酶免疫分析法
免疫分析法（immunoassay，IA）是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。
1、酶免疫分析（EIA）
酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。这种方法是对细胞融合技术的一项重要应用。因其操作简便，不需昂贵设备，不污染环境，加之酶标记物相当稳定，有效期长，应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。最初应用的EIA技术，多采用HRP标记抗体或抗原，灵敏度不高。后来逐步发展了各种放大体系，如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系，以及采用PCR技术的PCR-EIA分析，使灵敏度有很大改进。
1.1生物素-链亲和素酶免分析（biotin avidin system BAS-EIA）[1]
生物素（botin）广泛存在于动植物组织中，在生物体内是羧化酶的辅酶；亲合素又名抗生物素蛋白，与生物素具有高度的亲和性，利用这一点，以生物素和亲和素为中介，可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。但亲和素的非特异性结合高，后又发现另一种亲合素，称之为链亲合素（Streptavin，SA），克服了亲合素非特异性结合高的缺点。免疫分析技术中，目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。一个完整的SA分子上的4个相同亚基，都可以和一个生物素分子结合，其Ka值达1015L/mo1，是抗体抗原反应的10~100万倍。又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子，不改变其免疫活性。
1.2脂质体免疫分析法（liposome immunoassay，LIA）[1]
脂质体是一种生物摸拟膜，它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。其膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作用。因此，将脂质体用于免疫分析是提高非放射免疫分析灵敏度的有效途径之一，由此所建立起来的方法即为脂质体免疫分析法。
1.3PCR-EIA分析[1]
PCR-EIA技术是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，它以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，
由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR的高扩增能力，只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。
1.4酶联免疫吸附测定法（ELISA）[2]
ELISA是一种主要的免疫分析方法，又可分为直接竞争法、接竞争法、双抗体夹心法和间接夹心法。直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上，加入酶标记农药和待测农药，酶标记农药和待测农药之间与抗体的竞争而发生结合反应。由于待测农药多，则反应后被吸附到反应板上的酶标记农药少，即吸附到酶反应板上的酶标记农药的量与待测液中农药的含量成反比。加入酶底物显色后，进行比色，可以测定待测农药含量。间接竞争法的前一部分与抗原包被直接竞争法相同，只是不用酶标记农药抗体（一抗），而是标记第一抗体，在竞争反应结束后，加入酶标一抗，发生一抗与酶标一抗的结合反应，被结合的酶标一抗的量与包被抗原结合的一抗的量的变化趋势是一致的，即被结合的酶标一抗的量与待测农药的含量成反比。此方法的优点是一个农药抗体可以结合多个酶标一抗，大大提高了方法的灵敏度。双抗体夹心法是将抗体包被固相载体，加入待测抗原使其与过量的固相抗体结合，再加入过量的酶标记相同的抗体，分离固相和游离相的化合物，加入底物，据显色程度来求出样品中抗原的含量。间接夹心法是将样品中的抗原结合于过量的固相抗体，加入过量的同种抗体（一抗），洗涤后加入酶标一抗，最后加入底物反应，据显色程度确定待测抗原的含量。
2、免疫分析技术在环境领域中的应用
1960，Y alow和Berson年第一次应用免疫分析技术检测血清中的胰岛素。随后，免疫分析技术迅速发展起来，但主要集中在生物化学、临床医学等领域。直到20世纪80年代免疫分析技术对环境化学物质检测的应用才受到了重视。
