第7章分子发光分析法

第7章分子发光分析法

7.1 内容提要

7.1.1 基本概念

分子发光分析法——分子吸收一定的能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光，以此建立起来的分析方法称为分子发光分析法。

光致发光——物质吸收光能而激发发光的现象，称为光致发光。

电致发光——物质吸收电能而激发发光的现象，称为电致发光。

化学发光——物质若吸收化学反应能激发发光，称为化学发光。

生物发光——发生在生物体内有酶类物质参与的化学发光称为生物发光。

单重态——一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用“S”表示。

三重态——在激发态分子中，两个价电子自旋平行的电子态称为三重态，用“T”表示。

图7-1 单重态系三重态激发示意图

无辐射跃迁——当激发态分子返回基态时，如果不伴随发光现象，则此过程称为无辐射去激或无辐射跃迁。它包括：振动驰豫、内转换和系间窜跃。

振动驰豫——同一电子能级内，激发态分子以热能交换形式将多余的能量传递给周围的分子，并由高能级回到低能级的跃迁，称为振动驰豫。

内转换——同一多重态的不同电子能级间发生的无辐射跃迁称为内转换（或内转移）。

系间窜跃——不同多重态之间的无辐射跃迁称为系间窜跃。

分子荧光——分子从S

1态的最低振动能级跃迁至S

态各振动能级时

所产生的辐射光称为分子荧光。

图7-2分子荧光、磷光光谱产生过程示意图

斯托克斯位移——分子发射荧光的波长总比激发光长，能量比激发光小，这种现象称为斯托克斯位移。

分子磷光——当受激分子降至S

1

的最低振动能级后，如果经系间窜

跃至T

1态，并经T

1

态的最低振动能级回到S

态的各振动能级，此过程辐

射的光称为分子磷光。

延迟荧光——某些物质的分子跃迁至T1态后，因相互碰撞或通过激活作用又回到S1态，经振动驰豫(VR)到达S1态的最低振动能级再发射荧光，这种荧光称为延迟荧光，也叫慢速荧光。

荧光激发光谱——固定发射光（第二单色器）波长，改变第一单色器（激发光）波长，获得以激发光波长为横坐标，荧光发射光强度为纵坐标的谱图，即为荧光激发光谱。

荧光发射光谱——固定激发光（第一单色器）波长，使激发光波长和强度保持不变，然后改变第二单色器（荧光发射）波长，从200～700nm 进行扫描，获得以发射光波长为横坐标，发射光强度为纵坐标的谱图，即为荧光发射光谱。

荧光猝灭——荧光分子与容剂或其他物质作用使荧光强度减弱的现象称为荧光猝灭，能使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。

瑞利散射光、拉曼散射光——溶剂分子吸收能量较低的光线后，不

足以使分子中的电子跃迁到较高的电子激发态，而只是上升到基态中较高的振动能级，如果在极短的时间内（10-15～10-12s）返回到原来的振动能级，发出与激发光波长完全相同的光称为瑞利散射光(Rayleigh scattering)。如果返回到稍高或稍低于原来的振动能级，则产生分布在瑞利线两边的稍长（红伴线）或稍短（蓝伴线）的拉曼散射光。

电生化学发光——靠电极过程诱发溶液的化学发光称为电生化学发光（ECL）。

重原子效应——荧光分子的芳环上被F，Cl，Br，I取代后，使系间窜跃加强，其荧光强度随卤素相对原子质量的增加而减弱，磷光相应增强，这种效应称为重原子效应。

7.1.2 基本内容

1.分子荧光激发光谱的特征

荧光物质的激发光谱反映了激发光波长与荧光强度之间的关系，为荧光分析选择最佳激发光提供依据。激发光谱具有以下特征：（1）第二单色器不论怎样改变固定波长，同一荧光物质激发光谱的性质在其他条件一定时并不改变，变化的只是曲线高低，即测定的灵敏度发生变化。（2）同一物质的最大激发波长与最大吸收波长一致，这是因为物质吸收具有特定能量的光而激发，吸收强度高的波长正是激发作用强的波长。

2.分子荧光光谱的特性

荧光光谱的形状与激发波长无关，由于分子无论被激发到高于S1的哪一个激发态，都经过无辐射的振动驰豫和内转换等过程，最终回到S1态的最低振动能级，然后产生分子荧光。因此，荧光光谱与荧光物质被激发到哪一个电子能级无关。

3.荧光量子产率φf

荧光量子产率φf反映了荧光物质发射荧光的能力，其值越大物质的荧光越强。

φf =发射的光子数/吸收的光子数

荧光物质的φf通常大于0小于1。

4.荧光强度的主要影响因素

（1）荧光强度与浓度荧光物质浓度很稀时，所发射的荧光相对强度I f可用下式表示：

'f f 0I K I kcL φ=

当测定体系和测定条件确定之后，'K ，f φ，0I 以及摩尔吸收系数k 和

液层厚度L 均为常数，设'f 0K K I kL φ=，则

f I Kc =

荧光分析是微量组分或痕量组分分析法，当荧光物质的浓度增至吸光度A (A =kcL )≥0.05时将产生显著的浓度效应，使荧光强度I f 与浓度c 的关系偏离线性。

