化，从而使它显出颜色，因此，在实验过程中务必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料置于0℃～4℃的冰水浴低温中，并且操作要迅速。Cas 编号: MDL 编号: 分子式: 中文别名: 2869-83-2 MFCD00011758 C30H31ClN6 EINECS 编号: 220-695-6 Beilstein 编号: 分子量: 511.06 詹姆斯绿B，健那绿，健那绿B，双氮嗪绿，真那氏绿，詹姆斯绿，烟鲁绿，3-(二乙基氨基)-7-[[4-(二甲基氨基)苯基]偶氮]-5-苯基吩嗪翁氯化物3-Diethylamino-7-(4-dimethylaminophenylazo)-5-phenylphenazinium 英文别名: chloride Diazin Green S Union Green B C.I. 11050 棕色呈深棕色结晶性粉末，溶于水呈蓝色，微溶于醇。常用作线粒体专一性活体性状: 染色剂. 线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态. 用途: 贮存: 联合国编号: Risk: Safety: Hazard: 用于线粒体活体染色，真菌和原虫染色，胚胎切片染色，以及用作氧化还原指示剂和铜的电镀添加剂。密封干燥保存。S24/25 小鼠肝细胞线粒体的Janus green B染色及观察 1. 实验目的：学习超活染色的原理及方法，用詹纳斯绿B给小鼠的肝细胞线粒体染色。 2. 实验用品： （1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、双

实验室做细胞常用染色

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法 一、爬片前盖玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。 5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。 6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。 二、细胞固定常用方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 ..

1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。 (1)4％甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 ..

常用染色剂的配方

常用染色剂的配方 常用染色剂的配方 （一）天然染料 1、苏木精（Hematoxylin）苏木精是从南美的苏木（Haematoxylon campechianum）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。 2、洋红（Carmine）洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出胭脂红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。 3、靛蓝洋红（Indigo carmine）是由木蓝（Indigofera）提出的靛蓝（Indigo）加上亚硫酸钠而成。为蓝色酸性染料，作为细胞质的染色剂。常与苦味酸合成苦味酸靛蓝洋红（picro-indigo-carmine），呈绿色，可与碱性品红作对比染色。 4、地衣红（Orcein）是由地衣（Lecanora parella）中取得的染料，可在酸性或碱性溶液中染色。植物细胞学中应用较多，尤其对于某些植物的染色体染色，效果比醋酸洋红更好。配制方法与洋红相似，通常也多溶入醋酸中（2.2％）染色。现在已多用其人工合成染料。 （二）人工染料 人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。 1、酸性品红（Acid fuchsin）酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染，能显示线粒体。组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色

细胞染色

细胞染色 （1）消化收集细胞，以2-10×103 cell/coverslip 接种细胞于24孔板中，滴加细胞悬液50-100μl，2小时后补加10%FBS+DMEM500μl （2）37℃细胞培养箱中培养48小时后，显微镜下观察，取细胞状态和细胞数量适应的玻片做染色。 （3）去掉旧培养液，用冰冷的PBS洗两次，加3.7-4%甲醛0.5ml（in PBS）室温固定10min （4）PBS洗两次，加穿膜液0.5ml（0.1％triton X-100+0.1M Gycine）冰上30min （5）PBS洗两次，加5mg/ml BSA 0.3ml室温封闭1小时。 （6）PBS洗两次，取一张封口膜，做好标记，加一抗（用5mg/ml BSA稀释1：50-100）25μl于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一抗液滴上，放在湿盒中室温孵育1-3小时 将盖玻片从封口膜上小心夹起，细胞面朝上放入原来的24孔板中，PBS洗两次，取另外一张封口膜，做好标记，加二抗（羊抗兔罗丹明，用5mg/ml BSA稀释1：50-100）25μl 于封口膜上，将盖玻片细胞面朝下反扣在一{二}抗液滴上，放在湿盒中室温黑暗中孵育1-3小时 （7）同上PBS洗两次，同上操作，将玻片与10μl DAPI (1μg/ml in PBS，贮存液：1mg/ml in dd H2O) 室温孵育1－5min. （8）PBS 洗三次，将玻片背面的水分擦干，封片于载玻片上，做好标记（时间，细胞名称，实验内容，号码） （9）待封片胶干后可在荧光显微镜下观察，观察时注意记录每张玻片的内容以免混淆，观察完后将玻片放－20℃保存。 （10）若只观察转染了EYFP的荧光蛋白，不需要给内源蛋白染色，可直接用DAPI染核后封片。 （11）以BSA (5mg/ml)代替一抗，二抗照加为染色的对照组，做法同上。为了保证实验有重复性，每次做平行2组以上。 10. 盖玻片的处理 （1）10×10的盖玻片用医用酒精浸泡过夜(若玻片较脏，可浸泡酸液过夜，用自来水冲洗十几遍后用双蒸水冲三四遍，晾干，用酒精泡过夜，以下步骤同) （2）将酒精倒掉,晾干。 （3）准备干净塑料15ml离心管，用蒸馏水稀释多聚赖氨酸1：10后室温浸泡盖玻片5min （如果室温小于15℃时延长至10min）,捞出后于工作台晾干后，密封后可保存半年以上。 （4）上述稀释液可反复浸泡，一般每瓶多聚赖氨酸可够100－200张玻片使用，稀释液保存于4℃，三个月内仍可使用。 1、DAPI的目的是什么？看核？凋亡？转荧光蛋白以观察在核中的分布？ 2、玻片是否是细胞培养之前加入到孔板中的？或者不用孔板用皿代替的话是一样 的？ 3、封片如何进行？ 4、第一步为什么先取细胞滴液，两小时后添加培养基？是否是为了让细胞更好的贴到 玻片上？