1971年，Ercegovich首先提出了将免疫化学方法应用到环境领域。他建议用免疫学的筛选方法快速检测农药残留。1975年，杀虫剂、艾氏剂和狄氏剂的放射免疫分析作为免疫分析应用于环境污染物检测领域第一次报道出来。在初始阶段，研究者将注意力集中在了农药的免疫学分析中，他们做了大量的工作，所用的技术主要是放射免疫法（RIA）。1972年，V anweemen和Engavall等人建立了酶免疫测定方法（enzyme immunoassay，EIA）。1975年，Koh ler和Mil-stein利用杂交瘤技术制备出单克隆抗体（McAb）。但是由于各方面条件的限制，这两项
技术在环境检测领域中的研究应用未引起足够的重视。进入20世纪80年代，EIA首先应用到农药的检测中，1982年Huner和Wie分别报道了对硫磷和除虫脲的EIA法检测。此后，EIA和McAb被广泛应用于各个领域的环境污染物的免疫分析。
1989年，美国环境保护局、农业部食品安全检验司和美国分析化学家组织共同制定了农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则。免疫分析得到了大多数科学团体和执法机构的认可。目前，至少有十几种商业免疫试剂盒被EPA认可。
2.1免疫分析技术在农药残留分析中的应用
免疫测定技术在环境污染物上的应用首先是在农药方面的检测。最初，大多数学者研究农药免疫分析技术的目的只是用于临床检测农药中毒病人血清、尿样和组织中的农药残留水平。后来逐渐被环境研究者重视开始用于环境领域。在环境方面的应用最早的是美国，他们把这一方法应用于地下水和河水中除草剂的检测分析中。现在已经开发出几十种农药的免疫测定技术。
EIA技术可以用于检测水、土壤、食品中的各种农药残留，方法简便：决速前处理程序简化（不需净化），反应既可在试管中进行，也可在微孔板上进行;若在96孔板上，每次可分析几十个样品，A可同时作出标准曲线。目前应用最多的是酶联免疫吸附（ELISA）测定法。
Seliske等[3]采用竞争ELISA法用兔抗白草枯抗体包被磁株固相检测百草枯，从各种水果和蔬菜中提取百草枯只用30 min，检出限为10 ng·L-1，平均回收率达99%，而用分光光度计法样品提取则击5 h，两种检测方法相关系数达0.994。Schlaeppi等运用直接竞争ELISA法和间接竞争ELISA法分别检测土壤中的异内甲草胺，产生的抗异内甲草胺单克隆抗体有极强特异性，与其代谢产物无交义反应，直接和间接竞争ELISA法对土壤中异内甲草胺的回收率分别为98%和89%。Brandon等在1994年制备了一种可以与苯并咪叶类药剂（内硫多菌灵、芬苯达叶、奥芬达叶及它们的代谢物）结合的单克隆抗体，该抗体也可与甲基苯并咪Ash氨基甲酸醋（苯菌灵的一种代谢物）结合。新的半抗原5（6）-（烃基戊基硫代）- 2-苯并咪叶氨基甲酸醋可在大鼠体内得到，这种改进了的ELISA法可以检测苯并咪叶及多种农药，检出限为1-8μgkg-1。
我国的研究者也自行开发了许多EIA检测方法：①成功地合成了对硫磷人工抗原，并在免疫的兔了体内获得高效抗血清。在此基础上，应用了ELISA法对梨、苹果中的对硫磷残留量进行检测，并以GC法验证，充分说明其具有良好的重现性。②通过化学方法，将杀虫眯偶联到载体蛋白上制成抗原，然后免疫BA LB/ C小鼠。经细胞融合、筛选、克隆等步骤，获得了抗杀虫眯的特异性抗体，并以该抗体建立了大米中杀虫眯残留量的单克隆抗体ELISA检测方法。③应用B淋巴细胞杂交瘤技术，研制出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体，并建立了小麦T-2毒素的ELISA检测方法。[2]
农业中应用举例：酶联免疫吸附分析法测定水样中的阿特拉津
赵银丽等[4]利用免疫学原理合成恩诺沙星的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠,然后应用细胞融合技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤,通过酶联免疫试验筛选分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以抗恩诺沙星的单克隆抗体(ENR mAb)为基础研制检测恩诺沙星残留的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit) ,并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞,单抗亚类均为IgG1型，其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024×106，亲和常数(Ka)为9×1010L/mol；竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05~101.6μg/L、灵敏度0.05μg/L、半数抑制浓度(IC50)1.1μg/L,与其他化合物的交叉反应率(CR%)均小于0.01 %，鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率分别为81.5%、87.6%、84.3%和95%，不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA 对ENR-Kit检测结果影响小，试剂盒保存期6个月以上。