（2）荧光与分子结构 通常，强荧光分子都有大的共轭π键结构、给电子取代基和刚性平面结构等，而饱和的化合物及只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。

（3）荧光猝灭 荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。静态猝灭的特征是基态荧光分子M 和猝灭剂Q 发生反应，生成非荧光性物质MQ ，使M 失去荧光特性：

M + Q MQ

动态猝灭的特征是激发态M *和Q 碰撞，发生能量或电子转移从而失去荧光性，或生成瞬时激发态复合物MQ *，使荧光分子M 的荧光猝灭。与静态猝灭不同，动态猝灭通常并不改变M 的吸收光谱。

λex M M * + Q MQ * MQ(无辐射跃迁)

MQ + λem (荧光)

（4）温度、酸度和溶剂的影响 温度降低，f φ和I f 均增大。荧光物质如果是弱酸或弱碱，pH 的改变会影响其形体分布和荧光强度，因此，可以用控制酸度的办法提高荧光分析的灵敏度和选择性。

溶剂的改变会使荧光物质的f φ发生变化，或导致其他副反应的发

生，既是有利因素也是不利因素。

（5）表面活性剂的影响 在水溶液中，当单体表面活性剂浓度增大到临界胶束浓度（CMC ）时，便会缔合为球状胶束，它的存在使荧光分子处在胶束溶液更有序的微环境中，对荧光质点起到了保护作用，降低了荧光猝灭和非辐射去激，使f φ明显增大。胶束增敏作用具有较强的

选择性。

5. 荧光分析仪器

荧光分析仪器通常由光源、单色器、样品池、狭缝、光电倍增管（PMT）等部件组成。常用的光源是高压汞灯和氙弧灯。大多数荧光分光光度计采用光栅作为单色器，它具有较高的灵敏度、较宽的波长范围，能扫描光谱。样品池通常是石英方形池，四面都透光。

图7-3 荧光分析基本装置方框图

荧光分光光度计多采用光电倍增管（PMT）为检测器。读出装置包括记录仪、阴极示波器和显示器等。

φ和摩尔吸收系数k的乘积表示的灵敏度称荧光物质的量子产率

f

为仪器的绝对灵敏度，用b表示。

φk

b =

f

b值越大，方法的灵敏度越高。

目前，仪器的灵敏度趋向于用纯水的拉曼峰信噪比（S/N）表示。

6.化学发光分析法的基本理论

一个反应要成为化学发光反应，必须满足如下基本要求：

（1）化学反应必须提供足够的化学能，且被发光物质吸收形成电子激发态。

（2）吸收化学能处于电子激发态的分子返回到基态时，能以光的形式释放出能量，或把能量转移到一个合适的接受体上，该接受体能以光的形式释放能量，产生敏化化学发光，用于分析上的液相化学发光体系很多，但研究和应用的比较广泛的有鲁米诺(Luminol)、光泽精(lucigenin)和过氧草酰类(peroxyoxalate)。

7.影响化学发光的主要因素

主要影响因素有溶液的酸度、试液的注入速率和干扰物质。酸度影响待测物质和发光体的存在形态，或发生其他副反应，对发光体系产生严重影响。每个发光体系的最佳控制酸度应该通过实验确定，并严加控制。试液的注入速率越大，发光强度变化也越大。微量干扰物质存在就会引起污染，导致化学发光测定失败。

8.生物发光分析的特点

生物发光分析将酶反应的专一性和化学发光的高灵敏性巧妙结合，在温和的自然条件下能以较高量子产率产生连续的冷光辐射，具有灵敏度高、选择性好的显著特点。

9.分子发光分析法的应用

（1）无机化合物的荧光分析目前，利用各种有机试剂和各种荧光分析技术可对Ca2+、Mg2+、K+、Na+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、F-、Cl-、Br-、I-等近70种元素进行灵敏的测定，也可以分析氮化物、氰化物、硫化物以及氧、臭氧及过氧化物等。

（2）有机化合物的荧光分析目前，在生物活性物质的测定方面，荧光分析显示了它广阔的应用前景。如可以测定某些醇、肼、醛、酮、酯、脂肪酸、酰氯、糖类、多环芳烃、酚、醌、叶绿素、维生素、蛋白质、氨基酸、尿素、肽、有机胺类、甾类、酶和辅酶等数百种有机化合物，尤其以核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）的荧光分析显得极其重要，因为它们起着存储、复制和传递遗传信息的作用，决定着细胞的种类及其功能。

在药物、毒物分析方面，荧光法可以测定青霉素、四环素、金霉素、土霉素等抗菌素在饲料、蛋、奶、肉等样品中的残留，也可以测定粮食、油料等食物中的黄曲霉、棒曲霉素、赭曲霉等毒素。有机磷类农药和氨基甲酸酯类农药，在一定条件下也可以用荧光法进行测定。

