DNA 指纹图谱分析方法
第10章 DNA指纹图谱分析方法
10.1 DNA指纹图谱产生的原理
10.1.1 高变异DNA序列的发现
1980年，Wyman 和 White在进行人体DNA 基因文库的研究中，筛选到一个随机DNA片 段，以其为探针进行RFLPs分析，检测到8个等位基因，平均杂合率超过75％，因此推测该 位点的多态性来源于DNA重排而非碱基突变，这是人类基因组中发现的第一个高变区（hyper variable regions，简称HVRs）。此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区， 如α-珠蛋白基因（Higgs等 1981，1986）、胰岛素基因（Bell等 1982）、脂蛋白基因（Knott 等 1986）、D-Ha-ras癌基因（Capon等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm等 1983）等基 因的侧翼及肌红蛋白基因（Weller等1984）的第一个内含子区域，都含有这种HVRs。这些高 变区的共同特点为：都是由一短序列（即重复单位）首尾相连、多次重复而成，其多态性来源 于重复单位的重复次数不同。同一高变区的这些重复单位还具有高度的保守性，但因重复单位 的重复数目不同，形成了众多的等位基因。这些高变区后来被叫做小卫星（minisatellite）（Jeffreys等 1985a），有的人又称其为可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeat，简称VNTR）（Nakmura等1987）。在小卫星DNA内，重复单位数目的高度变异是由于不 等交换所造成的，换言之，即在有丝分裂时的姊妹染色单体（sister chromatids）或减数分裂 时的同源染色体间互换所致。有时候，发现DNA链架突变的发生频率高于点突变，其频率为每 世代每千个核苷酸对在10－5～10－2。虽然不等互换导致重复单位数目增加或减少，但不同重复 的形成却是由于点突变造成的。此外，基因转换（gene conversion）与重组似乎在同源性的维 持上扮演着重要的角色。在DNA复制期间的滑动复制（slippage）是重复单位内简单序列 （1～4个核苷酸对）演化的机制（Wolf等 1989）。故有丝分裂或减数分裂时不等互换、基因转换及滑动复制，均足以导致重复单位间同源性的维持及重复单位数目的变化。
大多数重复序列单位共有一个约 10～15个核苷酸对的核心序列（core sequence），此核心序列高度地保留于相关的小卫星DNA家族中，它是重组信号，可能是真核生物DNA重组交换的热点，可促进小卫星DNA的不等交换（Jeffreys等 1985a；Wyman等 1990）。核心序列是重复单位间序列相似的基础。在小卫星DNA区域内，同源染色体可能有不同数目的重复单位，利用限制性内切酶可产生DNA指纹。由此可见，串联重复序列的高度变异性与其特殊的结构密切相关。然而，基因组中此类串联重复序列的真实生物学功能至今仍不清楚。
本章作者：丁 波，张亚平
第10章 DNA指纹图谱分析方法119
10.1.2 DNA指纹图谱的发现
1985年，英国来斯特大学遗传系的Jeffreys（1985a）及其同事在《Nature》杂志上报道了他们对人体基因组高变区的突破性研究。他们用肌红蛋白基因第一个内含子中的串联重复序列（重复单位长33bp）作探针，从人的基因文库中筛选出8个含有串联重复序列（小卫星）的重组克隆。经序列分析，发现每个克隆都含有一个长0.2～2.0kb、由重复单位重复3～29次组成的小卫星DNA。尽管这8个小卫星的重复单位的长度（16～64bp）和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列，其碱基顺序为 GGGCAGGAA。他们用 16bp重复单位（主要为核心序列）重复29次而成的小卫星33.15做探针，与人基因组酶切片段进行Southern杂交，在低严谨条件下杂交产生由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置是千差万别的。随后他们用另外一个小卫星探针33.6进行测试，获得了类似的图谱。这种杂交图谱就像人的指纹一样因人而异，因而Jeffreys（1985b）等人称之为DNA指纹图谱（DNA finger print），又名遗传指纹图谱（genetic finger print）。产生DNA指纹图谱的过程就叫做DNA指纹分析（DNA finger printing）。
10.l.3 DNA指纹图谱的特点
DNA指纹图谱具有以下3个基本特点：
（1）多位点性：基因组中存在着上千个小卫星位点，某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。一般来说，一个DNA指纹探针（又称多位点探针）产生的某个个体DNA指纹图谱由10～20多条肉眼可分辨的图带组成。由于大部分杂合小卫星位点，仅一个等位基因出现在图谱的可分辨区内（两个等位基因由于重复单位、重复次数不同，在长度上差异很大），因而每条可分辨图带代表一个位点。很多的研究表明，个体DNA指纹图谱中的带很少成对连锁遗传，所代表的位点广泛地分布于整个基因组中（Burke等1987；Hiu等1985）。一个传统的RFLPs 探针一次只能检测一个特异性位点的变异性，所产生的图谱一般由l～2条带组成，仅代表一个位点。因此两者比较而言，DNA 指纹图谱更能全面地反映基因组的变异性。
（2）高变异性：DNA指纹图谱的变异性由两个因素所决定，一是可分辨的图带数，二是每条 带在群体中出现的频率。DNA指纹图谱反映的是基因组中高变区，由多个位点上的等位基因所组 成的图谱必然具有很高的变异性。DNA指纹图谱在个体或群体之间表现出高度的变异性，即不同 的个体或群体有不同的DNA指纹图谱。一般选用任何一种识别4个碱基的限制性内切酶，这种变 异性就能表现出来。Jeffreys等 （1985b）对人的DNA 指纹图谱的研究表明，DNA指纹图谱中的 大部分谱带都以杂合状态存在，平均杂合率大于70％，某些大片段的杂合率甚至高达100％。用 探针33.15进行DNA指纹分析时，发现两个无血缘关系的个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为 3× 10－11；而将探针33.15和33.6产生的DNA指纹图谱综合起来分析时，则这种概率为5×10－19，可见DNA指纹图谱具有高度的个体特异性。但是，同卵双胞胎的DNA指纹图谱是相同的，因其有完全相同的基因组（Hiu等1985）。值得注意的是，由于琼脂糖凝胶电泳分辨率的限制，DNA指纹图谱大片段区域的变异性往往很高，而小片段区域的变异性则很低，因此在实际操作时往往将