检测所有样品的平均变异系数均小于10%，并且不同基质中添加标准品所建立的标准曲线非常相似,对检测结果影响小。所以该试验建立的竞争ELISA方法可以对恩诺沙星在多种动物性产品中的残留进行检测,符合国家的检测标准。结果说明该竞争ELISA试剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点，适用于ENR残留的快速检测。
2.2免疫分析技术在工业污染物上的应用
工业污染物的免疫测定研究始于20世纪80年代，进入20世纪90年代后，研究者在前人的基础上进行了进一步的研究。2002年，西班牙人Patricia Noguera，Rosa Puchades等改进了五氯酚（PCP）的酶免疫检测技术，他们将PCP的检测限提高到0.1ng·mg-1。1997年，Harrion R O，Carlson R E，Carlson R E制备
了2，3，7，8-TCDD的单克隆抗体，用竞争性抑制法建立了2种测定方法，一种是酶联管，检测灵敏度100pg·管-1，另一种是酶联板，检测灵敏度25 pg·孔-1。1999年，Mei Liu，QingX Li，Garry A Rechnitz建立了PAHs的流动注射免疫测定技术。Y su gawarea等用ELISA法测定2，3，7，8-TCDD的IC50值是12 pg·孔管-1，可测定的浓度范围是2-240 pg·孔槽-1，即40-480 pg·mg-1。B E Watkins 等制备的单克隆抗体测定TCDD的IC50是200 pg·孔槽-1。Y W Chiu等开发了共面PCB、3，4，3’，4’-PCB；3，4，3’，4’，5’-PCB的ELISA测定方法。
2.3免疫分析技术在重金属上的应用
理论上只要能够产生特异性的抗体，就可以采用免疫技术。随着免疫技术在环境有机污染物方面的应用，重金属研究者一也把目光转移到免疫技术上。1991年，Dwane E Wylie Larry D Carlson等制备出了汞的单克隆抗体，建立了ELISA 检测方法，检测的范围在0.5-10μgL-1该方法与原子吸收方法的相关系数大于0.99。1998年，Mehraban Khosraviani Diane ABlake等制备了Cd-EDTA特异性单隆抗体，能够检测7-500μgL-1浓度的Cd（II）。
2.4 问题与展望
环境残留物质免疫分析方法尚处在研究和开发阶段，目前在我国还没有得到普遍的认可。由于环境污染残留物的种类多，既有化学工业污染物又有农药和重金属等，因此免疫检测分析系统的建立也不相同。目前主要存在以下问题：（1）环境污染物都为小分子物质，不具有免疫原性，需要与大分子物质（如BSA，OVA，KLH等）结合后才能被动物的免疫系统识别，产生抗体，这就需要环境污染物半抗原制备要经过仔细的设计，既保留环境污染物分子的基木特征，又要能够很好地与大分子结合。因此，对半抗原的合成提出了很高的要求。
（2）抗体的产生机理还不是很明确，这对抗体的特异性有很大的影响，而环境污染物的分子结构复杂，许多工业污染物结构相似，许多农药是通过修饰同一母体结构上的特定集团衍生出来的，这样在免疫分析过程中这些结构类似的化合物往往会产生很强的交叉反应，出现假阳性结果，检测人员只能确定是某类化合物的残留，因此人们大多把免疫分析作为一项初检的技术来应用。
（2）一般1种特异性的抗体只能检测1种或者几种结构相似的少数化合物，如果是多残留检测，这就给分析增加了成本。
（4）免疫分析依赖的是抗原和抗体的反应，该反应受外界的影响很大（pH 值、离子强度、有机溶剂的干扰、反应的时一间、反应的温度等）。而环境样品又非常复杂，涉及土壤、水和植物等。因此，免疫检测技术的建立要详尽考虑干扰因素。[5]
免疫技术在40年的发展中不断出现新方法和新手段，有力地推动了环境污染物免疫分析技术的快速发展，相继出现了脂质体免疫测定法、流动注射免疫分析、克隆酶给子体免疫测定法、控温相分离免疫测定法等新技术，此外免疫技术与其他技术联用，利用各种技术的特点，弥补相互之间的不足，可以更好地应用十环境中的各种污染物的分析，如免疫分析与流动注射系统相结合形成流动注射免疫分析，免疫分析与传感器结合形成免疫传感器，免疫技术与气相、液相色谱联用等。未来免疫分析技术的发展将主要集中在多残留组分免疫测定法、标准化抗体的生产、分析自动化、免疫分析技术与其他分析技术联用等方面。
随着环境污染物残留免疫分析技术的进一步研究和完善，免疫分析技术将在环境污染物监测、田间现场检测和市场快速筛选检测等方发挥越来越大的作用。
[1]管华，石茂健，崔亚男.免疫分析技术研究进展[J]. 亚太传统医药,2007.
