细胞增殖毒性实验步骤cck8知识讲解

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细胞增殖■毒性实验步骤

1、细胞传代、细胞计数、细胞增殖■毒性实验步骤：

实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、

15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复温实验所需试剂［细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS、胰酶

（0.25% Trypsin-EDT）胎牛血清（FBS、双抗］，所有的试剂、仪器放入生物安全

柜前要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1、倒去培养瓶内的培养液；

2）加入PBS 2ml洗涤培养瓶内细胞2次；

3）加入胰酶500ul/0.5ml 2?10min （具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脫落）；

4）加入含10%FBS勺培养液1?1?5ml ［培养液：胰酶二（2?3） :1］中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；

6）将单细胞悬液吸入10?15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，倒去上清

液；

7）加入含10%FBSffl胞培养液1?2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；

8）吸取20』细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；

CCK-8实验：

9）在96孔板中，给每孔加100卩L （约7000个）的细胞悬液，将培养板放在培养箱预培养

24-72小时（37 C, 5%CO2,使细胞贴壁；

10）向培养板中加入10卩L不同浓度（5、10、20、40、80、160ug/ml）的待测药物；

11 ）将培养板在培养箱孵育一段适当的时间24小时（例如：6、12、24或48小时）（药物起作用）；

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

12）向每孔加入10让（约10%） CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）；

13）将培养板在培养箱内孵育1?4小时（半小时测一次OD值）；14）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

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