小于 2kb的小片段跑出胶外或不作统计。
120 遗传多样性研究的原理与方法
（3）简单而稳定的遗传性：Jeffreys等（1985a）通过家系分析表明，DNA指纹图谱中
的谱带能够稳定地从上一代遗传给下一代。子代DNA指纹图谱中的每一条带都能在其双亲之
一的图带中找到，而产生新带的概率（由基因突变产生）仅在0.001～0.004之间。DNA指纹
图谱中的杂合带遵守盂德尔遗传规律，双亲的各图带平均传递给50％的子代。DNA指纹图谱
还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA做出的 DNA指纹图谱是一致的（Gill等1985），但组织细胞的病变或组织特异性碱基甲基化可导致
个别图带的不同。
10.l.4 DNA指纹图谱的应用
由于DNA指纹图谱具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性，因而自其诞生就引起了人们的重视，表现出巨大的实用价值。DNA指纹图谱的高变异性和体细胞稳定性可用于鉴定个体，这对法医学上鉴别犯罪分子和确定个体间的血缘关系极有价值（Jeffreys等1985b，1985c）。如我国公安部利用DNA指纹图谱已侦破数百例疑难案件。其简单的遗传性可用来鉴定亲子关系，其多位点性可用来检测目标基因组的病变及治疗等过程中的改变情况。1987年Burke、Jeffreys和Wetton等报道了用人源核心序列小卫星探针33.6和33.15检测到哺乳动物到鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫等的高变异小卫星，产生具有个体特异性或类群特异性的DNA指纹图谱。1988年，Dallas用人源小卫星探针33.6获得了水稻的DNA指纹图谱。随后，美国华盛顿大学生物系Nybom等人对果树植物的DNA指纹图谱进行了大量的研究。1989年，Braithwaite和Manners首次将人源小卫星探针33.6和33.15用作真菌的DNA指纹分析获得了成功，从而进一步证明DNA指纹技术具有广泛的适用性。这些发现使DNA指纹图谱成为研究动植物群体遗传结构、生态与进化、分类等很有价值的遗传标记。
10.l.5 DNA指纹图谱的研究进展
10.l.5.1 DNA指纹分析的探针
两个最早的DNA指纹探针是1985年Jeffreys及其同事所发现的人源小卫星探针33.6和 33.15（Jeffreys等 1985a）。1987年，Vassart等发现无外源DNA片段的细菌噬菌体M13本身就能够作为一个DNA指纹探针检测出人和动物基因组中的高变异小卫星DNA，其有效序列是蛋白质 Ⅲ 编码区内的两个小卫星序列。从此，M13便也成为各种动植物重要的DNA指纹探 针（Gatei等 1991；Kuhnlein等 1989）。另一个在人和动物上广泛应用的 DNA指纹探针是 3′HVR（Jarman等 1986），它来源于人α-珠蛋白的3′端的一个高度重复区。以上4个小卫星探针的重复单位的序列结构如下所示：
33.6（AGGGCTGGAGG）3
33.15（AGAGGTGGGCAGGTGG）
M13（GAGGGTGGNGGNTCT）
3′HVR（GNGGGGNACAG）
从迄今已有的报道来看，在DNA指纹分析中用得最多的多位点小卫星探针为33.6、33.15、M13及3′HVR。此外，人们还从某些动物的基因组中分离克隆了一些小卫星DNA用作DNA指纹探针。如牛的小卫星探针PSRC-7（Plante等 1991）和猪的小卫星探针pS35
第10章 DNA指纹图谱分析方法 121
（Coppieters等 1990）。人工合成的简单重复序列微卫星探针也广泛地用于DNA指纹分析，
如（GTG）5 、（TG）8、（AT）8、（TCC）5 、（GACA）4。从基因组中分离克隆的微卫星DNA指纹
探针有PGB725 （牛）（Kashi等 1990）和 R18.1 （猪）（Haberfield等 1991）。 孟安明 （1993）发现，任何一个动物个体的基因组总DNA可标记作为DNA指纹探针（基因组探针），
在该个体所属物种及其他相关物种上产生具有个体特异性的杂交图谱。以基因组探针进行 DNA指纹分析不需通过复杂的操作来获得探针DNA，有利于DNA指纹技术的推广。
10.l.5.2 DNA指纹图谱的重要发展
DNA指纹图谱的重要发展是微卫星DNA指纹图谱。微卫星（microsatellite）是由2～6个核苷
酸组成的重复单位串联排列而成的DNA序列。据估计，在真核生物基因组每10kb的DNA序列中至
少有一个微卫星（Tautz 1989），如人体基因组中仅二核苷酸串联重复的微卫星就多达 50 000～100 000个。大多数微卫星的长度小于 200bp，但也有更长的微卫星。微卫星不同于小卫星，它们
广泛分布于很多结构基因的内含子、基因间隔区甚至调控序列中（Tautz等 1984；Weising 1989；Ishii等 1985）。早在1974年，Skinner等就在寄居蟹（hermit crab）基因组中发现了微卫星DNA，当时叫做简单串联重复序列（simple tandem repeat）。Singh等人在1980年发现蛇的W性染色体
上也存在着这种序列，它是由GATA／GACA重复单位组成的。以后的研究表明，在真核生物甚至原
核生物的基因组中都普遍存在这种序列（Jones等 1981；Tautz等 1986）。直到1986年，Ali等
人首次用合成的GATA／GACA寡聚核苷酸作探针用于人的DNA指纹分析，成功地开创了利用微卫星DNA探针进行DNA指纹分析这一新的领域。微卫星探针易于合成，可直接与固定在干胶中的DNA片
段杂交，所检测的位点普遍具有高度的变异性。1988年，Schafer等人进一步发展了这门技术，使
寡聚核苷酸（微卫星）分析技术又一次得到了完善。迄今为止，合成的各种寡聚核苷酸（微卫星）
已成功地应用于人和近百种动植物的DNA指纹分析（Buitkamp等 1991a，1991b；Schafer等 1988；May等 1991；Nuraburg等 1989；Hubert 等 1990；Lonn 等1992；Biermerth 等 1992；Caetano-Anolles 等 1991）。从已有的报道来看，适用范围广、变异性高的微卫星探针主要有（GTG）n、（GT）n、（GATA）n、（GACA）n、（GAG）n等（Buitkamp等1991a，1991b）。
10.1.5.3 PCR在DNA指纹分析中的应用