[2]孙太凡，叶非.酶免疫分析技术在农药残留分析中的应用[J].理化检验-化学分册,2005.
[3] Selisker M Y, H erzog D P, Erber R D. J Agr Food Chem[J] , 1995, 43: 544.
[4]赵银丽,王建华,王自良,滕蔓,刘庆堂,邓瑞广,范国英,张改平. 抗恩诺沙星单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选及竞争ELISA试剂盒的研制[J]. 核农学报2008, 22( 6) : 898- 903.
[5] 邵晓龙，李季.免疫分析技术在环境激素检测中的应用[J].监测分析，2004.
中国知网，关键词：EIA
文献：免疫分析技术在环境激素检测中的应用，酶免疫分析技术在农药残留分析中的应用，免疫分析技术研究进展，除草剂阿特拉津_Atrazine_的环境行为综述，酶联免疫分析技术在杀菌剂残留检测中的应用，酶免疫分析技术研究进展，吸分法测定样的阿拉津,J Agr Food Chem。
中国知网，关键词：细胞融合技术
文献：细胞融合技术，细胞融合技术的发展及应用，细胞融合技术的现状与问题，细胞融合技术的应用研究进展，细胞融合技术研究进展，细胞融合技术研究进展
酶联免疫法
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍. 三明治法 常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为: 1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专 一性键结 3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结 4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结 5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色 结果 三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为： 1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原 2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进 行专一性键结 3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结 4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader） 测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原 的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： 1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体 2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于 塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之
酶联免疫分析法
酶联免疫分析法 生工121 徐娜 酶联免疫分析法是目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，特别是在食品和饲料中有毒有害物质的检测应用极为广泛。 酶联免疫分析法是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。该技术的原理主要有三点：第一、抗原或抗体能结合到固相载体的表面仍具有其免役活性；第二、抗体或抗原与酶结合所形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性；第三，结合物与相应的抗原或抗体反应后，结合的酶仍能催化底物生成有色物质，而颜色的深浅可定量抗体或抗原的含量。 酶联免疫法在医药、食品加工业、农牧渔业等领域有着广泛的应用：如乙型肝炎、莱姆病，急性心肌梗死的早期诊断，定量检测内毒素，HIV抗体初筛，SARS 病毒的快速检测；检测食品中的病毒，残留农药，微生物及其其它成分；检测香蕉有关病毒，小麦黄花叶病毒，检测水产品中氯霉素的残留量，禽脑脊髓抗体等。 一、医学临床中的应用 医学中，检测各种抗原和抗体，为临床疾病的辅助诊断和早期诊断提供了特异性、敏感性强的试验基础。 1、乙型肝炎、原发性肝癌的血清学检测：用血清学方法检测肝炎病毒的抗原或抗体，一直受到各级医疗卫生机构检验科室的高度重视。尤其是对乙型肝炎，甲型肝炎，丙型肝炎的血清学检测，更因为试剂盒的推出而得到广泛开展。上述各种肝炎病毒抗原或抗体的检测方法，绝大部分都是酶联免疫分析法。 2、简化莱姆病的诊断：由于在作出博氏疏螺旋体感染诊断前要进行双重测试，因此莱姆病的测试可能花费很长时间。采用由关键的疏螺旋体抗原决定簇构成的重组蛋白开发出一种新的酶联免疫测定方法。该测试比最常用的商业全细胞酶联免疫测定法特异，而敏感性相同，并且在20分钟就会产生结果。 3、急性心肌梗死的早期诊断：急性心肌梗死为一多发病，病情严重。目前对此病的策略是尽早的确诊并迅速积极的治疗。约有四分之一或更多的患者，在初诊时心电图并不显示典型心肌梗死心电图异常，无Q波。心肌坏死时释放出的Mb可直接快速血液循环。Mb是最早出现的心肌梗死生化标志物，但它在血中滞留时间短。为此，刘宏伟等研制出只需30分钟的酶联免疫快速法，为早期诊断心肌梗死提供了依据。 4、定量检测内毒素：临床上，细菌感染的患者常发生内毒素血症，死亡率高达20%——30%，检测标本中的LPS对早期诊断和防治有重要意义。用优化后的双抗体夹心法检测LPS敏感性为50ng/L,特异性与准确性均高于仪器比浊法和试验定性法。此为内毒素血症提供了一种简便，快速，准确，特异性的诊断参考。 5、快速检测SARS病毒：SARS病毒引起传染性非典型肺炎，发病快，传染性强。2003年4月，北京基因组研究所与军事医学科学院研制出诊断非典的酶联免疫分析法检测试剂，为控制疫情蔓延提供了新的诊断手段。 二、在食品分析中的应用 1、检测食品中的毒素：采用辣根过氧化氢酶标记高亲和力的黄曲霉素B1抗体，建立了直接竞争抑制酶联免疫快速筛选法。该法检测B1抗体的线性范围