10. 化学发光分析法的特点及应用

化学发光分析法具有灵敏度高、线性范围宽、设备简单、分析速度快且易实现自动化等显著优点。已广泛应用于生物科学、食品科学、药物检验、微生物学、临床和免疫分析、环境检测、农林科研等领域，可以测定甲醛、甲酸、H2O2、葡萄糖、氨基酸、多环芳胺类化合物、丙酮、羟胺、果糖、维生素C、谷胱甘肽、尿素、肌酸酐、多种酶和Fe2+、Fe3+、Cr3+、Mn2+、Ag+、Pb2+、Bi3+、Zn2+、Mo6+、V5+金属离子等大量物质。

7.2 习题解答

1.处于单重态和三重态的分子其性质有何不同？为什么会发生系间窜跃？

答：对同一物质，所处的多重态不同其性质明显不同。第一，S台分子在磁场中不会发生能级分裂，具有抗磁性，而T态有顺磁性；第二，电子在不同多重态间跃迁时需换向，不易发生。因此，S与T态间的跃迁概率总比单重态与单重态间的跃迁概率小；第三，单重激发态电子相斥比对应的三重激发态强，所以，各状态能量高低为：S2＞T2＞S1＞T1＞S0，T1是亚稳态；第四，受激S态的平均寿命大约为10-8s，T2态的寿命也很短，而亚稳的T1态的平均寿命在10-4～10s；第五，S0→T1形式的跃迁是“禁阻”的，不易发生，但某些分子的S1态和T1态间可以互

形式的跃迁有可能导致磷光光谱的产生。

相转换，且T1→S

间进行，发生系间窜跃的根本原因在于各电系间窜跃易于在T1和S

子能级中振动能级非常靠近，势能面发生重叠交叉，而交叉地方的位能是一样的。当分子处于这一位置时，既可发生内部转换，也可发生系间窜跃，这决定于分子的本性和所处的外部环境条件。

2.荧光分析仪器的检测器为什么不放在光源与液池的直线上？其第一、第二单色器各有何作用？

答：这个方向可减少透射光的干扰和影响。第一单色器是为了从光源中获得激发单色光；第二单色器是滤掉其他杂散光，而只让发射出的荧光照射到检测器上。

3.荧光光谱的形状决定于什么因素？为什么与激发光的波长无关？

答：荧光光谱形状取决于荧光物质的性质和结构，而与激发光的波长无关。这是由于分子无论被激发到高于S1的哪一个电子激发态，都经过无辐射的振动驰豫和内转移等过程，最终回到S1态的最低振动能级，然后产生分子荧光。因此，荧光光谱与荧光物质被激发到哪一个电子能级无关。

4.根据取代基对荧光性质的影响，请解释下列问题：①苯胺和苯酚的荧光量子产率比苯高50倍；②硝基苯、苯甲酸和碘苯是非荧光物质；

分别为0.10，0.05，0.01和0.00。

③氟苯、氯苯、溴苯和碘苯的

f

答：（1）—OH,—NH 2是加强荧光的给电子取代基，所以，苯胺和苯酚的荧光量子产率比苯高得多。（2）得电子取代基通常使荧光减弱，使磷光加强，如：—COOH, —NO 2等，它们n 电子的电子云并不与芳环上π电子云共平面。另外，芳环上取代上碘之后，使系间窜跃加强，其荧光强度减弱，所以，硝基苯、苯甲酸和碘苯是非荧光物质。（3）芳环上取代上F 、Cl 、Br 、I 之后，使系间窜跃加强，其荧光强度随卤素相对原子质量的增加而减弱，磷光相应加强，这种效应称为重原子效应。所以，氟苯、氯苯、溴苯和碘苯的f φ分别为0.10，0.05，0.01和0.00。

5. 如何扫描荧光物质的激发光谱和荧光光谱？

答：固定第二单色器的波长，使测定的荧光波长保持不变，然后改变第一单色器的波长由200～700nm 扫描。以测出的相对荧光强度为纵坐标，以相应的激发光波长为横坐标作图，所绘出的曲线就是该荧光物质的激发光谱。

固定第一单色器的波长,使激发光波长和强度保持不变，然后改变第二单色器波长,从200～700nm 进行扫描，所获得的光谱就是荧光光谱。

6. 写出荧光强度与荧光物质浓度间的关系式，应用前提是什么？ 答：荧光强度与荧光物质浓度之间的关系式为

''f f 0f 0[1(1)]I K I A K I kcL Kc φφ=--==

该式的应用前提是荧光物质溶液的吸光度A ＜0.05。

7. 一个化学反应要成为化学发光反应必须满足哪些基本要求？ 答：一个反应要成为化学发光反应，必须满足如下基本要求：

（1）化学反应必须提供足够的化学能，如果在280～760nm 的可见-紫外光区产生化学发光，则要求化学反应提供160～420kJ·mol -1的能量，具有过氧化物中间产物的氧化还原反应一般能满足这种要求。

（2）吸收化学能处于电子激发态的分子返回到基态时，能以光的形式释放出能量。

8. NADH 的还原型是一种重要的强荧光性物质，其最大激发波长为340nm ，最大发射波长为465 nm ，在一定条件下测得NADH 标准溶液的相对荧光强度如下表所示。根据所测数据绘制标准曲线，并求出相对荧光强度为42.3的未知液中NADH 的浓度。