PCR是一种在体外大量扩增DNA的方法。在法医研究上，由于所检验的材料量（如血斑、 精斑、发梢）极微，因此很难获得常规Southern杂交所需的DNA量，利用PCR就可以解决这 一问题。Jeffreys等（1988）根据多个小卫星的已知侧翼序列来合成引物（每个小卫星两个 引物）。先以极微量（ 甚至单个细胞 ）的人类基因组DNA为模板进行体外扩增（产物可长达 10kb），然后再用这些小卫星的混合探针进行Southern杂交，得到了可以重复做出的具有高度 变异性的DNA指纹图谱。
10.1.5.4 单位点高变异性小卫星和微卫星探针的开发
DNA指纹图谱虽然具有很多的优点，但并非完整无缺。第一，DNA指纹图谱中每一个个
所含图带数很多，给统计分析带来了许多麻烦。例如，在比较个体之间的DNA指纹图谱时， 如果某两条带的位置相差很小，那么就很难判断它们是否来自同一位点上的同一等位基因，也
122 遗传多样性研究的原理与方法
许是由于实验操作过程中凝胶变形等引起的误差影响了分析结果的准确性。第二，DNA指纹 图带的分辨率很难提高，特别是较小的DNA片段因难以分开而呈现很低的变异性；长度相差 不大的DNA片段无法通过电泳分开。第三，DNA指纹图谱不能区分杂合体和纯合体。在进行 DNA指纹图谱统计分析时，人们假定图中每一条带分别代表不同的位点，但实际上，如果某 一位点是杂合的，那么此位点在DNA指纹图谱上会拥有两条带，也就是说在DNA指纹图谱上 应有两条带代表同一个杂合位点上的不同等位基因。因此，有时以DNA指纹图谱分析得到的 结果与真实情况也会有所不同。第四，对于某一个位点来说，往往只有一个等位基因出现在 DNA指纹图谱上，因此无法根据DNA指纹图谱确定个体在该位点上的基因型。为了克服DNA指 纹图谱的上述缺点，人们已开始重视单位点探针的开发。所谓单位点探针，是指只是特异性 与某一位点上的等位基因杂交的探针。由于真核基因组中的小卫星和微卫星位点普遍具有高 度的变异性，因此它们是高变异单位点探针的重要来源。基因组中的小卫星位点有数千个， 微卫星位点更达数十万个，通过用现有的多位点小卫星和微卫星探针筛选基因文库，可以得 到众多的高变异单位点探针。迄今为止，国外一些单位已从猪、马、鸡、牛等的基因组中分 离、克隆了数百个小卫星和微卫星探针，这些探针将是构建有关畜禽基因图谱的基础。
10.1.5.5 其他方面的进展
双向电泳（two-dimensional electrophoresis）的应用，使 DNA指纹图谱的容量大大增加（Uitterlinden 等 1989）。变性凝胶电泳可以更有效地分辨等位基因（Uitterlinden等1989）；电极反转电泳（field inversion gel electrophoresis）提高了 DNA指纹图谱中大片段的分辨率（Fowler等 1988）。由于DNA指纹图谱在实验技术和统计方法上一直处于不断的改进之中，因此我们深信在不远的将来，DNA指纹分析技术必将在医学、畜牧业、农业乃至整个生物领域得到更加广泛的应用。
10.2 DNA指纹图谱产生的方法
10.2.1 主要试剂及器材
产生 DNA指纹图谱的主要试剂及器材如下：限制性内切酶 HinfⅠ、HaeⅢ等；电泳级琼 脂糖；尼龙膜；λDNA／EcoRⅠ＋HindⅢ；H4型（24×20cm）水平电泳槽装置；Model 250型 电泳仪；标记试剂盒 Prime-a-Gene? Labeling system；（α-32P）dCTP；X光胶片；LS5801型液闪仪；FYY-1型多功能生化反应仪。
10.2.2 有关试剂的配制
（1） ACD抗凝剂
柠檬酸 0.48g
柠檬酸钠 1.32g
葡萄糖 1.47g
加水至 100ml
（2） T10E10缓冲液
第10章 DNA指纹图谱分析方法 123
Tris-HCl 10mmol／dm3
EDTA 10mmol／dm3
pH值：8.0
（3）TE缓冲液
Tris-HCl 10mmol／dm3
EDTA 1mmol／dm3
pH值：8.0
（4）20％SDS（100ml）
SDS 20g
溶于 100ml蒸馏水中，30℃以上贮存。
（5）USSTE裂解液
Urea 8mmol／dm3
NaCl 0.3mol／dm3
SDS 2％
Tris-HCl 150mmol／dm3
EDTA 1mmol／dm3
pH值：7.5
（6）Tris饱和酚
新蒸苯酚加入 8-羟基喹啉至终浓度为 0.1％，用 1mol／dm3 Tris-HCl和0.5mol／dm3 Tris-HCl溶液饱和至 pH值 8.0，去掉上层水相，加适量（约 1／10体积）的 0.1mol／dm3 Tris-HCl （pH值8.0）覆盖在酚相上，保持4℃，放在棕色瓶中保存。
（7）50×TAE缓冲液（1 000ml）
Tris 242g
冰醋酸 57.1ml
0.5mol／dm3 EDTA（pH值 8．0） 100ml
（8）10× BPB贮存液
聚蔗糖 20％
EDTA 0.2mol／dm3
溴酚蓝 0.25 ％
二甲基腈蓝 0.25％
本贮存液可在室温存放。
（9）40mmol／dm3 亚精胺
亚精胺 0.58g
将亚精胺溶于 10ml蒸馏水中，4℃下存放。
（10）溴化乙锭（EtBr）贮存液 （10mg／ml）
EtBr 1g
将EtBr溶于 100ml蒸馏水中，在棕色瓶存放，温度保持在 4℃。
（11）变性液
NaCl 1.5mol／dm3
NaOH 0.5mol／dm3
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（12）20×SSC（1 000ml）
NaCl 175.3g
柠檬酸钠 88.2g
用 10mol／dm3 NaOH调 pH值至 7．0，高压灭菌。
（13）杂交液
NaPO4 0.5mol／dm3
SDS 7 ％
EDTA 1mmol／dm3
（14）标记反应终止液
聚葡萄糖蓝 0.9％
溴甲酚紫 0.03％
EDTA 20mmol／dm3
4℃下存放。
（15）SephadexG-50的水化
SephadexG-50 10g
将 SephadexG-50溶于约 300ml TE（pH值 8．0）中，高压灭菌，4℃下存放。
（16）闪烁液（500ml）
无水乙醇 10ml
PPO 2g
PoPoP 50mg
二甲苯 490ml
室温棕色瓶存放。
10.2.3 操作步骤
10.2.3.1 基因组DNA的提取
（1）10ml全血与 40mlT10E10缓冲液混匀，4 000r／min离心10分钟。
（2）弃上清液，在沉淀中加入 40mlT10E10缓冲液混匀，4 000r／min离心 10分钟。
（3）弃上清液，在沉淀中加入 40mlTE缓冲液混匀，4 000r／min离心 10分钟。