荧光和化学发光免疫分析方法
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类
完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
化学发光免疫分析技术原理简介
化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试
植物NADPH酶联免疫分析(ELISA)
植物NADPH酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中植物NADPH含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物NADPH水平。用纯化的植物NADPH抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物NADPH，再与HRP标记的NADPH抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的植物NADPH呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物NADPH浓度。 标本要求： 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤： 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，
混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为120U/L，80U/L ，40U/L，20U/L，10U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA） 1.定义 (3) 2.原理 (3) 2.1抗原抗体反应 (3) 2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5) 3.ELISA的类型 (5) 3.1双抗体夹心法测抗原： (6) 3.2双抗原夹心法测抗体 (6) 3.3间接法测抗体 (6) 3.4竞争法测抗体 (7) 3.5竞争性测抗原 (7) 3.6捕获包被法测抗体 (7) 3.7ABS-ELISA法 (8) 4.ELISA试剂的组成 (9) 4.1固相载体： (9) 4.2包被的方式 (9) 4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。 (10) 4.4包被的条件： (10) 4.5洗涤液： (10) 4.7酶的催化性； (11) 4.8结合物的制备 (11) 4.9结合物的保存 (12) 4.10酶的底物 (12) 4.11酶反应终止液 (12) 4.12参考标准品 (13) 4.13加样： (13) 4.14保温 (13)
4.15保温方式： (13) 4.16室温温育的反应 (13) 4.17洗涤 (14) 4.18显色 (14) 4.19比色 (14) 4.20酶标比色仪 (15) 4.21结果判定 (15) 4.22定量测定 (16) 4.23ELISA的操作要点 (16)
1.定义 酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。 2.原理 采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。 2.1抗原抗体反应 2.1.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原和抗体均能保持原有的结构和活性。 2.1.2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。2.1.3最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。 以沉淀反应为例（Ab量固定，Ag量递增）
常见化学发光免疫分析技术比较
常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析 化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析 从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA
人C反应蛋白CRP酶联免疫分析试剂盒使用方法
人C-反应蛋白(CRP)酶联免疫分析试剂盒使用方法 检测范围：96T 30μg/L -800μg/L 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中C-反应蛋白(CRP)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人C-反应蛋白(CRP)水平。用纯化的人C-反应蛋白(CRP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入C-反应蛋白(CRP)，再与HRP标记的C-反应蛋白(CRP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的C-反应蛋白(CRP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中C-反应蛋白(CRP)浓度。 试剂盒组成 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
全自动化学发光免疫分析仪Immulite2000标准操作规程完整
IMMULITE ? 2000 全自动化学发光免疫分析仪 标准操作程序 本文件仅供参考，各实验室需根据各自情况建立自己的操作规程 IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统标准操作规程