解：以表中相对荧光强度为纵坐标，以NADH 的浓度为横坐标作图，所绘制的标准曲线和回归方程如下。根据此标准曲线和回归曲线方程，

将未知液中的相对荧光强度42.3代入，可解得未知液中的NADH的浓度为3.51×10-8mol·L-1。

9.用流动注射化学发光法测定植物组织中的铬，准确称取0.1000g 干燥样品，加入H2SO4-HNO3混合液(1+1)4.0mL, 用微波压力法按一定程序快速消解完全后定容为50.00 mL，与标准溶液一起在相同条件下测定，数据如下表（5次测定平均值）：

试液的相对发光值为24.8，求样品中的含量。

解：以表中相对发光值为纵坐标，以Cr3+标准溶液的浓度(ng·mL-1)为横坐标作图，所绘制的标准曲线和回归曲线方程如下。根据此标准曲线和回归曲线方程，将未知液中的相对发光值24.8代入，求得50 Ml试液中Cr3+的浓度为7.1 ng·mL-1，含量为50×7.1 ng=355 ng，故样品中Cr3+的含量为

w=355 ng/(0.1×109 ng)×100%=3.6×10-4%

10.区别图7-5种某组分的三种光谱：吸收光谱、荧光光谱和磷光光谱，并简述判断的依据或原则。

图7-5 吸收光谱、荧光光谱和磷光光谱

答：上图中I为该组分的吸收光谱，II为该组分的荧光光谱，III为该组分的磷光光谱。因为同一组分的吸收光谱波长最短，磷光波长最长，荧光光谱的波长处于中间且与激发光谱呈镜像对称。

第五章分子发光分析法习题答案

第五章分子发光分析法 2、简述影响荧光效率的主要因素 答：荧光效率（Ψ?）＝发荧光的分子数/激发态分子总数。荧光效率越高，辐射跃迁概率越大，物质发射的荧光也就越强，则Ψ?＝K?/( K?+∑Ki)， 一般来说，K?主要取决于物质的化学结构，而∑Ki则主要取决于化学环 境，同时也与化学结构有关，其影响因素有： ①分子结构：发荧光的物质分子中必须含有共轭双键这样的强吸收基 团，且共轭体系越大，л电子的离域性越强，越易被激发而产生荧光。 随着共轭芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波方向移动。 ②a其次，分子的刚性平面结构有利于荧光的产生，有些有机配位剂与金属离子 形成螯合物后荧光大大增强；b给电子取代基如－OH、－NH 2、－NR 2 和-OR等可 使共轭体系增大，导致荧光增强；吸电子基如－COOH、－NO和－NO 2 等使荧光减弱，c随着卤素取代基中卤素原子序数的增加，物质的荧光减弱，而磷光增强。 ③环境a溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大；b对于大多数荧光物质，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低；c大多数含酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受溶液PH的影响很大；d溶液中表面活性剂的存在减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率；e溶液中溶解氧的存在，使激发态单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，会使荧光效率减低。 3、试从原理和仪器两方面比较吸光光度法和荧光分析法的异同，并说明为什么 荧光法的检出能力优于吸光光度法 答：原理：紫外－可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法，而荧光分析法是由于处于第一激发单重态最低能级的分子以辐射跃迁的形成返回基态各振动能级时产生的荧光的分析方法，两者的区别在于前者研究的是吸收光谱，且电子跃迁为激发态的振动能级到基态的振动能级间的跃迁。 仪器：荧光分析仪器与分光光度计的主要差别有：a 荧光分析仪器采用垂直测量方式，即在与激发光相垂直的方向测量荧光，以消除透射光的影响；b 荧光分析器有两个单色器，分别用于获得单色器较好的激发光和用于分出某一波长的荧光，消除其它杂散光干扰。 因为荧光分析法的灵敏度高，其检出限通常比分光光度法低2～4个数量级，选择性也比分光光度法好，这是由于：a 荧光分析仪器在与激发光相垂直的方向测量荧光，与分光光度在一直线上测量相比，消除了透射光的影响，测量更为准确，灵敏度高；b 吸光光度法只采用一个单色器，而荧光分析仪器有两个单色器，