（4）弃上清液，在沉淀中加入10mlUSSTE裂解液，混匀呈浊液，置摇床过夜，温度保持 在37℃。
（5）加入 10ml苯酚，缓慢上下混匀至少 20分钟，4 500r／min离心 20分钟。
（6）用移液枪小心地将上层水相转移到另一离心管中，吸头的尖端剪去一小段，以免在 吸取过程中损伤大分子DNA。
（7）向水相中加入等体积的酚、氯仿、异戊醇（体积比为24:23:1），缓慢上下混匀15 分钟，4 500r／min离心20分钟。
（8）如前述吸出水相，向水相中加入等体积的氯仿、异戊醇（23:1），上下缓慢混合10 分钟，4 500r／min离心 20分钟。
（9）吸出水相，向水相中加入2倍体积的预冷（—20℃）无水乙醇，盖紧管盖，上下颠 倒即可看见白色絮状DNA。
第10章 DNA指纹图谱分析方法 125
（10）小心将絮状DNA吸（吸头尖端剪去一小段，端部必须光滑）至1 .5ml离心管中，加 入 1ml 70％的乙醇，来回颠倒数次离心管，10 000r／min离心 2～5分钟。
（11）小心地倒掉管中乙醇，将管倒置在干净的吸水纸上，以让乙醇流尽。
（12）将离心管正立，置45℃烘箱中烤20分钟左右，以便让乙醇完全挥发掉，如有条件， 可置于真空干燥器中抽气10分钟。
（13）取出离心管，视沉淀块的大小加入 100～200μl TE缓冲液，置55℃水浴中过夜，以 溶解 DNA。
（14）将溶解后的 DNA置于 4℃或—20℃下贮存。
10.2.3.2 基因组DNA的酶切
（1）每样酶切反应为：
10μg DNA
1.5ml（15u） 限制性内切酶
6μl 10倍 buffer
6μl 40mmol／dm3亚精胺
加双蒸水至体积为60μl，用吸头混匀。
（2）37℃水浴，保持6～8小时。
（3）取出酶切样品置于4℃下。
10.2.3.3 基因组DNA酶切情况检查
（1）从每个酶切样品中取出3μl 消化液，加入3μl 2倍BPB混匀后点样。
（2）用 0.8％琼脂糖凝胶（内含 0.5μg／ml EtBr）和 1倍TAE缓冲液进行电泳，电压为60V。
（3）1小时后，在紫外灯下检查酶切是否完全及各样品的DNA浓度是否一致，以确保每 个样品进行电泳时上样量一致。
（4）如果发现某个样品酶切不完全，则另外加入5μl左右的酶，在37℃条件下水浴保温6小时。
（5）已完全酶切的样品，加入1／10体积（6μl）的电泳上样缓冲液（10倍BPB），混匀后置4℃（短期）或—20℃（长期）保存。
10.2.3.4 大板凝胶的制备和电泳
（1）称取3.75g琼脂糖，将其倒入一个500ml容积的普通试剂瓶（透明度要高）中。用 蒸馏水将50倍TAE贮存液稀释成1倍TAE，量取375ml 1倍TAE加入瓶中，配制的凝胶浓度为 1.0％。
（2）盖上瓶盖，但不能旋得太紧。将瓶放入微波炉中加热，待琼脂糖完全熔化后，溶液 是透明的。
（3）取出瓶子放在55℃的水浴箱中，约30分钟后就能冷却至55℃。
（4）洗净并擦干制胶板（24cm ×22cm），用 2cm左右宽的透明胶布将制胶板的两个开口 端封牢，放置在水平台面上用水平仪调平。将样品梳（ 6mm × 3mm ）插入制胶板离最近开口 端 2cm位置。将冷却至55℃的凝胶摇匀，缓慢地倒入制胶板中央，如果有气泡出现，应用吸
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头将气泡吸掉，60分钟后，制胶板中的凝胶将完全凝固。
（5）将 50ml 50倍 TAE贮存液倒入电泳槽中，再加入 2 450ml蒸馏水与其混匀，电泳槽 也应置于水平台面上。
（6）将制胶板两端的透明胶布剥离，然后将制胶板放在电泳槽的中部，小心地拔出加样 梳，以免加样孔破裂。
（7）从 4℃冰箱中取出 DNA样品，另取两个离心管，各加入 12μl（1μg／8μl）的分子量标志物λDNA／EcoRⅠ＋Hind Ⅲ 及 1／10体积的（1.2μl）10倍 BPB，混匀。将 DNA样品及分子量标记物一起置于55℃水浴箱保温10分钟，取出后立即置于冰水混和物中，2～3分钟后点样，这样可防止粘性末端之间的粘接。
（8）加样时每个样品用一个吸头，以免交叉污染。吸出样品后应迅速插入加样孔中下部， 轻轻推出样品，在两端加样孔中各点入分子量标志物。
（9）盖上电泳槽盖，插上导线，在加样后5分钟接通电流，以留出时间使加样孔内的样 品通过扩散而均匀分布，将电压调至30V，电泳60小时。
10.2.3.5 Southern转移
（1）电泳结束后，将制胶板连同凝胶一起放在一个方形塑料盘中，倒入约350ml（浸没凝 胶）的 0.2mol／dm3HCl处理 25分钟，并每过约5分钟摇动一次。
（2）倒掉稀盐酸溶液，加入蒸馏水简单地洗涤一下凝胶，然后倒掉蒸馏水，加入约350ml 的变性液浸泡30分钟，间断性地摇动。
（3）倒掉变性液，加入350ml 0.5倍变性液浸泡 25分钟，间断性地摇动。
（4）将制胶板连同凝胶一起取出，将一块约28cm×19.5cm的玻璃板盖在凝胶上，极其小 心地将制胶板倒翻过来，这时玻璃板在下，凝胶在上，轻轻地滑出制胶板，将玻璃板连同其 上的凝胶放在水平的桌面上。
（5）将一张20cm×19cm的尼龙膜（注明样品排列方向及电泳方向）在0.5倍变性液中浸 湿，然后对齐凝胶小片段区域的顶端将尼龙膜铺在凝胶的表面，用一根玻璃棒从膜的表面推 过以赶走膜与凝胶之间的气泡，用墙纸刀切除掉凝胶的无用部分（未被尼龙膜覆盖住的部 分）。操作时应戴上手套或用镊子。
（6）将3张稍大于膜的滤纸（20cm×20cm）依次在 0.5倍变性液中浸湿，放置在膜上，每 放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。
（7）将一打（约4～5cm厚）已裁至滤纸大小的干吸水纸放在滤纸层上，再将一块玻璃板 放在吸水纸上，然后抓紧上下两块玻璃板迅速翻转放在水平桌面上，抽去凝胶上面的玻璃板。
（8）在凝胶的四周露出的滤纸及吸水纸上放上保鲜膜，以防止凝胶上下的滤纸直接接触。 然后将 5张稍大于凝胶的滤纸（20cm ×20cm）依次在 0.5倍变性液中浸湿，放置在膜上，每 放一张滤纸后都应用玻璃棒轻轻赶走气泡。
（9）用一层保鲜膜将整个转移装置围盖住，以防水分蒸发，将一块玻璃板压在顶部。
（10）持续转移3～4小时后，去掉上面的滤纸和凝胶，取下尼龙膜放在2倍SSC中浸泡 20分钟，间断性摇动，然后取出放在一张干净的滤纸上，置60℃烘箱中烘30分钟，使DNA
固定于尼龙膜上。
（11）将烤干的膜夹在两张干燥滤纸之间，置于室温下保存待用。
第10章 DNA指纹图谱分析方法 127
10.2.3.6 探针的标记
（1）将80ng探针DNA（体积＜30μl）倒进一个新的0.5ml离心管中，在沸水中煮5～10 分钟，取出，插入碎冰中。