SOP编码：页数： 制定人签名：日期： 审核人签名：日期： 批准人签名：日期： 生效日期：颁发日期：周期性审查：年一次 修订登记： 审查登记：
[目的]描述IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的使用和维护。 [范围] 适用IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的操作。 [仪器工作原理和检测过程] 1 IMMULITE 2000使用包被特定抗体的聚苯乙烯珠子作为固相，包被珠放在一个特定的反应杯中，从而进行温育，清洗以及信号发生。
2. 样本与结合了碱性磷酸酶的试剂温育反应结合之后，通过高速离心将剩余试剂甩到与反应杯同轴的废液管路中。系统在几秒钟内完成四次离心清洗，以便与系统的其他同步。去除未包被试剂的包被珠仍然保留在反应杯中。 3. 包被珠上的结合标记随后同发光底物进行定量发光。当包被珠上结合的碱性磷酸酶标记同化学发光底物反应时，就产生发光。发光强度同样本中待测物的含量有关。仪器通过光电倍增管检测发光强度，随后计算出每个样本的结果。 4. 操作者在IMMULITE 2000上运行测试时，需要做下列操作：： 4.1进行每日探针清洗工作。 4.2 选择RUN IMMULITE 2000按钮。 4.3 查系统状态指示，加满或者清空耗材或者废物。 4.4 初始化样本和试剂加样器、蒸馏水喷嘴和底物喷嘴。 4.5 使用图像扫描器扫描试剂转盘上的过敏原试剂楔。 4.6在样本转盘上装载病人血清、质控、校正液和稀释液。 注意: 运行仪器需要用到的试剂都在 IMMULITE 2000试剂盒中。只有需要预稀释的测试项目才会有稀释液。 4.7 在工作列表列表界面为样本指定测试项目以及编号。 4.8 检查试剂以及与之匹配的包被珠是否足够完成所需测试。 4.9选择RUN开始实验。 5. 仪器自动检测过程: 在操作者按下 RUN 按钮之后，Immulite 2000 自动开始检测并输出检测结 果。 5.1 在反应杯中加入一个包被珠。 5.2 样本，特定的试剂和水加入到包被珠上。 5.3 反应杯运到温育圈，在37°C (98.6°F)的环境中震荡温育。 5.4 清洗测试杯。 5.5 加入底物，发光。 5.6 光电倍增管(PMT)检测光子强度，计算结果并打印。 [免疫分析原理] 1.双抗体夹心法：双抗体夹心法使用ALP标记的抗体在检测单位中进行反应。 1.1 标记的抗体的液相试剂加到检测单位中，标记有ALP的特异性抗体(Ab※ALP)与样品中的相应抗
酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则
附件1 酶联免疫法检测试剂注册技术审查指导原则 一、前言 本指导原则主要针对酶联免疫类检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制等环节提出指导性技术要求。 本指导原则系对酶联免疫法检测试剂的一般要求，申请人应依据产品特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需详细阐述其理由及相应的科学依据。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制订的，随着法规和标准的不断完善、科学技术的不断发展，其相关内容也将进行适时的调整。 二、适用范围 本指导原则适用于有关病原微生物检测的第三类体外诊断试剂的注册技术审查。其他酶联免疫法检测试剂（如作为二类管理的体外诊断试剂）可参考本指导原则执行。 三、基本要求 （一）基本原则 1.研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。 2.试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂
生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。 3.诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 4.试剂在研制、生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 5.生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。 （二）原材料质量控制 1.主要生物原料 与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 主要生物原料的常规检验项目一般包括： （1）外观 肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。 （2）纯度和分子量
全自动化学发光免疫分析仪产品技术要求
全自动化学发光免疫分析仪 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 该产品基于间接化学发光法，与配套的检测试剂共同使用，在临床上用于对来源于人体血清、血浆或者其他体液样本中的被分析物进行体外定性或定量检测。 1.1产品型号划分说明 1.2结构组成 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 1.3软件信息 1.3.1 软件名称：利德曼化学发光免疫分析仪器软件平台 1.3.2 发布版本：V1.0 1.3.3 版本命名规则 发布版本号：VX.Y 其中：VX.Y由version缩写V，主版本号及次版本号构成：表示正式发布的第一版程序。 X为主版本号，表示全功能集成第一个版本； Y为次版本号，表示此版本程序发布后暂时未发生变更。 1.3.4 运行环境 硬件配置：