分子发光分析试卷

分子发光分析 中国·武汉 二O 一五 年 六 月

华中农业大学本科课程考试试卷 考试课程与试卷类型：分子发光分析姓名： 学年学期：2014-2015-2 学号： 考试时间：班级： 一、选择题（选出一个正确答案，将序号填写在【】里。每小题2分，共24分。） 1.非辐射跃迁的衰变过程中，不包括那个过程？【】 A 振动松弛B内转化C 系间窜越D系间转化 2．下面那个不是有效的荧光猝灭剂。【】 A 对二氰基苯 B N,N-二甲基苯胺 C N,N-二乙基苯胺 D 苯胺 3 下列那个不是市场上常见的荧光分光光度计。【】 A 美国Cary Eclipse（瓦里安） B 日本Hitachi(日立) C 岛津CF-5301PC等系列 D 上海F95/96等系列 4 常规的荧光分析法中，间接测量法不包括下面中的那个? 【】 A 荧光衍生法 B 荧光猝灭法 C 荧光吸收法 D 敏化荧光法 5 下列哪位人物没有提出同步荧光分析法。【】 A Clack B Inman C Winefordner D Stern 6 延迟荧光的主要类型不包括下面哪种？【】 A E-型迟滞荧光 B 简单荧光 C P-型迟滞荧光 D 复合荧光 7 动力学分析法不包括下面哪个类型。【】 A 酸催化法 B 非催化法 C 催化法 D 酶催化法 8 下列哪种检测方式不属于单分子荧光检测形式。【】 A 光子爆发检测 B 多分子图像记录 C 单分子图像记录 D 单分子光谱测绘 9 下列哪个不是测定铜的荧光分析方法？【】 A 直接荧光法 B 间接荧光法 C 荧光猝灭法 D 荧光滴定法 10 下列哪个物质不曾用于钒的荧光测定？【】 A 间苯二酚 B 苯甲酸-锌汞齐 C 1-氨基-4-羟基蒽醌 D 桑色素 11 下列哪个pH值会使铁离子与氨基酚反应的产物具有相对较强的荧光？【】

分子发光分析法总结

第12章分子发光分析法 12.1.0发射光谱 物质通过电致激发、热致激发或光致激发等激发过程获得能量，变为激发态原子或分子M*，当从激发态过渡到低能态或基态时产生发射光谱，多余能量以光的形式发射出来：M*→M+hν 通过测量物质的发射光谱的波长和强度来进行定性和定量分析的方法叫做发射光谱分析法。分子荧光和磷光分析法属于发射光谱法。 12.1.1分子荧光和磷光分析法 1.荧光和磷光的产生 1)Jablonski能级图 2)多重度：M=2s+1（s为电子自旋量子数的代数和，其值为0或1） 单重态（S）：分子中全部轨道里的电子自旋配对，即s=0，M=1 三重态（T）：电子在跃迁过程中自旋方向改变，分子中出现两个自旋不配对的电子，即s=1，M=3 三重态能级比相应单重态能级略低。

3)去活化：处在激发态的不稳定分子返回基态的过程。 振动弛豫：分子吸收光辐射后从基态的最低振动能级跃迁到激发态的较高振动能级，然后失活到该电子能级的最低振动能级上。 内转换：相同多重度等能态间的无辐射跃迁。 外转换（猝灭）：激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用导致能量转换而使荧光或磷光强度减弱或消失。 系间跨越：不同多重度等能态间的无辐射跃迁。 荧光发射：单重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。 磷光发射：三重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。 2.激发光谱和发射光谱及其特征 激发光谱：以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。 发射光谱：以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。 荧光发射光谱的特点： 1)Stokes位移：在溶液中，分子荧光的发射峰相比吸收峰位移到较长的波长。 2)荧光发射光谱与激发波长的选择无关。 3)镜像规则：荧光发射光谱和激发光谱镜像对称。 12.1.2荧光量子产率和分子结构的关系 荧光量子产率（荧光效率/量子效率）：表示物质发射荧光的能力，

四川大学仪器分析第八章-分子发光分析法答案讲课教案

四川大学仪器分析第八章-分子发光分析法 答案

第八章分子发光分析法 基本要求：了解荧光的产生和影响荧光强度的因素， 掌握分子荧光光谱法的定量关系和应用特点， 重点：荧光光谱法的定量关系、应用特点。 难点：荧光的产生和影响荧光强度的因素。 参考学时：3学时 作业参考答案 1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光？ 答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。 芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。 2.解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失 活、系间窜跃、荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱 答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。 三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射； 振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的振动能以热的形式失去的过程。 内转换：在相同激发多重态的两个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。 外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。 失活：激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。 系间窜跃：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。 荧光量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数 激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。 荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。

分子发光分析法(精)

第五章分子发光分析法 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。 第一节荧光分析法 一、概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。1867年

Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。 荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。 二、基本原理 (一)分子荧光的产生 大多数分子含有偶数电子。根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。处于电子激发态的分子是不稳定的，它会很快地通过无辐射跃迁和辐射跃迁释放能量而返回基态。辐射跃迁发生光子的发射，产生分子荧

四川大学仪器分析第八章分子发光分析法答案

第八章分子发光分析法 基本要求：了解荧光的产生和影响荧光强度的因素， 掌握分子荧光光谱法的定量关系和应用特点， 重点：荧光光谱法的定量关系、应用特点。 难点：荧光的产生和影响荧光强度的因素。 参考学时：3学时 作业参考答案 1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光 答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。 芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。 2.解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失活、系间窜跃、 荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱 答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。 三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射； 振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的振动能以热的形式失去的过程。 内转换：在相同激发多重态的两个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。 外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。 失活：激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。 系间窜跃：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。 荧光量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数 激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。 荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。 3.溶液中，溶剂的极性、pH值及温度是如何影响荧光强度的。 答：溶剂的影响：随着溶剂极性增加，荧光物质的n—π*跃迁能量增大，π—π*跃迁的能量降低，从而导致荧光强度增加，荧光波长红移。溶剂若能和荧光物质形成氢键或使荧光物质的电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四