（2）然后依次在试管中加入下列成分：10μl 5倍标记缓冲液（含随机引物），2μl BSA （10mg／ml），2μl dATP、dGTP、dTTP等量混合物（浓度为各 20μmol／dm3）；30μl灭菌蒸馏水，50μl（α-32P）dCTP（10μCi／μl，3 000Ci／mmol）（至浓度为 333nmol／dm3）；lμl Klenow 酶（3u／μl）；最后体积为 50μl。
（3）将全部试剂混匀后置37℃保温壶中保温6小时。
（4）加入等体积（50μl）的标记反应终止液终止反应。
10.2.3.7 未掺入核苷酸前体的除去
（1）取一0.5ml离心管，在管底部打一小孔，用玻璃棉塞住小孔，外套一个1.5ml离心管。
（2）向0.5ml的管中加满TE饱和的Sephadex G-50。
（3）3 000r／min离心 5秒钟，重新加满Sephadex G-50后再离心，直到 Sephadex G-50加满0.5ml 小管的3／4。
（4）将标记反应液加入 0.5ml管中，3 000r／min离心数秒钟。
（5）将1.5ml管中的液体（蓝色）移入另一1.5ml离心管中。
（6）向0.5ml管中加入 40μl TE，3 000r／min离心数秒钟。
（7）重复（5）、（6）步骤2～3次，直到凝胶中的紫色即将到达0.5ml管底部。
（8）将回收的探针置于4℃下待用。
10.2.3.8 探针放射性强度的测定
（1）取两个液闪瓶，各加2ml闪烁液。
（2）在其中一个液闪瓶内加入2μl原标记反应液。
（3）在另一个液闪瓶内加人2μl去除了未掺入核苷酸的回收液。
（4）将2个液闪瓶置于液闪仪中，测定其cpm。
10.2.3.9 Southern杂交
（1）将 25ml杂交液放入方形塑料盒中，于 55℃下预热。
（2）将待杂交的膜和杂交液一起放入水浴摇床中。
（3）在55℃下预杂交1.5小时左右。
（4）将放射性探针放在沸水中5分钟，取出后迅速插入冰水中。
（5）在杂交液中按5×105cpm／ml的浓度加入变性的探针。
（6）在55℃下杂交约15小时。
（7）将杂交液中的膜取出，放入1倍SSC溶液中于55℃下漂洗10分钟。
（8）倒去1倍SSC溶液，在55℃下用1倍SSC溶液及0.1 ％SDS洗脱液漂洗40分钟。
（9）倒去洗脱液，55℃下用新的1倍SSC溶液及0.l％SDS洗脱液漂洗30分钟。
128 遗传多样性研究的原理与方法
（10）将膜放入1倍SSC溶液中，于室温下漂洗10分钟。
（11）取出膜，平摊在洁净、干燥的滤纸上。
（12）当膜上无水珠、膜仍湿润时，用保鲜膜将膜包好准备压片。
10.2.3.10 放射自显影
（1）在暗室或微弱安全光条件下，打开X光曝光暗盒。
（2）放入一张增感屏，光滑面朝上。
（3）将膜放在增感屏上（膜与膜之间不能重叠）。
（4）置X光胶片于膜上。
（5）将另一张增感屏光滑面朝下放在X光胶片上。
（6）盖紧X光暗盒，置—70℃冰箱内曝光1～7天。
10.2.3.11 X光胶片的冲洗
（1）显影：将X光胶片从暗盒中取出，放入显影液中，间断性摇动数分钟。
（2）停显影：将X光胶片放入1.5％的冰醋酸溶液中漂洗数秒钟。
（3）定影：将X光胶片转入定影液中定影数分钟。
（4）冲洗：将定影完毕的X光胶片放在流水中冲洗20分钟，然后晾干。
10.2.3.12 放射性探针的除去
（1）将300～500ml蒸馏水煮沸。
（2）往蒸馏水中加SDS，至最终浓度0.l％。
（3）将放射自显影后的膜浸入其中。
（4）待冷却至室温时将膜取出、烘干，即可用于另一种探针的杂交。
10.3 DNA指纹数据处理
10.3.1 分析范围及标准
所有图带分析均在X光胶片上进行，所分析的图带大小范围为 2.0～23.0kb。胶片上那 些位置相同（即分子量相同）、显影强度基本一致的图带被看作是完全相同的带。将同一胶片 上的个体两两配对比较，找出相同的图带。在分析过程中，假定所有相同的带均来自同一位 点上的同一等位基因。
10.3.2 DNA指纹图谱的共有带率（Band-sharing，简称BS）
BS的计算公式为：
BS=2N AB／（N A ＋N B）
式中：N A指个体A的图带数，N B为个体B的图带数，N AB 指个体A和个体B共有的图 带数。
10.3.3 平均等位基因频率（q）及最低平均杂合率（Ht）
计算公式为：
第10章 DNA指纹图谱分析方法 129
q ＝l—（1—BS）1／2，Ht＝l—q
式中BS为共有带率。
10.3.4 两个个体具有完全相同的DNA指纹图谱的概率（P）
两个无关个体具有完全相同的DNA指纹图谱的概率为：P1 = （1—2BS＋2BS2 ）n／BS ；两个
同胞个体具有完全相同的DNA指纹图谱的概率为：P2 =［1—0．5q（1—q）2（4—q）］n／BS。
式中：n为个体的平均图带数，q为平均等位基因频率。
10.3.5 一个探针可能检测到的位点总数 （N）和可检测到的不同位点数（L ） 的估计
计算公式为：
N = ［（n —b）（n —b － 1）／2a十 1］／2；L ＝n －a —b 式中：n为可见带数，a为等位位点数，b为连锁位点数。
10.3.6 DNA指纹图带的家系遗传分析
根据孟德尔遗传规律，可以假定每一条只在一个亲本上存在的图带（杂合带），遗传给后 代的概率为0.5（小卫星位点之间没有连锁和突变）。一个亲本的所有杂合带在子代中出现的 次数符合二项式分布，对二项式分布进行适合性检验，即可判定这些杂合带是否符合孟德尔 遗传规律。
卡方的计算公式为：
X2 = ∑［（O—E）2／E］
式中：O为观察到的杂合带出现的次数，E为期望次数（二项式对应的每一项概率乘以总次数）。自由度df =N—l。
传递率的计算方法为亲本DNA指纹图谱中每一条带在所有后代中出现的次数与后代个体数之比的算术平均值。
种质资源DNA指纹图谱库