CPU：主频1.7GHz以上。 内存：1G以上内存。 硬盘空间：40G以上均可。 软件配置：操作系统：WINDOWS 7 或WINDOWS 10。 2.1加样正确度与重复性 对仪器标称的样品最小加样量和最大加样量、试剂最小加样量和最大加样量进行检测，应符合表1的规定。 表1 加样正确度与重复性要求 2.2 反应区温度控制的正确度和波动度 反应区温度的偏倚应在：37.0℃±0.5℃，波动度不超过0.5℃。 2.3 光检测装置部分 2.3.1仪器噪声 检测空反应管的发光值应不大于200RLU。 2.3.2发光值的线性 在不小于3个发光值数量级范围内，线性相关系数（r）应≥0.99。 2.3.3发光值的重复性 采用发光剂法，变异系数（CV）不超过5％。 2.3.4发光值的稳定性 采用发光剂法，发光值的变化不超过±10％。 2.4 携带污染率 携带污染率应≤10-5。 2.5临床项目的批内精密度
化学发光免疫分析方法的研究及应用
本文由：华夏学术传媒网提供https://www.docsj.com/doc/7c10721416.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强
大肠杆菌内毒素酶联免疫分析试剂盒使用方法
大肠杆菌内毒素酶联免疫分析试剂盒使用方法 检测范围：96T 0.03Eu/L – 0.8Eu/L 使用目的： 本试剂盒用于测定大肠杆菌样本中内毒素含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大肠杆菌内毒素水平。用纯化的大肠杆菌内毒素抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入内毒素，再与HRP标记的内毒素抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的内毒素呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大肠杆菌内毒素浓度。 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。
酶免疫分析法
免疫分析法（immunoassay，IA）是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。 1、酶免疫分析（EIA） 酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。这种方法是对细胞融合技术的一项重要应用。因其操作简便，不需昂贵设备，不污染环境，加之酶标记物相当稳定，有效期长，应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。最初应用的EIA技术，多采用HRP标记抗体或抗原，灵敏度不高。后来逐步发展了各种放大体系，如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系，以及采用PCR技术的PCR-EIA分析，使灵敏度有很大改进。 1.1生物素-链亲和素酶免分析（biotin avidin system BAS-EIA）[1] 生物素（botin）广泛存在于动植物组织中，在生物体内是羧化酶的辅酶；亲合素又名抗生物素蛋白，与生物素具有高度的亲和性，利用这一点，以生物素和亲和素为中介，可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。但亲和素的非特异性结合高，后又发现另一种亲合素，称之为链亲合素（Streptavin，SA），克服了亲合素非特异性结合高的缺点。免疫分析技术中，目前均采用SA供标记酶或其它示踪剂。一个完整的SA分子上的4个相同亚基，都可以和一个生物素分子结合，其Ka值达1015L/mo1，是抗体抗原反应的10~100万倍。又加之一个抗体或抗原分子结合多个生物素分子，不改变其免疫活性。 1.2脂质体免疫分析法（liposome immunoassay，LIA）[1] 脂质体是一种生物摸拟膜，它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双子单层或多层的囊泡。其膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作用。因此，将脂质体用于免疫分析是提高非放射免疫分析灵敏度的有效途径之一，由此所建立起来的方法即为脂质体免疫分析法。 1.3PCR-EIA分析[1] PCR-EIA技术是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，它以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA，
化学发光免疫分析法自己整理
化学发光免疫分析法(CLIA) A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法: (竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比) 一、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B 值越小。例:A为一种抗原 小分子,有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗A 抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU),测定尿液中A的含量。 二、仪器: 1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司); 2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min 3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯) 4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)