仪器分析作业03参考答案(第三、五章紫外可见分光光度法+分子发光分析法)华南理工大学仪器分析

01. 溶液有颜色是因为它吸收了可见光中特定波长范围的光。若某溶液呈蓝色，它吸收的是什么颜色的光？若溶液无色透明，是否表示它不吸收光？ 答：溶液呈蓝色，表明其吸收了蓝光的互补光，即黄光（若答是吸收了黄光外的所有可见光，不能说错，但是这样的情况过于巧合，少见！）。若溶液无色透明，仅能说明其不吸收可见波段的光。 2. 分别在己烷和水中测定某化合物UV-Vis 光谱，发现该化合物的某个吸收峰由285 nm （己烷）蓝移至275 nm （水），（1）判断产生该吸收峰的跃迁类型；（2）试估算该化合物与水生成氢键的强度。 答：（1）溶剂极性增大，λmax 蓝移，表明该吸收峰是由n →π*跃迁产生的。 （2）()()? ?? ? ??λ-λ??=己烷氢键max O H max A 1 1hc N E 2 ? ?? ??????????=--99834-23102851-102751100.31063.61002.6 1mol J 28.15-?= 3. 按从小到大顺序对下列化合物的λmax 排序，并简单说明理由（不要想得太复杂） A. NO 2 B. NO 2 t-C 4H 9 t-C 4H 9 C. NO 2CH 3 D. NO 2 C 2H 5 答：B

分子发光分析法

1. 下列说法中错误的是( ) A 荧光和磷光都是发射光谱 B 磷光发射发生在三重态 C 磷光强度IP与浓度C的关系与荧光一致 D 磷光光谱与最低激发三重态的吸收带之间存在着镜像关系 2. 分子荧光分析中，含重原子（如Br和I）的分子易发生：( ) [ID: 1291] A 振动弛豫 B 内部转换 C 体系间窜跃 D 荧光发射 3. 三线态的电子排布应为( ) [ID: 1303] A 全充满 B 半充满 C D 4. 下列说法正确的是( ) [ID: 1307] A 分子的刚性平面有利于荧光的产生 B 磷光辐射的波长比荧光短 C 磷光比荧光的寿命短 D 荧光猝灭是指荧光完全消失 5. 分子荧光与化学发光均为第一激发态的最低振动能级跃至基态中各振动能级产生的光辐射，他们的主要区别在于( ) [ID: 1309] A 分子的电子层不同 B 跃至基态中的振动能级不同 C 产生光辐射的能源不同 D 无辐射弛豫的途径不同 6. 根据下列化合物的结构，判断哪种物质的荧光效率最大( ) [ID: 1310] A 苯 B 联苯 C 对联三苯 D 9－苯基蒽 7. 欲测定污水中痕量三价铬与六价铬应选用哪种方法( ) [ID: 1312] A 原子发射光谱法 B 原子吸收光谱法 C 荧光光度法 D 化学发光法

8. 若需要测定生物试样中的伟良氨基酸应选用哪种分析方法( ) [ID: 1315] A 荧光光度法 B 化学发光法 C 磷光光度法 D X荧光光谱法 9. 若需检测尿液中的对－硝基苯酚刻采用哪种方法( ) [ID: 1319] A 荧光光度法 B 化学发光法 C 磷光光度法 D X荧光光谱法 10. 若需测定生物体中的磷酸三腺甙（ATP），其浓度为－时，应采用下述哪种方法( ) [ID: 1326] A X荧光光谱法 B 荧光光度法 C 磷光光度法 D 化学发光法 DCDAC DDACD 第五章分子发光分析法[填空题测试] 1. 分子荧光分析法试根据物质的_________________进行定性，以_______进行定量的一种分析方法。答案 分子荧光光谱荧光强度 2. 分子的外层电子在辐射能的照射下，吸收能量跃迁至激发态，再以无辐射弛豫转入最低三重态，然后跃回基态的各个振动能级，并产生光辐射。这种发光现象应称为________。[ID: 1334] 答案 分子磷光 3. ________类型的化学反应可以产生化学发光，化学发光反应自由能的变化（ΔG）一般应在________（kJ/mol）。[ID: 1337] 答案 氧化还原170－300 4. ________溶剂对荧光的光谱干扰最小，荧光光谱分析中的主要干扰是________。[ID: 1339] 答案 极性溶剂产生的散射光 5. 在极稀的溶液中，荧光物质的浓度________，荧光强度________，在高浓度时荧光物质的浓度增加，荧光强度________。[ID: 1340] 答案