“种质资源DNA指纹图谱库”科研计划启动铁观音可做“亲子鉴定” 发布时间：2011-10-20 8:31:07 稿件来源：泉州网-泉州晚报 “市面上销售的安溪铁观音是否原产于安溪，做了‘亲子鉴定’就知道。”近日，记者获悉，针对漳州华安、浙江海宁等地茶园冒用铁观音品牌的情况，安溪本地茶企举起科技大旗，以DNA指纹图谱鉴定方式鉴别茶叶的原产地。 抢搭品牌便车 安溪铁观音、西湖龙井、祁门红茶、武夷岩茶……纵观中国十大名茶，每一个茶叶品种之前都要冠上特定的地名，可以说，只有特定的水土和气候条件才能够产出举世闻名的好茶。 安溪西坪铁观音茶叶研究所所长魏火连告诉记者，作为中国十大名茶之一，安溪铁观音以其独具的“香、韵”风靡全国，这让不少外地的茶企动起了“品牌”搭便车的念头。 据悉，漳州华安县本以盛产“清香型五季茶”闻名，可是近年来部分茶企频频使用铁观音对产品进行包装宣传；三明大田县部分茶企则将当地种植的茶叶冠以“安溪铁观音”之名进行销售；此外，福建漳平、贵州黎平等县、市也大量种植铁观音，其部分成品没有标明原产地，而是冠以“安溪铁观音”之名进行销售。 冲击本地茶企 “制茶是一件天时地利人和的事情，要有合适的气候和水土，更要有人工炒茶的技艺和经验。”国家级非物质文化遗产乌龙茶（铁观音）制作技艺代表性传承人魏月德告诉记者，安溪有将近三百年的铁观音制茶经验，这是外地无法复制的。因此，无论华安还是大田，即使两者有安溪相似的地理自然条件，但要做出和安溪一样品质的铁观音，实属不易。 “最怕的是，客商买到冒充安溪铁观音的茶叶后，认为安溪铁观音品质下降，不仅影响来年订单量，还损坏了安溪铁观音的品牌美誉度。”中国茶都茶叶交易市场的茶商吴女士告诉记者，大量外地茶叶的冲击还会导致安溪铁观音价格下跌，这对安溪本地的茶企来讲，是个不容忽视的危险信号。 查图谱辨真伪 “安溪铁观音品牌维权的难题在于如何鉴定茶叶是否原产于安溪。”魏火连告诉记者，铁观音茶产业让安溪近百万人口走上了致富的道路，经30年高速发展，如何保持茶产业的可持续发展，保护好安溪铁观音的品牌价值显得尤为重要。 针对这一情况，福建魏荫名茶有限公司联合福建农林大学茶学系设立了博士后工作站，启动了“铁观音种质资源DNA指纹图谱库”科研计划。 据福建农林大学茶学系主任孙威江教授介绍，利用DNA指纹图谱库检测相当于给茶叶做亲子鉴定，它能分辨安溪产和安溪以外产地生产的铁观音，甚至可分辨出“内安溪”和“外安溪”茶叶。随着图谱信息的完善，查出某批茶叶产自安溪哪个厂商的技术也将成为现实。 安溪县工商局相关科室的负责人告诉记者，该图谱库的研究与建立有利于安溪铁观音的原产地保
DNA指纹图谱分析实验
DNA指纹图谱分析实验 一. 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、?肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA?指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA 指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，?如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析；如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。
DNA指纹图谱
DNA指纹图谱实验 上课地点：化学楼120 上课时间：选课时 任课教师：薛闯办公地点：生化楼215 电话：84706308 课程要求： 预习实验内容，掌握实验目的及原理、仪器和试剂、实验步骤； 手写完成预习报告（实验名称、实验目的、实验原理、实验器材与试剂、实验方法与步骤），课堂检查预习报告情况。 自带U盘和尺子。 实验注意事项： 1、实验台上物品按实验室管理老师要求摆放整齐； 2、实验废物按实验室管理老师要求收集； 3、实验结束后，经老师检查后方可离开。 实验纪律： 1、按时上课 2、穿实验服（白大衣） 3、不许吃东西，课堂严禁大声喧哗 4、手机静音 实验成绩： 预习报告：20分 实验操作：40分 报告内容：结果和讨论40分
DNA指纹图谱实验 （指导教师：薛闯） 一．实验目的 1. 掌握DNA 指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA 片段的长度。 3. 掌握对DNA指纹数据进行基本统计分析方法。 二. DNA指纹图谱实验原理 1984 年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys 及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA 指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。由于DNA 指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA 指纹具有下述特点： 1. 高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA 图形的概率仅3×10-11 ；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10 -19。全世界人口约50 亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA 指纹的图形完全相同。 2. 稳定的遗传性：DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50 % 给子代。 3. 体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA 指纹图形完全一致。 DNA 指纹图谱法的基本操作：
DNA指纹的遗传分析
【实验结果】 1 电泳结果图： 图1：电泳结果图 说明：a.条带1-6是marker的条带。 b.条带7-9是基因D1S80的条带。 2 marker的标准曲线的制作： marker1标准带的相关曲线 图4：marker 1的标准曲线根据图4算出marker 2的相关数据： 离
度 所以可以估算出条带1’~6’的标准分子量大概为2400、1700、1000、700、400、200。 将这一组数据应用到实验结果中marker标准曲线的绘制上，显然会给实验结果带来很大的影响。但又不可避免。 marker标准条带的相关数据 图2 marker的标准曲线 3成员A、C、D的D1S80的计算： 根据marker的标准曲线知 表2： 4结果记录表：