5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂) 6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司) 三、试剂 1、A标准品 2、A单克隆抗体 3、A-BSA结合物 4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL) 5、FITC标记的A单克隆抗体 6、HRP标记的A 7、PBST 洗涤液(0、05mol/L PBS, 含0、05% Tween-20) 8、分析缓冲液(0、05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7、4, 含2、0%BSA、0、5 %的水解明胶、0、1%的Proclin-300) 9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢与对碘苯酚溶液) 实验用水为二次蒸馏水 四、试剂处理 1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品; 2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存、 FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。(具体分析) 五、数据处理 通过测量标准品与样品溶液的发光强度(RLU),使用Fl ash’n glow LB955 发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理、线性方程采用的就是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型, 以logitY 为纵坐标, logX 为横坐标, 其线性方程表达式为logit(Y) = a + blog(X), 线性方程中 X 为标准品(或待测样品)溶液的浓度, logit(Y) =ln(y/1-y),y=B/B0,式中, B 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, B0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强度、根据标准品的浓度与发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品
实验四 酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素
实验四酶联免疫法测定食品中黄曲霉毒素 一、实验目的 了解ELISA的基本原理，及其优缺点；掌握间接ELISA法的试验操作过程。 二、实验原理 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是免疫酶技术的一种。本方法测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的特异性单克隆抗体，加入黄曲霉毒素标准品（或样品溶液）及黄曲霉毒素B1 酶标记物，标准品（或样品溶液）中的游离黄曲霉毒素B1 与黄曲霉毒素B1酶标记物竞争黄曲霉毒素B1 抗体，没有连接抗体的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将基质/发色剂转化为蓝色的产物，加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色，在450nm 处测量，吸收光强度与样品中黄曲霉毒素B1的浓度呈负相关。 三、实验器材 1、ELISA试剂盒 其组成如下： 1.1 包被抗体的反应板48孔 1.2 A试剂：样品稀释液l瓶 1.3 B试剂：AFB1标准溶液l套(0, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2 ng/mL) 1.4 C试剂：酶标抗原l瓶 1.5 D试剂：酶标抗原稀释液l瓶 1.6 E试剂：浓缩洗涤液l瓶 1.7 F试剂：显色底物液a l瓶 1.8 G试剂：显色底物液b l瓶 1.9 H试剂：终止液l瓶 1.10 反应板框架l块 2、仪器 1.1酶标仪(内置450nm滤光片) 1.250μL微量移液器及配套吸头 1.3 恒温培养箱(0℃-50℃) 1.4冰箱(4℃-8℃)
1.5 感量0.0lg的天平 1.6调速振荡器或超声波清洗器 1.7 离心机5000r/min 1.7 玻璃器皿：具塞锥形瓶，烧杯，分液漏斗，普通漏斗，量筒，具塞试管，滴管，移液管等 1.8 小型粉碎机或碾钵 1.9其它：滤纸，吸水纸等 四、实验步骤 1、实验准备 1.1 样品处理：详见试剂盒说明书所列“样品处理方法”及“黄曲霉毒素国家允许量标准及样品稀释表” 1.1.1 脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等) 称取5.0g样品(已粉碎)于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.00mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去l/4初滤液，收集试样滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100μL样品提取液+100μL样品稀释液，总稀释10倍），即为待测样液。1.1.2 花生 样品去皮粉碎(刀切或剪切)，称取5.0g于100mL具塞三角瓶中。加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液和20mL正已烷(或石油醚)，于振荡器上剧烈震荡l0min，过滤于分液漏斗中，静置分层，放出下层甲醇水提取液，此液为样品提取液，根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将提取液进行适当稀释（如100μL样品提取液+300μL 样品稀释液，总稀释20倍），即为待测样液。 1.1.3 一般饲料及原料 称取5.0g样品于100mL具塞三角瓶中，准确加入25.0mL甲醇水(1+1)溶液，于振荡器上剧烈震荡15min，过滤，弃去1/4初滤液后收集滤液，此液为样品提取液。根据样品的国家允许量标准，用A试剂(样品稀释液)将样品提取液进行适当稀释（如100μL 样品提取液+900μL样品稀释液，总稀释50倍），即为待测样液。 1.2 试剂的配制 1.2.1每瓶C试剂（酶标抗原）中准确加入1.5mL D试剂(酶标抗原稀释液)，充分溶解，配成实验用酶标抗原溶液，2～8℃保存。