第7章分子发光分析法

第7章分子发光分析法 7.1 内容提要 7.1.1 基本概念 分子发光分析法——分子吸收一定的能量跃迁到较高的电子激发态后，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光，以此建立起来的分析方法称为分子发光分析法。 光致发光——物质吸收光能而激发发光的现象，称为光致发光。 电致发光——物质吸收电能而激发发光的现象，称为电致发光。 化学发光——物质若吸收化学反应能激发发光，称为化学发光。 生物发光——发生在生物体内有酶类物质参与的化学发光称为生物发光。 单重态——一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用“S”表示。 三重态——在激发态分子中，两个价电子自旋平行的电子态称为三重态，用“T”表示。 图7-1 单重态系三重态激发示意图 无辐射跃迁——当激发态分子返回基态时，如果不伴随发光现象，则此过程称为无辐射去激或无辐射跃迁。它包括：振动驰豫、内转换和系间窜跃。 振动驰豫——同一电子能级内，激发态分子以热能交换形式将多余的能量传递给周围的分子，并由高能级回到低能级的跃迁，称为振动驰豫。 内转换——同一多重态的不同电子能级间发生的无辐射跃迁称为内转换（或内转移）。 系间窜跃——不同多重态之间的无辐射跃迁称为系间窜跃。 分子荧光——分子从S 1态的最低振动能级跃迁至S 态各振动能级时

所产生的辐射光称为分子荧光。 图7-2分子荧光、磷光光谱产生过程示意图 斯托克斯位移——分子发射荧光的波长总比激发光长，能量比激发光小，这种现象称为斯托克斯位移。 分子磷光——当受激分子降至S 1 的最低振动能级后，如果经系间窜 跃至T 1态，并经T 1 态的最低振动能级回到S 态的各振动能级，此过程辐 射的光称为分子磷光。 延迟荧光——某些物质的分子跃迁至T1态后，因相互碰撞或通过激活作用又回到S1态，经振动驰豫(VR)到达S1态的最低振动能级再发射荧光，这种荧光称为延迟荧光，也叫慢速荧光。 荧光激发光谱——固定发射光（第二单色器）波长，改变第一单色器（激发光）波长，获得以激发光波长为横坐标，荧光发射光强度为纵坐标的谱图，即为荧光激发光谱。 荧光发射光谱——固定激发光（第一单色器）波长，使激发光波长和强度保持不变，然后改变第二单色器（荧光发射）波长，从200～700nm 进行扫描，获得以发射光波长为横坐标，发射光强度为纵坐标的谱图，即为荧光发射光谱。 荧光猝灭——荧光分子与容剂或其他物质作用使荧光强度减弱的现象称为荧光猝灭，能使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂。 瑞利散射光、拉曼散射光——溶剂分子吸收能量较低的光线后，不

分子发光分析法

第7章分子发光分析法 【7-1】解释下列名词。 （1）单重态；（2）三重态；（3）荧光；（4）磷光；（5）化学发光；（6）量子产率；（7）荧光猝灭；（8）振动弛豫；（9）系间跨越；（10）内转换；（11）重原子效应。 答：（1）单重态：在给定轨道中的两个电子，必定以相反方向自旋，自旋量子数分别为1/2和-1/2，其总自旋量子数s=0。电子能级的多重性用M=2s+1=1，即自旋方向相反的电子能级多重性为1。此时分子所处的电子能态称为单重态或单线态，用S表示。 （2）三重态：当两个电子自旋方向相同时，自旋量子数都为1/2，其总自旋量子数s=1。电子能级的多重性用M=2s+1=3，即自旋方向相同的电子能级多重性为3，此时分子所处的电子能态称为三重态或三线态，用T表示。 （3）荧光：分子受到激发后，无论处于哪一个激发单重态，都可通过振动弛豫及内转换，回到第一激发单重态的最低振动能级，然后以辐射形式回到基态的各个振动能级发射的光。 （4）磷光：分子受到激发后，无论处于哪一个激发单重态，都可通过内转换、振动弛豫和体系间跨越，回到第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式回到基态的各个振动能级发射的光（5）化学发光：化学反应物或反应产物受反应释放的化学能激发而产生的光辐射。 表示。（6）量子产率：激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用 f （7）荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子之间发生猝灭，荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。（8）振动弛豫：处于激发态最高振动能级的外层电子回到同一电子激发态的最低振动能级以非辐射的形式将能量释放的过程。 （9）系间跨越：处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。即分子由激发单重态以无辐射形式跨越到激发三重态的过程。 （10）内转换：相同多重态的两个电子态之间的非辐射跃迁。 （11）重原子效应：使用含有重原子的溶剂（如碘乙烷、溴乙烷）或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称为重原子效应。 【7-2】试从原理和仪器两方面比较分子荧光、磷光和化学发光的异同点。 答：（1）在原理方面：荧光分析法和磷光分析法测定的荧光和磷光是光致发光，均是物质的基态分子吸收一定波长范围的光辐射激发至单重激发态，测量的是由激发态回到基态产生的二次辐射，不同的是荧光分析法测定的是从单重激发态向基态跃迁产生的辐射，磷光分析法测定的是单重激发态先过渡到三重激发态，再由三重激发态向基态跃迁产生的辐射，二者所需的激发能是光辐射能。而化学发光分析法测定的是化学反应物或反应产物受反应释放的化学能激发而产生的光辐射，所需的激发能是化学能。