表3：结果记录表 【实验分析及讨论】 A从图1可知小组成员里只有A、C、D有正常的条带，而且全是纯合体，而B、E、F并没有出现正确的条带，分析可能原因：a在取样时取得太少了，致使提取的DNA浓度过低，在该实验的PCR条件下30个循环不能得到正确的DNA分子拷贝。b取样不合适，可能在去口腔上皮时并没有在适合的位置取，导致取出来的并不是口腔上皮。c在操作过程中一些错误的步骤导致没有提出正确的DNA分子。 B图1中最下面的有一排亮亮的条带。据分析是PCR体系里引物的条带。但是我们可以发现与B、E、F相比，A、C、D对应的条带最亮最宽，说明引物的含量较多，但是偏偏 A、C、D有正确的条带。这似乎说不通，但是进一步的分析可以推测有以下两种原因：a在向Pcr小管里加入体系时，由于移液枪不准造成的加入体系不同，但这种概率较小。b在向胶孔加入样品时由于加入量不同造成的结果。这个显然比第一种出现的概率要大得多。 C原理中我们指出人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知29种不同的等位基因。但是我们的实验结果里D的拷贝数为13，却小于14，由于两者比较接近所以将D的拷贝数应该认为是14，而出现这种偏差的原因可能在于：a marker标准的分子量我们是用的周五晚上组的图估算出来的(如图3)，并不是说明书上标准的，所以marker的标准曲线与实际的可能有一定的差距，这样就会导致最后的结果也会有一定的差距。b在photoshop CS3软件测量距离时，并没有专业的分析距离的功能，而是利用相关功能读出来的，所以这可能会给结果带来很大的偏差。 D如果一个个体的两个D1S80等位基因之间相差一个重复，不可以用琼脂糖凝胶电泳检测。原因是在实验中我们用到的缓冲液是1*TAE，1.5%的琼脂糖。根据相关资料显示这种胶的的分辨率在80bp~4kb，而一个重复是16bp，所以我们不可以用琼脂糖凝胶电泳检测。 F用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有利弊：PCR方法简单，但不准确，还需要设计引物.RFLP 利用酶的特异性给为准确快速，缺点有RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制。RAPD利用随机的引物原理简单，快速，弊端有RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。 【结果与分析】 本次实验所选择的方法是D1S80指纹图谱分析的常用方法。人群中D1S80座位的杂合率约为86％。从理论上讲，可能存在435种不同的等位基因组合。利用D1S80座位两侧序列设计的引物（Kasai et al，1990），通过PCR反应，很容易确定特定个体的D1S80等位基因构成，纯合体只有一条DNA带，而杂合体有两条不同的DNA带。 1．将小组的电泳结果拍照，并把照片贴在实验报告上，对照片进行必要的说明，例如，相对分子质量的标记各片段的大小（bp）。 （见附图） 2．
DNA指纹图谱分析
DNA指纹图谱分析 一、实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 二. 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA）分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA?指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，
生物指纹图谱调研报告
中药生物指纹图谱调研报告 一、中药生物指纹图谱简介 中药生物指纹图谱（biological fingerprint of TCM）是利用基因组学和蛋白组学技术研究药材基因型特征和中药作用于特定生物细胞后引起基因和蛋白的表达的变化规律和作用机制，从分子水平上揭示中药、中药与生物的细胞作用后的基因与蛋白的表达特征，研究解决化学成分和药理作用、药效活性的相关性，是中药指纹图谱研究的一个重要方面和最高级阶段。主要包括中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱和中药材DNA指纹图谱[1]。 目前，由于宏观上中药作用靶点和作用机制的多样性及对基因作用的多样性，中药基因组学指纹图谱和蛋白质组学指纹图谱可反映中药制剂作用于某特定细胞或动物后所引起的基因或蛋白的特定构象的复杂变化情况。这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。这种指纹图谱不但包含了化学信息，也体现了和此相关的药效、临床疗效等生物医药信息，通过比较不同蛋白质、基因指纹图谱体现的不同药效结果，就可确定何种物质基础(化学成分群)是该中药制剂的最佳方式，而且为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供了一条可行之路[1]。目前，中药基因组学和蛋白质组学有关指纹图谱的研究工作正在开展。中药蛋白质组学及基因组学指纹图谱可从分子水平上丰富整个中药指纹图谱研究体系。无论是中成药二次开发，还是中药新药研究，都有一个关键问题需要解决--逐步在分子水平上研究解决化学成分(物质基础)和药理作用、药效活性的相关性。而其中，通过蛋白质组学的研究得到的蛋白质组学指纹图谱又具有很高的说服力。 中药材DNA指纹图谱多运用聚合酶链反应(PCR)从不同生物样品中人工合成DNA片段,这种DNA片段的大小、数目因不同生物而异,因而称之为DNA指纹图谱。由于DNA分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型,所以结果可不受环境因素、样品状态和材料来源等外界条件的影响,因此为中药品种鉴别中极为可靠的手段。随着分子生物学技术的发展,已有文献报道用DNA指纹图谱作为药材的鉴定方法.李晓波[2]等人的研究预示DNA指纹技术正在逐渐成为中药鉴定的一种新方法。DNA指纹图谱由于其特点，无法客观反映药用植物因外部环境影响基因表达造成的药效成分含量的差异，只能用于药材种质资源的考察。对于DNA指纹技术在中药材鉴定方面的推广和普及的关健是
DNA指纹技术及其应用
DNA指纹技术及其应用 周珊珊（浙大环科所，杭州310029） 摘要综合比较、分析了目前常DNA指纹技术，如RFLP、VNRT、RARP、AFLP、STS(SSR、CAPS、SCAR)、RFLP、SSCP、SNP等的原理、特点和适用范围，简要介绍了DNA指纹技术的研究发现状以及发展前景。 关键词DNA指纹技术；分子杂交；PCR技术；DNA芯片技术 前言 DNA指纹图谱是一种在单一实验中可检测出大量DNA位点差异性的分子生物学技术。1985年，Jeffreys及其合作者[1]分析了人的肌红蛋白基因，从中获得了多位点的小卫星探针。它可同时与众多的DNA限制性酶切电泳图谱杂交，可得到具多条带的复杂图谱。这种表现出高度的种属及个体特异性的杂交图谱即称为DNA指纹图谱(DNA fingerprint)。随着各种高水平探针如报卫星探针、寡聚核苷酸探针的相继问世，成为当今最先进的分子水平上的遗传标记系统。指纹图谱具有高度的变异性及多位点性，充分体现了物种的遗传多态性，使其在动植物科学研究、遗传疾病的诊断、基因图谱的绘制，遗传标记及法医学等方面得到广泛应用。本文将对几类主要的DNA指纹技术原理及特点做简要叙述，并进一步阐述其发展前景。 1．