四川大学仪器分析第八章 分子发光分析法答案

四川大学仪器分析第八章分子发光分析法答案 简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易 发荧光？答：物质受电磁辐射激发后，被激发的分子从第一电子 激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光，基于测量化合 物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。芳香族化合 物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。2、解释下列名词：单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内 转换、外转换、失活、系间窜跃、荧光量子产率、激发光谱、荧 光光谱答：单重态：电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。三重态：有两个电子自旋不配对而同方向的状态。荧光：受 光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射；振动弛豫：由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级，多余的 振动能以热的形式失去的过程。内转换：在相同激发多重态的两 个电子能级间，电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的 分子内过程。外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质间的相互作 用和能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。失活： 激发态分子不稳定，他要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态，这就是激发态分子的失活。系间窜跃：激发态分子的电子自 旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。荧光 量子产率：表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射

荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数激发光谱：在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度，将荧光强度对激发光波长作图，即得到激发光谱，实际为荧光物质的吸收光谱。荧光光谱：如果将激发光的波长固定在最大激发波长处，测量不同荧光波长处荧光的强度，将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱（或称发射光谱）。3、溶液中，溶剂的极性、pH值及温度是如何影响荧光强度的。答：溶剂的影响：随着溶剂极性增加，荧光物质的nπ*跃迁的能量降低，从而导致荧光强度增加，荧光波长红移。溶剂若能和荧光物质形成氢键或使荧光物质的电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）能使荧光减弱。溶剂纯度对荧光强度的影响也很大。当溶剂中含卤素或重金属原子时，荧光强度降低。pH值的影响：pH值对荧光强度的影响是可逆的，含酸、碱性取代基的芳香化合物的荧光一般都与pH值有关，一些荧光物质在酸性或碱性溶液中会发生水解。而不会离解的荧光物质在任何pH值均产生荧光。温度的影响：温度降低会增加荧光强度，因为降低了碰撞与非辐射失活的概率。4、荧光物质浓度高时，为什么会发生荧光强度偏离F=2、3K’I0εbc光系式的情况？答：由Lambert-Beer定律可知，F=K’I0（1－e－2、 303εbc），将此式中的指数项展开，当εbc<0、05、I0一定时，荧光强度F＝Kc，所以低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质浓度呈线性关系。当c变得足够大使得吸光度、超过0、05时，F

四川大学仪器分析第八章 分子发光分析法答案

第八章分子发光分析法 基本要求: 了解荧光的产生与影响荧光强度的因素, 掌握分子荧光光谱法的定量关系与应用特点, 重点: 荧光光谱法的定量关系、应用特点。 难点: 荧光的产生与影响荧光强度的因素。 参考学时: 3学时 作业参考答案 1.简述荧光法产生的基本原理。具有什么样结构的物质最容易发荧光？ 答:物质受电磁辐射激发后,被激发的分子从第一电子激发单重态的最低振动能级回到基态而发射荧光,基于测量化合物的荧光而建立起来的分析方法即为荧光分析法。 芳香族化合物、带有平面刚性结构的化合物、带稠环结构的化合物容易发荧光。 2.解释下列名词:单重态、三重态、荧光、振动弛豫、内转换、外转换、失活、系间窜跃、 荧光量子产率、激发光谱、荧光光谱 答:单重态:电子自旋都配对的分子的电子状态称为单重态。 三重态:有两个电子自旋不配对而同方向的状态。 荧光:受光激发的分子从第一激发单重态(S1)的最低振动能级回到基态(S0)所发出的辐射; 振动弛豫:由于分子间的碰撞,振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级失活至较低振动能级,多余的振动能以热的形式失去的过程。 内转换:在相同激发多重态的两个电子能级间,电子由高能级以无辐射跃迁方式进到较低能级的分子内过程。 外转换:激发态分子与溶剂或其她溶质间的相互作用与能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。 失活:激发态分子不稳定,她要以辐射跃迁或无辐射跃迁的方式回到基态,这就就是激发态分子的失活。 系间窜跃:激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的无辐射跃迁过程。 荧光量子产率:表示物质分子发射荧光的能力。荧光量子产率＝发射荧光的分子数/激发态的分子数＝发射的光子数/吸收的光子数 激发光谱:在荧光最强的波长处测量随激发光波长的改变而变化的荧光强度,将荧光强度对激发光波长作图,即得到激发光谱,实际为荧光物质的吸收光谱。 荧光光谱:如果将激发光的波长固定在最大激发波长处,测量不同荧光波长处荧光的强度,将荧光强度对荧光波长作图便得到荧光光谱(或称发射光谱)。 3.溶液中,溶剂的极性、pH值及温度就是如何影响荧光强度的。 答:溶剂的影响:随着溶剂极性增加,荧光物质的n—π*跃迁能量增大,π—π*跃迁的能量降低,从而导致荧光强度增加,荧光波长红移。溶剂若能与荧光物质形成氢键或使荧光物质的电离状态改变,会使荧光强度、荧光波长改变。含重原子的溶剂(碘乙烷、四溴化碳)能使荧光减弱。溶剂纯度对荧光强度的影响也很大。当溶剂中含卤素或重金属原子时,荧光强度降低。 pH值的影响:pH值对荧光强度的影响就是可逆的,含酸、碱性取代基的芳香化合物的荧光一般都与pH值有关,一些荧光物质在酸性或碱性溶液中会发生水解。而不会离解的荧光物质在任何pH值均产生荧光。 温度的影响:温度降低会增加荧光强度,因为降低了碰撞与非辐射失活的概率。