DNA指纹技术原理及特点 2.1 基于分子杂交技术的DNA指纹技术 2.1.1 限制性片断长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP） 某些DNA序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变反映出来，此即限制性片段长度多态性(RFLP)。1980年Botstein等[2]首先提出利用RFLP作为标记构建遗传图图谱。其主要原因是由于DNA序列个别碱基的突变而引起某个限制性内切酶识别位点的获得或丢失，表现为不同长度的酶切片段。 RFLP的等位基因具有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测的基因座位数为1～4个[3]。RFLP结合基因探针分析的最大优点是产生的带型清楚明确。这是因为相当大量的DNA被切割，电泳和染色后的DNA片段易于显示出来。相反，PCR产生的指纹(如AP－PCR或ERIC－PCR产生的指纹)很难以再现并可能“模糊的”或“假的”带，使其难以解释。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是
DNA指纹图谱技术
DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用pace等于1986年首次利用rrna基因确定环境样品中的微生物，通过对5s rrna基因的序列分析来研究微生物的生态和进化。该方法很快被用于微生物多样性研究领域。由于5s rrna基因相对较小，携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。相比之下，随后开展的16s rrna基因序列分析为微生物多样性研究提供了更多信息，且效率更高。目前16s rrna基因序列分析已广泛应用于微生物多样性的研究。16s rrna基因序列分析是主要基于已建立的微生物16s rrna基因序列数据库，用以确定细菌的系统发育关系，并使序列探针用于识别未知菌成为可能。当然序列探针的确定也可根据分子标记方法，如rapd方法进行。利用16s rrna基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略。目前一般常用以下几种方法。 一、变性梯度凝胶电泳（dgge）和温度梯度凝胶电泳（tgge ）1993年muyzer等将dgge技术引入环境微生物学多样性的研究。随后该技术被广泛用于比较不同生态系统中的微生物群落的多样 性及监测特定微生物种群的动态变化，dgge和tgge的原理是根据含有不同序列的dna片段（16s rrna基因扩增产物）在具有变性剂梯度或温度梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的 不同，部分解链的dna片段在凝胶中的迁移速率低于完全螺旋形式的dna分子，从而含有不同碱基序列的dna片段就得到有效分离。
结合pcr扩增标记基因或其转录物（rrna和mrna）的dgge方法能直接显示微生物群落中优势组成成分。由于它可同时对多个样品进行分析，使之非常适合研究微生物群落的时空变化，而且可以通过对酶切条带进行序列分析，或通过与独特的探针杂交鉴定群落组成，可以方便地了解环境被干扰后的微生物群落变化或某种指示微生物的命运。oliver等用dgge方法考察了农田微生物的变化情况，认为环境变化对农田微生物的多样性有很大影响。但是dgge/tgge 技术也存在一定的局限性。 其缺陷之一是只能分离约500 bp大小的dna片段，这限制了作为下一步用于杂交分析的探针设计。并且研究报道有些种类细菌16s rdna在dgge上不只显示1条带，而不同种细菌的16s rdna序列在dgge上也可能因为具有相同的解链行为而不能被分开。即便存在以上的一些局限性，dgge/tgge仍是分析微生物群落多样性较为敏感的方法之一。 二、单链构象多态性（sscp） sscp是对16s rrna基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方法。该技术最初用来检测人类dna的基因多态性，lee等在1996年首次报道将sscp技术应用到环境样品微生物群体多样性分析。不同碱基序列的单链dna分子构象不同，dna片段变性成单链后受到凝胶不同分子筛作用力最终使不同dna片段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而
DNA鉴定全过程
先上个度娘： 鉴定方法 DNA亲子鉴定的方法: 1．DNA指纹法 DNA指纹指具有完全个体特异的dna多态性，其个体识别能力足以与手指指纹相媲美，因而得名。可用来进行个人识别及亲权鉴定，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"。 由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记，可广泛用于亲自鉴定。 特点： 1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10^-11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10^-19。全世界人口约50亿，即 5×10^9。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，
DNA 指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50%给子代。3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 2．STR检测，短串联重复序列（short tandem repeat，STR）又称微卫星DNA（micro satellite DNA），是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。它由2~6碱基对构成核心序列，呈串联重复排列。STR基因位点长度一般在100～300 bp之间．因个体间DNA 片断长度或DNA序列差异而成高度多态性，在基因传递过程中遵循孟德尔共显性方式遗传。因其基因片段短、扩增效率高、判型准确等特点，被称作第二代DNA指纹，近几年亲子鉴定多采用该方法。 3.SNP-单核苷酸多态性 SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP 有关。 4 RFLP分析法。 限制图谱标记和可见表型重组频率是可测量的，将遗传图谱分为基因型和表型两种分子标